ペプチド生合成酵素を調べた水素重水素交換質量分析(HDX-MS)プラットフォーム

要約

ランチペプチド合成酵素は、ペプチド天然物の生合成中に多段階反応を触媒する。ここでは、ランチペプチド合成酵素の立体ダイナミクス、ならびにペプチド天然物生合成に関与する他の同様の酵素を研究するために使用できる、連続的なボトムアップ、水素重水素交換質量分析(HDX-MS)ワークフローについて述べています。

要約

水素重水素交換質量分析(HDX-MS)は、酵素の立体構造変化と酵素基質相互作用の生物物理特性解析に対する強力な方法です。その多くの利点の中で、HDX-MSは少量の材料しか消費せず、酵素/基質標識を必要とせずに近い天然条件下で行うことができるので、大きな酵素および多タンパク質複合体に対しても酵素立体構造ダイナミクスに関する空間的に解決された情報を提供することができます。この方法は_、D2Oで調製した緩衝液への目的の酵素の希釈によって開始される。これは、重水素(N-D)とのペプチド結合アミド(N-H)中のプロチウムの交換を引き起こす。所望の交換時点で、反応アリコートがクエンチされ、酵素がペプチドにタンパク質化され、ペプチドが超高性能液体クロマトグラフィー(UPLC)によって分離され、各ペプチドの質量の変化(重水素に対する水素交換による)がMSによって記録される。各ペプチドによる重水素の取り込みの量は、そのペプチドの局所水素結合環境に強く依存する。酵素交換重水素の非常に動的な領域に存在するペプチドは非常に迅速に存在するのに対し、整然とした領域に由来するペプチドは、はるかにゆっくりと交換を受ける。このようにして、HDXレートは局所的な酵素立体構造ダイナミクスについて報告する。異なるリガンドの存在下で重水素の取り込みレベルへの摂動は、リガンド結合部位をマッピングし、アロステリックネットワークを同定し、酵素機能における立体構造ダイナミクスの役割を理解するために使用することができる。ここでは、ランチペプチドと呼ばれるペプチド天然物の生合成をより深く理解するためにHDX-MSを使用した方法を説明します。ランチペプチドは、従来の構造生物学のアプローチでは研究が困難な大規模で多機能な構造動的酵素によって翻訳後に修飾される遺伝的にコードされたペプチドです。HDX-MSは、これらのタイプの酵素の機械特性を調査するための理想的で適応可能なプラットフォームを提供します。

概要

タンパク質は、フェムト秒スケールの結合振動から、何秒間にわたって起こり得るタンパク質ドメイン全体の再配置に至るまで、時間スケールで異なる立体構造をサンプリングする構造的に動的な分子^{である1。}これらの立体構造変動は、しばしば酵素/タンパク質機能の重要な側面です。例えば、リガンド結合によって誘導される立体構造変化は、触媒に必要な活性部位残基を組織し、連続的な運動機構で基質結合部位を定義し、反応性中間体を環境から遮蔽するか、またはアロステリックネットワークを介して酵素機能を調節することによって、酵素機能を調節するために非常に重要である。最近の研究では、立体構造ダイナミクスは進化を通して保存することができ、保存された分子運動への摂動は基質特異性の変化および新しい酵素機能の出現と相関することができることを示している^2,3。

近年、水素-重水素交換質量分析(HDX-MS)は、リガンド結合や変異形成などの摂動にタンパク質の立体構造の景観がどのように応答するかを調査する強力な技術として急速に^{出現している}4、5、6、7。典型的なHDX-MS実験(図1)では、目的のタンパク質を_D2Oで調製したバッファーに入れ、溶媒交換可能なプロトンを重水素に置換する。ペプチド結合のアミド部分の交換速度は、pH、局所アミノ酸配列、およびアミド⁸の局所構造環境に強く依存する。水素結合相互作用に関与しているアミド(αヘリックスやβシートに存在するものなど)は、バルク溶媒にさらされているタンパク質の非構造化領域のアミドよりもゆっくりと交換します。したがって、重水素の取り込みの程度は、酵素の構造の反映である。立体構造が動的な酵素、またはリガンド結合時に構造的な転移を起す酵素は、測定可能なHDX応答をもたらすと予想されるであろう。

