神経前駆細胞由来ニューロンを用いた神経突起増殖アッセイと神経毒性評価

要約

提示されたプロトコルは、低分子化合物の神経突起成長アッセイおよび神経毒性評価のための方法を記述する。

要約

神経突起伸長アッセイおよび神経毒性評価は、本明細書において提示された方法を用いて行うことができる2つの主要な研究である。このプロトコルは、神経形態の信頼性の高い分析と、低分子化合物による治療時の神経突起長およびシナプスタンパク質の局在化および豊富さの修飾の定量的測定を提供します。神経突起伸長研究における提示方法の適用に加えて、神経毒性評価は、潜在的な発達神経毒性効果に基づいて市販の化学化合物を評価、区別、およびランク付けするために行うことができる。

細胞株は今日、神経科学における複合スクリーニングアッセイで広く使用されているが、それらはしばしばその組織起源とは遺伝的および表現的に異なる。一方、初等細胞は、生体内で観察される重要なマーカーおよび機能を維持する。したがって、これらの細胞が神経突起の成長アッセイや神経毒性評価を提供できる翻訳ポテンシャルと生理学的関連性のために、ヒト神経前駆細胞(hNPC)を一次ヒト細胞モデルとして使用することで大きな利益を得ることができます。

本明細書で提示される方法は、ヒトの神経前駆細胞由来ニューロンを利用して神経突起の伸びおよび神経毒性を誘導する化合物の能力をスクリーニングするために利用することができる、ヒト生物学を密接に表す細胞モデルである。

概要

神経突起増殖は、神経ネットワークと神経再生^11,22の形成の基礎となるプロセスである。損傷後、神経突起の成長は神経系の再生に重要な役割を果たす。神経突起伸長は、神経変性疾患および神経損傷の結果を増強する神経細胞再生活動を誘導する細胞外シグナル伝達の重要な要素でもある^{33、4、5、6。4,5,6}

様々な神経系統を産生する際の分化の可能性を維持することにより、ヒト神経前駆細胞(hNPC)は、中枢神経系(CNS)機能および開発^77、8、98の研究のためのモデルシステム^を9提供することができる。ヒト細胞モデルとしてのhNPCの高い翻訳ポテンシャルおよび生理学的関連性は、神経突起成長関連の創薬スクリーニングにおいてかなりの利点を提供する。しかし、高スループットアッセイ用のプライマリセルモデルのメンテナンスとスケーリングは、時間がかかり^{、10、11、12、1311,12,13}の労働集約的な可能性があります。¹⁰

神経突起伸長研究における提示方法の適用に加えて、神経毒性評価は、hNPC由来のニューロンを用いた別のアプリケーションである。検査されていないか、または十分に理解されていない神経毒性の可能性を持つ市販の化学化合物の数千があります。.したがって、より信頼性が高く、より効果的なスクリーニング実験は、発達神経毒性を引き起こす可能性に基づいて化合物を評価、区別、およびランク付けする、高い需要¹⁴である。環境中の未試験化合物の豊富と共に神経疾患の有病率および発生率の増加は、神経毒性を引き起こす可能性のある有害な環境化合物を同定するためのより信頼できる効率的な実験の開発を必要とする^15。

本明細書において提示される方法は、ヒトの神経前駆細胞由来ニューロンを利用して神経突起の伸長および神経毒性を誘導する化合物の能力をスクリーニングするために利用することができる、ヒト生物学を密接に表す細胞モデルである。

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プロトコル

倫理声明:胎児標本は、国立衛生研究所(NIH)が支援する組織分布プログラムを通じて、シアトルのワシントン大学の出生時欠損研究所から受け取られました。出生時欠損研究所は両親から適切な書面によるインフォームド・コンセントを得て、組織の調達はワシントン大学の機関審査委員会によって監視されました。すべての作業は、マイアミ大学⁸の人間の主題研究事務所の承認を得て行われました。