構造化アミドの遅い為替レートの機械化基準を図2^5,8,9に示します。HDXを受けるためには、特定の酸/塩基化学機構を介してHDX交換を触媒する溶媒分子が交換可能なアミドにアクセスできるように、まず一時的に展開された立体構造をサンプリングする必要があります。最終的に、化学為替レート_(kchem)と折り畳み速度(k_オープンおよびk_クローズ)の相対マグニチュードは^、実験5,8で測定されたHDXレートを決定する。この単純な運動モデルから、重水素取り込みの程度が基礎となる立体ダイナミクス(k_openとk _close)を反映することは明らかです。ほとんどのHDX-MS実験は、交換反応に続いて、目的のタンパク質がペプチドに消化され、各ペプチドによる重水素取り込みが質量⁷の増加として測定されるボトムアップワークフローで行われる。このように、HDX-MSは、酵素立体構造ダイナミクスへの摂動をペプチドの局所空間スケールにマッピングすることを可能にし、摂動が目的の酵素の異なる領域のダイナミクスをどのように変化させるかを評価することを可能にする。

タンパク質構造力学を解明するためのHDX-MSアプローチの利点は数多くあります。まず、この方法は、第四級構造¹⁰の系において少量の天然タンパク質またはタンパク質複合体に対して実施することができる。ボトムアップHDX-MSワークフローが目的のタンパク質配列をカバーする十分な数の確実に同定されたペプチドを提供する限り、アッセイに使用される酵素調製物が高度に精製される^11,12である必要さえありません。さらに、HDX-MSは、単一分子蛍光研究¹³で用いられるような部位特異的タンパク質標識を必要とせずに、近い在来条件下での立体構造ダイナミクスに関する情報を提供することができ、また、調査できるタンパク質またはタンパク質複合体(核磁気共鳴[NMR]分光法などのアプローチを困難にする)にサイズ制限^はない。最後に、時間分解HDX-MS法は、X線結晶学^{15、16、17、18}で研究することが困難である本質的に障害を持つタンパク質を研究するために使用することができる。HDX-MSの主な制限は、データが低い構造分解能であるということです。HDX-MSデータは、立体ダイナミクスが変化している場所を指し示し、結合された立体構造の変化を明らかにするのに役立ちますが、観察された変化を駆動する正確な分子メカニズムに関する多くの洞察を提供することはあまりありません。電子捕獲解離法とタンパク質HDX-MSデータの組み合わせにおける最近の進歩は、交換部位を単一アミノ酸残基¹⁹にマッピングする約束を示しているが、HDX-MSデータによって転送される構造モデルを明確にするために、生化学的および構造的研究をフォローアップすることが依然としてしばしば必要である。

以下、HDX-MSアッセイの開発のための詳細なプロトコルが²⁰を提示される。以下に示すサンプル調製プロトコルは、一般的に、水性バッファーに良好な溶解性を示す任意のタンパク質に適用できる必要があります。より特殊なサンプル調製方法およびHDX-MSワークフローは、洗浄剤またはリン脂質^{21、22、23、24}の存在下でのアッセイが必要以上にタンパク質に対して利用可能である。HDX-MS データ収集のインストゥルメンタル設定は、液体クロマトグラフィー システムに結合された高分解能の四重極時間質量分析計について説明されています。同様の複雑性と分解能のデータは、市販の液体クロマトグラフィー質量分析(LC-MS)システムの中から収集できます。市販のソフトウェアパッケージを用いたデータ処理の重要な側面も提供される。また、より広範な HDX-MS コミュニティ¹²の推奨事項と一致するデータ収集と分析のガイドラインも示します。本記載のプロトコルは、HalM2の動的構造特性を研究するために用いられる、抗菌ペプチド天然物²⁰の多段階成熟を触媒するランチペプチド合成酵素である。我々は、HDX-MSを用いて、これまでの特徴付けが排除された基質結合部位およびアロステリック特性を明らかにする方法を示す。タンパク質HDX-MSに関する他のいくつかのプロトコルが近年^25,26で公開されている。現在の作業と共に、これらの以前の貢献は、読者に実験計画のいくつかの柔軟性を提供する必要があります。

プロトコル

1. 重質試薬および酵素ストック溶液の調製

1. D2 O(99.9%原子画分D)で100-200x濃縮ストック溶液としてHDX反応(バッファー、塩、基質、リガンドなどを含む)に必要な試薬を調製します。バッファーストック溶液の少なくとも 50 mL を準備します。
   注意:HalM2の特性評価のために、次のソリューションを用意しました:500 mMMgCl 2、100 mMトリス(2-カルボクセチル)ホスフィン(TCEP)、750 mM ATP(HEPESバッファ)、800 mM HEPES pD 7.1、500 μM HalA2、および500mNPM AMPP.
2. 在庫液を凍結し、乾燥に乾燥させます。
3. _D2Oに再溶解し、再乾燥サイクルを少なくとも1回繰り返して、交換可能なプロトンの多くをできるだけ多くのデュテロンに置き換える。
4. 重水素化HEPESバッファストックのpDを、集中NaOD/DClで所望の値に調整し、次の関係を念頭に置いて²⁷:
   
   注:アミドHDXレートは、溶液のpL(pL = pHまたはpD)5に強く依存しています。実験間のわずかなpLドリフトを避けるために、バッファーストックソリューションの異なるバッチを同じ方法で準備、保存、使用する必要があります。
5. 300 μL HDX アッセイに必要な各試薬の量を計算し、-80 °Cで単一使用アリコートとして保存します。
6. 遠心フィルター(表)または同等のデバイスを使用して、プロティア化酵素貯蔵バッファーに濃縮酵素ストック溶液(約100-200 μM)を調製します。
   注:正確な緩衝液と遠心フィルターの分子量カットオフは、目的のタンパク質/酵素に依存します。HalM2は、50 mM HEPES、pH 7.5、100 mM KCl、および10%グリセロールに保存されています。10 kDaフィルターを用いて濃縮酵素を調製した。
7. 酵素を単一使用部分にアリコートし、-80°Cで保存する。
   注: これは停止点になる場合があります。セクション1に記載されているすべてのストックソリューションは、HDX反応の前に準備することができます。-80 °Cで保存すると、ほとんどの酵素/重水素ストック溶液は、何ヶ月もの間安定しています。

2. HDXクエンチボリュームのキャリブレーション

1. 第1項で調製した重水素化試薬および濃縮酵素ストックを用いて_、D2Oで300μLのHDX反応を調製します。
   1. 1-5 μMの最終酵素濃度を使用してください。
   2. 50-100 mM以上の最終的な重水素化HEPESバッファ濃度を使用してください。
   3. 他の成分の濃度が、所望の酵素活性/機能を維持するのに十分であることを確認してください。
2. 1 L の HDX クエンチ溶液 (100 mM リン酸、0.8 M グアニジン-HCl、pH 1.9) を準備します。凍結し、50 mLの部分(長期在庫用)と1 mLの部分(単一の使用アリコートの場合)の両方で保存します。
   注:クエンチバッファーの正確な組成は、ボトムアップHDX-MSワークフロー(ステップ3.3.3)のタンパク質分解工程で使用される酵素によって異なります。ここで与えられたクエンチバッファーは、HDX-MSの最も一般的に使用されるプロテアーゼであるペプシンと互換性があります。別のプロテアーゼを使用する場合は、プロテアーゼサプライヤーに確認して、バッファーの相溶性を確認してください。
3. クエンチHDX反応混合物の最終的なpLを2.3のpHメーター読み取り値に調整するために必要なクエンチバッファの量を調整します。
   注:ペプチドアミドN-H結合の溶媒H/D交換速度は、酸触媒と塩基触媒の両方に影響されるpH依存性プロセスです。最小為替レートは、pH 2.5(pHメーターの読み取り値 = 50:50 H 2_O:D2 O混合物の場合は_2.3)の値で発生します。したがって、2.5付近の最終的なpL値は、ボトムアップLC-MS分析中に生じる水素バック交換を最小限に抑え、それによってペプチド内の重水素標識を保存する。
   1. ステップ2.1のHDX反応混合物の50 μLと50 μLのクエンチバッファーを混合し、マイクロチップ電極でクエンチ混合液のpLを測定します。
   2. 必要に応じてクエンチ溶液の体積を増やし、最終的なpHメーターの読み取り値を2.3に調整します。
   3. 適切なクエンチ量が決定されたら、HDX反応(ステップ2.1)の新鮮な50 μLアリコートを使用して数回クエンチプロセスを繰り返し、固定量のクエンチバッファを追加した際に一貫した最終pLが達成されるようにします。