ヒト神経前駆細胞(hNPC)の分離と培養

1. 脳組織を100mmのペトリ皿に入れ、鉗子を使って慎重に髄を取り除きます。
2. 脳組織を50 mL円錐形チューブに移し、チューブを穏やかに反転させることで20mLのPBSで2回洗浄します。
3. 37°Cで10分間、細胞解離液(材料表を参照)とDNase I(10 U/mL)に組織を水没させることにより、新しい50 mL円錐形チューブに脳組織をインキュベートします。
4. チューブを含む脳組織に5mLの神経細胞培養培地(材料表を参照)を加え、1000 μLピペットチップを通して20~30回トリタシエートして単一細胞懸濁液を作り、神経球を機械的に解化します。
5. 70 μmの細胞ストレーナーを通して細胞懸濁液をフィルターし、細胞クラスターを除去します。
6. 表1に詳述した成分を添加した5〜10mLの神経細胞培養培地を備えたベントT-25フラスコに単細胞懸濁液をシードする。
   1. 0.2 μmフィルターを濾過してヘパリン溶液を殺菌します。ビタミンAを含まないB-27サプリメントは、分化を誘発することなく、神経前駆細胞および幹細胞の培養のための無血清サプリメントである。
      注:ヒト神経前駆細胞(hNPC)は、中絶された胎児から採取されたヒト胎児脳から単離される。培養で7~10日後、神経幹細胞(NSC)は自由浮遊神経圏コロニーを形成する一方、他の細胞型は単細胞として懸濁状態にとどまるか、フラスコの底部に付着する。分離されたhNPCは、数ヶ月間^の懸濁液中の神経球として培養することができます^8,16,,17.

量	コンポーネント
100 μL	EGF (20 ng/mL)
100 μL	FGF (10 ng/mL)
2 mL	B-27、マイナスビタミンA(50X)
1 mL	L-アラニル-L-グルタミン(100X)(材料表参照)
4 μL	ヘパリン(2 μg/mL)
96.8 mL	神経細胞培養培地(材料表参照)

表 1.100 mLの培養培地を製造するために必要なコンポーネント

2. hNPC のパスを渡す

1. 浮遊球、大小の神経球を含む媒体を収集し、50 mL円錐管に移します。
   注意:未知の理由により、神経球を分割するタイミングは7日から30日まで変動します。しかし、一般的に、神経球は直径700~900μmを超える場合に通過する必要があります。これは、神経圏の中心が暗くなり始めるときであり、これは細胞死率が高い兆候と考えられる^18.
2. 300-400 x gで遠心分離によって神経球を3分間回転させます。
3. 上清を慎重に吸引し、解凍した細胞解離試薬の500μLで球を水没させる(材料表を参照)。
   1. 1.5 mLマイクロチューブあたり500μLを加えて細胞解離試薬のアリコートを作り、-20°Cで保存してください。酵素活性を失わないように、37°Cの水/ビーズ浴中に5分間温めてRTまたは温かく保持して細胞解離試薬を解凍してください。
4. 球の密度と大きさに応じて、水没した球を37°Cで5〜15分間インキュベートします。
5. 50 mL円錐形チューブと遠心分離機を含む神経球に5〜10 mLの前温め培養培地を加え、5分間5分間g、神経球を沈殿させます。
6. 上清を吸引し、1000 μLピペットを使用して、すべての神経球が単一の細胞懸濁液になるまで2mLの培養培地で、上下に優しくピペットを吸引する。
   注:解離は肉眼で見えるようになります。解離の前に、神経球は球の形をしている。解離試薬に沈み込み、上下にピペット化することで、単一細胞になります。
   1. 細胞を数え、10mLの培養培地でT-25フラスコ当たり200万~300万個の細胞をプレートする。
7. 培養培地の半分を交換して3日ごとに細胞を供給する。
   1. フラスコを下隅に置くように傾いて神経球を落ち着かせる。フラスコを約1〜2分間、神経球沈着まで保持します。その後、セロロジカルピペットを上の培地に挿入して、培地の半分を穏やかに吸引する。解約細胞は、培養¹⁹において2〜3日後に凝集して球体を形成することができる。

3. hNPC の凍結

1. 培養培地にDMSOを加えて、培地にDMSOを加えて、10%(v/v)の最終濃度に調製するか、または、敏感な細胞タイプに対して市販の凍結保存培地を使用する(材料表を参照)。
2. 50 mL円錐形のチューブにメディアを転送し、重力によって球を落ち着かせることで、大きな球を選別します。次に、200または1000 μLピペットチップを使用して通過するための新しい50 mL円錐形チューブに大きな神経球を取り外して移します。
   注:直径が900μmを超える神経球は大きいと考えられ、直径が500μmより小さいものは小さいと考えられます。
3. 残りの神経球を3分間300~400xgで遠心分離して回転gさせる。
4. 1 mLの凍結保存試薬で最大100個の球体を再懸濁し、クライオチューブに移します。
5. 細胞凍結容器に-80°Cで一晩保管し(材料表を参照)、翌日液体窒素に移して長期保存します。
   注意:小~中規模の神経球(直径900μm未満)を凍結し、大きな大きさの神経球(直径900μm以上)や単一細胞の凍結を避けるのが好ましいです。サンプルの解凍中の細胞損傷を減らすために、解凍した神経球を小さなT25フラスコに播種して細胞を密に保つ。

4. hNPCの分化と治療

注:分化を誘導するために、神経球は単一細胞に分解され、計数され、コーティングされたプレートに5日間播種される。次いで、分化した細胞を、免疫染色および蛍光定量の前に試験化合物で24時間処理する。

1. コーティング
   1. 4ウェルガラスチャンバースライド(8ウェルチャンバースライドのウェルあたり140 μL)のウェルあたり200 μLのポリL-リジン(PLL)を加えます。
   2. 室温(RT)で1時間インキュベートする。
   3. PBSで3倍洗います。
   4. RTで乾燥させます(約30分間)。
   5. 4ウェルガラスチャンバースライド(8ウェルチャンバースライドのウェルあたり120 μL)のウェルあたり150 μLのラミニン(50 μg/mL)を加えます。
   6. 37°Cで2時間インキュベートする。
   7. PBSで3倍洗います。
      注:コーティングされた部屋のスライドは1ヶ月間4°Cで貯えることができる。
2. 細胞をめっきする
   1. 4ウェルチャンバースライド(8ウェルチャンバースライドのウェルあたり70,000細胞)のウェルあたり80,000個の単細胞神経球(単一細胞懸濁液中の神経球)を数え、プレートします。
   2. 4ウェルチャンバースライド(8ウェルチャンバースライドのウェルあたり250 μLメディア)のウェルごとに500 μLの分化培地を追加します。
      1. 分化メディアを最初に作成するには、表 2の次のコンポーネントを無菌で使い捨て可能なコンテナーに追加して、神経誘導媒体 (NIM) を作成します。
      2. 表3の下記の成分を、前のステップで作ったNIMの48.5mLに加えて、分化媒体を作ります。
   3. 37°Cで5日間インキュベートする。
   4. 5日後、各ウェルの培地の半分を、適切な対照を含む試験化合物の所望の濃度と混合した新鮮な培地で置換することによって、細胞を24時間処理する。

量	コンポーネント
49 mL	DMEM/F-12
0.5 mL	N2 サプリメント (100X)
0.5 mL	MEM 非必須アミノ酸 (100X)
2 μL	ヘパリン(2 μg/mL)(ストックコンクは50mg/mL)

表 2.. NIM の50 mL を作るのに必要なコンポーネント

量	コンポーネント
1 mL	B-27 (50X)
500 μL	抗生物質抗抗抗抗薬(100X)
5 μL	レチノイン酸 (0.1 μM)
50 μL	GDNF (10 μg/mL)
50 μL	BDNF (10 μg/mL)
5 μL	アスコルビン酸(0.2 μg/mL)(ストックコンクは2mg /mL)注:新鮮にすることをお勧めします。
48.5 mL	Nim

表 3.50 mLの分化媒体を作るのに必要なコンポーネント

5. 免疫細胞化学(ICC)

注:細胞は4%ホルムアルデヒドで固定されています。パーメアビレーションおよびブロッキングは、次いで浸透を改善し、抗体の非特異的結合を防ぐために行われる。その後、細胞は一次抗体と一晩インキュベートされます。続いて、細胞は蛍光標識二次抗体でインキュベートされる。最後に、核を染色するためにDAPIを使用した後、チャンバースライドが取り付けられる。