3. ボトムアップLC-MSワークフローの参考サンプルの作成と最適化

1. 0.5 mLチューブ内の三重化に関心のあるタンパク質のための未解製の参考サンプルを準備します。最終反応混合物条件が本物のHDX反応(ステップ2.1)で使用されるものと同一であることを確認し、反応_は、H2Oでも調製した試薬ストック溶液を用いて_H2Oで調製されることを除いて。
2. ステップ 2.3 のように、適切な量のクエンチバッファーを追加して、最終的な pH を 2.5 に調整して、サンプルをクエンチします。フラッシュは液体窒素でサンプルを凍結し、分析の準備ができるまで-80 °Cで保管します。
3. ボトムアップ LC-MS ワークフローを使用して、プロティアード酵素参照サンプルを分析します。
   注: これらの手順を実行する前に、データ収集に使用する LC-MS システムは適切に調整され、使用できる状態にしておく必要があります。ボトムアップ LC-MS ワークフローのすべてのステップのタイミングと温度は、サンプル間のバック交換の違いを最小限に抑えるために厳密に制御する必要があります。このプロトコルで使用される MS インストルメンテーション (資料表 そして サポート情報)、ほとんどのステップは計測器ソフトウェアを通して制御できます。正確な複製の収集を確実に行うために、ワークフローの手順をできるだけ多く自動化することをお勧めします。
   1. 冷凍庫から個々の酵素参照サンプル(ステップ3.2のように調製)を取り出し、水浴中で1分間37°Cで解凍します。
   2. 冷凍庫からサンプルを取り出して解凍した後、正確に2分で、クエンチされた参照サンプルの40 μL部分を、ペプシン(酸安定プロテアーゼ)で機能する定常相を含む超高性能液体クロマトグラフィー(UPLC)カラム(2.1 x 30 mm、300 Å、5 μM)に注入します。
   3. H2O(pH = 2.5)の0.1%のギ酸を溶媒として使用して、15°Cで3分間100μL/minの流量でサンプルを消化します。
   4. ペプシンカラムから0.4°Cに保持されたC18トラップカラムに溶出して、ペプチドペプチドを回収し、逆入れを最小限に抑えます。
   5. トラップカラムから脱塩されたペプチドをC18分析カラム(1mm x 100 mm、1.7 μM、130 Å)に渡し、0.4 °Cで操作して消化ペプチドを分離します。
      注: ステップ 3.3.3-3.3.5 は、HDX-MS データ収集に使用される特定の LC-MS システムで自動化できます。あるいは、これらのステップは、一貫して低いバック交換を達成するために各ステップのタイミングと温度を慎重に制御する必要があることを念頭に置いて、独立して実行することができます。
   6. C18カラムをアセトニトリル/水/0.1%のギ酸溶媒系でエルプします。ペプチドの分離を最大化し、ペプチドペプチドの重水素標識を維持するために、目的のタンパク質の LC 勾配を最適化します。
      注: グラデーションの溶出の詳細については、 サポート情報を参照してください。
   7. ペプチド消化をエレクトロスプレーイオン化(ESI)質量分析に供する。
      注: サポート情報 に記載されているソース条件は、ほとんどのペプチドに対して十分なイオン化を提供します。
      1. MS機器でイオン化したら、窒素を緩衝ガスとして用いてガス相イオン移動度分離を行い、方法のピーク容量を増強する。
      2. イオン移動度分離の後、低衝突エネルギー(4 V)と高衝突エネルギー(21-40V)の交互サイクルを含むMS^E ワークフローにペプチド前駆体イオンを適用します。
         注: 交互に低衝突エネルギーレジームと高衝突エネルギーレジームを使用すると、MSMS データ(高衝突エネルギー)と同時に MS データ(低衝突エネルギー)を収集できます。これにより、前駆体イオンとそれぞれのフラグメントイオンの時間相関が可能になります。この相関は、セクション4に記載されている自信のあるペプチド同定に不可欠です。
      3. 少なくとも20,000の解決力を持つ質量分析計を使用して、ペプチド前駆体およびフラグメントイオンを検出します。
      4. 同時にデータ取得と同時に、[Glu-1]-フィブリノペプチドB(GluFib)外部標準のMSデータを取得する。
         注: ステップ 3.3.7 で説明されている MS ワークフローは MS^E プロトコルと呼ばれます。ボトムアップ HDX-MS に適した MS^E プロトコルのインストゥルメンタル設定は 、サポート情報に記載されています。
   8. LC-MS データの品質を評価します。
      注:上記のプロトコルとサポート情報で提供されるインストゥルメンタル設定を使用して、リファレンスサンプルは、約1 x 10⁸の最大信号強度を持つ総イオンクロマトグラムを生成する必要があります。3-9 minの間に多くのペプチドが溶け出しているはずです(図3A-C)。
   9. 40 μL のブランクサンプル(水中の0.1%のギ酸)を注入して、ペプシンおよび分析用C18カラムを洗浄します。
      注: 一般的に、2~ 3 個のブランクで十分です。
   10. 参照タンパク質サンプルの各三重化について、ステップ 3.3.1~3.3.9 を繰り返します。