1. 固定
   1. 各井戸のメディアを優しく吸引します。
   2. 4ウェルチャンバースライドのウェルあたり4%ホルムアルデヒドの500 μLを追加します(8ウェルチャンバースライドのウェルあたり250 μL)。
   3. RTで15分間インキュベートします。
   4. PBSを500 μLで2倍軽く洗います。
      注:固定後、各ウェルに1mLのPBSを残すことで、培養スライドを4°Cで最大3ヶ月間保存することができます。
2. 細胞の透過性およびブロッキング
   1. 表4の以下の成分を無菌で使い捨て容器に加えて、抗体(Ab)バッファーを作ります。
   2. 表5の以下の成分を、前のステップで作られたAbバッファと混合して、細胞透過化およびブロッキング溶液を作ります。
   3. 4ウェルチャンバースライドのウェルあたり500 μLを追加し、RTで1時間インキュベートします。
      注:Abバッファーは4°Cで保存することができます。

量	コンポーネント
1.75グラム	ナクル (150 mM)
1.2 g	トリスベース (50 mM)
2 g	BSA 1%
3.6 g	L-リジン (100 mM)
8 g	アジドナトリウム (4%)
200 mL	蒸留水。注:最初に必要な成分を150 mLの水に溶かし、200 mLに調整してください。

表 4.抗体バッファーの 200 mL を作るのに必要なコンポーネント

量	コンポーネント
600 μL	20% ヤギ血清
6 μL	0.2% トリトン-X100
2394 μL	抗体バッファー。注:最初にAbバッファの2 mLに必要なコンポーネントを溶解し、pH 7.4に調整します。その後、3 mLの最終容積に調整し、滅菌フィルタに、さらにAbバッファを追加します。

表 5.3 mLの細胞透過化およびブロッキング溶液を作るのに必要なコンポーネント

3. 染色
   1. 500 μL の PBS で 2 倍洗浄します。
   2. 希釈した一次抗体、抗β-チューブリンIII(1:200)を加え、4ウェルチャンバースライドのウェルあたり200μL(200 μL)で一晩インキュベートします。PBSで一次抗体を希釈します。
   3. PBSで2倍洗います。
   4. 希釈した2次抗体、Alexa Fluor 488(1:500)を加え、光から保護された場所でRTで2時間インキュベートします(4ウェルチャンバースライドのウェルあたり250 μL)
   5. PBSで2倍洗います。
   6. 希釈したDAPI(300 nM濃度)を加え、光から保護された場所(4ウェルチャンバースライドのウェルあたり300 μL)でRTで5分間インキュベートします。
   7. PBSで3倍洗います。
   8. 次の手順に従って、チャンバースライドを取り付けます。
      1. 離脱タブを壊し、ガスケットとベースを取り除くことによって、チャンバースライドを分解します。
      2. 4ウェルチャンバースライドのウェルごとに、取り付け溶液の1滴を追加します(材料表を参照)。次に、スライド全体をカバーするためにカバースライドを使用します。
      3. トゥイーザーを使用し、斜めで、カバースリップの片側をスライドに対して置き、液体の落下の外縁に接触させます。
      4. カバースリップを所定の位置に下げる際には、慎重に取り付け溶液にチップを付けます。バブルの作成を避けます。ピペットの先端を取り、カバースリップに押し下げます。泡が横に移動します。
         注:バブル形成は避けられない場合があります。それが発生した場合は、それらの周りの画像がいくつかある限り。
      5. 製造時間については、メーカーの指示に従ってください。イメージング時の取り扱いが困難なため、非硬化型取り付けソリューションの使用は避けてください。それ以外の場合は、画像化中にカバースリップが滑るのを防ぐために、エッジに適切なカバースリップシーラントを使用する必要があります。
      6. カバースリップを密封するには、マニキュアを使用し、カバースリップの端に小さな線を作ります。マニキュアを2分ほど乾かします。

6. 画像取得、神経突起伸長、蛍光強度定量

注:染色後、20xの目的と1024 x 1024ピクセルの画像サイズを持つ共焦点顕微鏡を使用して、処理された細胞の画像を取得します。条件ごとに生物学的複製ごとに少なくとも2つのフィールドから画像を撮ります。次に、フィジー画像解析ソフトウェア(ImageJ 1.51u)を使用して、神経突起の長さを定量化します。簡単に言えば、各ニューロンの最も長い神経突起の長さを測定し、治療ごとの値を平均した後、独立したグループのための学生のt検定を使用して、実験群と対照群の間の平均を比較する。

注:いくつかの商業(イマリス、ボロシティ、アミラ)とオープンソース(ImajeJ、セルプロファイル、Vaa3D、BioImageXD、アイシー、KNIME)画像処理プログラムが利用可能です。これらのプログラムの中で、ImageJは生物学的画像解析^20,21,21のための選択のツールとなっている。https://imagej.net/Introductionの ImageJ ポータルは、ImageJ の基本的な説明や、画像処理、共局在化、デコンボリューション、登録、セグメンテーション、トラッキング、視覚化などの組み込み関数を提供する有用な情報源です。

1. フィジー画像解析ソフトウェアを用いて神経細胞の成長を測定する
   1. 図 1に示すように、フィジーのソフトウェアにドラッグ アンド ドロップするか、または [ファイル ] を選択してイメージを開くを開きます。
   2. 分析を選択 |ツール |ROI マネージャをクリックし、ツールバー Straight の 5^番目のアイコンを右クリックし、フリーハンド ラインに切り替えます。必要に応じて、同じアイコンをダブルクリックして線幅を 10 に変更し、セル本体の近くから neurite の先端まで延長する最長の neurite をトレースします。
   3. Ctrl + Tキーを押してからFキーを押して、測定を ROI マネージャに追加し、測定したニューロンをハイライト表示します。ROIですべての数値を選択し、[測定] をクリックし、計算された長さをすべて選択し、スプレッドシートにコピー/貼り付けます。
2. フィジー画像解析ソフトを用いた標識細胞の蛍光強度測定
   1. 図 2に示すように、イメージを開いた後、ツールバーの4^番目のアイコンをクリックしてください。セルの形状を描画します。
   2. 分析を選択 |[測定値]を設定し、次の値を選択します:面積、統合密度、平均グレー値 |分析 |メジャー (値のスタックを含むポップアップ ボックスが開きます)。
   3. セルの横にある領域を背景として選択し (サイズは重要ではありません)、[分析] を選択します。測定します。測定データをすべて選択し、スプレッドシートにコピー/ペーストします。
      注:統合密度(IntDen)は、蛍光強度を決定するために使用される項目です。本研究では、標的分子の蛍光強度を測定し、細胞内のその分布を最初に分析し、その後、様々な治療下で標的分子の存在量を定量化する。その結果、治療の有効性を測定し、コントロールと比較します。

7. 神経毒性評価

注:試験化合物の細胞毒性は、発光細胞生存アッセイを用いて384ウェルプレート(材料表を参照)で評価されます(材料表を参照)。hNPCは、若干の変更を除いて、同じ方法に従って調製される「hNPCの分化および治療」セクションで説明されています。続いて、発光細胞生存アッセイにより生成された発光信号をマイクロプレートリーダーを利用して測定する。発光シグナルは、それ自体が各ウェルに存在する生存細胞の数に直接比例する細胞ATP濃度に比例する。

1. コーティング
   1. 384ウェルプレートのウェルあたり30μLのポリL-リジン(PLL)を加えます。
   2. RTで1時間インキュベートします。
   3. PBSで2倍洗います。
   4. RTで乾燥させます(約30分間)。
   5. 384ウェルプレートのウェルあたり30μLのラミニン(50 μg/mL)を加えます。
   6. 37°Cで2時間インキュベートする。
   7. PBSで2倍洗います。
      注:コーティングされた384ウェルプレートは、4°Cで1ヶ月間保存することができます。
2. 細胞をめっきする
   1. 25 μLの分化媒体の384ウェルプレートのウェルあたり20,000個の単細胞神経球を数え、プレートする。
   2. 37°Cで5日間インキュベートする。
   3. 5日後、最終的に望ましい濃度を5μLの体積で6倍にして調製した試験化合物で24時間細胞を処理します(ウェルあたり30μLの最終体積を作ります)。
3. 細胞生存アッセイ
   1. 384ウェルプレートのウェルあたり30μLの発光細胞生存率アッセイ試薬を加えます。
      注:各ウェルに存在する体積と等しい発光細胞生存率アッセイ試薬の量を追加します。発光細胞生存アッセイ試薬を解凍し、使用前にRTに平衡化する。
   2. プレートシェーカーで2分間振ります(細胞のライシスを混ぜて誘導します)。
   3. 300-400 x gで遠心分離して混合物を30 s回転させます。
   4. 光から保護された場所でRTで10分間(発光信号を安定化させるために)384ウェルプレートをインキュベートします。
   5. マイクロプレートリーダーで発光を記録します。
      注: 正の値として(最終濃度10μMの)VelcadeとDMSOを含むHBSS(0.1%または0.2%の最終濃度)を含む生存アッセイに適切な制御を使用してください。負のコントロールとして。

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結果

原稿に記載されているプロトコルは、最近発表された^22、23,23の論文でうまく使われています。図3は、低分子化合物の神経突起の伸びとそれに続く神経形成能力のマーカーとしてのエピジェネティック化合物としてのHDAC阻害剤の効果を調べるhNPC由来ニューロンの使用を示す。

さらに、図4<...

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ディスカッション

このプロトコルは、試験化合物による処理時の神経突起長の試験について説明する数少ない公表された論文の1つである。さらに、神経突起の成長アッセイや神経毒性評価にhNPCを用いる方法について述べています。hNPC由来ニューロンに対するこの神経突起伸長アッセイおよび神経毒性評価を利用することにより、エピジェネティックな低分子化合物のカテゴリーの神経因性ポテンシャル、HDAC...

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資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
4-well Glass Chamber Slides	Sigma	PEZGS0816
Alexa Fluor 488	Invitrogen	A-11001
Alexa Fluor 594	Invitrogen	R37117
Antibiotic-Antimycotic	Gibco	15240062
Anti-β-Tubulin III	Thermo	MA1-118X
B27	Thermo	17504001
B27 - minus vitamin A	Thermo	12587010
BDNF	PeproTech	450-02
BSA	Sigma	A8531
CellTiter-Glo	Promega	G7572
CoolCell	Corning	432000	Cell freezing containers ensuring standardized controlled-rate -1°C/minute cell freezing in a -80°C freezer
CryoStor CS10	StemCell Technologies	7930	Cryopreservation medium containing 10% DMSO
DAPI	Thermo	D1306
DMEM/F12	Gibco	11320033
DMSO	Sigma	34869-100ML
EGF	Gibco	PHG0311
FGF	Gibco	PHG6015
Formaldehyde	Thermo	FB002
GDNF	PeproTech	450-10
Glutamax	Gibco	35050061	L-alanyl-L-glutamine supplement
Goat Serum	Thermo	50062Z
Heparin	Calbiochem	375095
Laminin	Sigma	L2020-1MG
L-Ascorbic Acid	Sigma	A92902-25G
L-lysine	Sigma	L5501
MEM non-essential amino acids	Gibco	11140050
mFreSR	StemCell Technologies	5854	Serum-free cryopreservation medium designed for the cryopreservation of human embryonic and induced pluripotent stem cells
N2	Gibco	17502048
NaCl	Sigma	71376
Neurobasal Medium	Gibco	21103049
Nunc 384-Well Polystyrene White Microplates	Thermo	164610
PBS	Thermo	10010-049
Poly-L-lysine	Sigma	P5899-5MG
ProLong Gold Antifade Mountant	Thermo	P10144
Retinoic Acid	Sigma	R2625
Sodium Azide	Sigma	S2002
StemPro Accutase	Gibco	A1110501	Cell dissociation reagent containing proteolytic and collagenolytic enzymes
Synaptophysin	Thermo	MA5-14532
Tris Base	Sigma	10708976001
Triton X-100	Sigma	X100-100ML