4. 参照データの処理とペプチドリストの定義

1. プロテオミクスソフトウェア(材料表)を使用して生のMS^Eデータ(ステップ3.3.7)を分析します。プロテオミクスソフトウェアを使用して、ライブラリ|タンパク質配列データバンクは、目的のタンパク質のアミノ酸配列をインポートしてタンパク質データベースを定義する。
   注: このステップの目的は、目的のタンパク質から得られたペプチドの参照 MS データを検索し、MSMS データ (MS データと同時に取得) を使用して、推定ペプチドの識別を検証することです。
2. 目的のタンパク質配列に名前を付けます。タンパク質配列をインポートします (FASTA 形式)。このソフトウェアは、データベースタンパク質のインシリコ消化を行い、LC-MSデータの検索に使用されるペプチドのリストを生成します。
3. 処理パラメータを定義します([ライブラリ]メニューにあります)。データ取得タイプとしてエレクトロスプレー MS^Eを選択します。[電荷 2 の質量をロック] フィールドで、[Glu-1] -フィブリノペプチド B (GluFib) の 2⁺イオンの m/z に785.8426と入力し、[終了] をクリックします。
4. ワークフローパラメータを定義します(ライブラリメニューの下にあります)。
   1. 検索タイプ としてエレクトロスプレー MS^E を選択します。 ワークフロー | データベース検索クエリ の見出しで、ステップ 4.2 で作成したデータベースタンパク質を [データバンク ]フィールドで選択します。
   2. プライマリ消化試薬を非特異的に変更し、Ctrlボタンを押したままカルバミドメチルCをクリックして[固定改変試薬]フィールドをクリアします。
5. オプションに移動して出力ディレクトリを指定|オートメーションセットアップ|アイデンティティ E.Apex 3D およびペプチド 3D 出力とイオンアカウンティング出力のチェックボックスをオンにして、目的のディレクトリを指定します。
6. 参照サンプル データを処理します。
   1. プロテオミクスプラットフォームワークスペースの左側のツールバーで、 マイクロティタープレートを右クリックして新しいプレートを作成します。マイクロティタープレートの3つのウェル(セクション3で収集された各参照サンプルに1つずつ)をハイライトします。1つの井戸で左クリックし、3つの井戸に保持し、ドラッグします。
   2. 右クリックして[ 生データを追加]を選択します。表示されるウィンドウで、セクション 3 の 3 つの参照ファイルを含むディレクトリに移動し、それらを同時に選択します。
   3. Nextをクリックし、ステップ 4.3 で定義した処理パラメータを選択します。Nextをクリックし、ステップ 4.4 で定義したワークフロー パラメータを選択します。次に[完了]をクリックします。
7. 未加工データ、処理パラメータ、およびワークフローパラメータがプレート上の各ウェルに割り当てられると、井戸は青色で表示されます。ウェルを選択し、右クリックして最新の 生データを処理するを選択します。ウィンドウの右下隅をクリックして、データの処理を追跡します。「 実行するジョブなし 」というメッセージが表示されると、処理は完全に完了します。
8. データ処理が完了すると、プレート内のウェルが緑色に変わります。ウェルを右クリックし、[ ワークフロー結果の表示] を選択します。参照データ ファイルごとに別のウィンドウが開きます。
9. データを検査して、参照サンプルデータ内のMSシグナルの大部分が、対象タンパク質のインシリコ消化から予測されるペプチドに正常にマッピングされたことを確認します。一致したペプチドは、出力スペクトルで青色に着色されます(図4)。[OK] フィルターをダブルクリックし、パーセントカバレッジが 99% を超えているか確認します。
   注: 処理時に、データ出力は、ファイル拡張子(raw_data_file_name_IA_final_peptide) で、ステップ 4.5 で指定したディレクトリに自動的に保存されます。
10. 追加のしきい値を得る場合は、HDX処理ソフトウェア(材料表)に、プロテオミクスのソフトウェア出力をインポートします。
    1. HDX 処理ソフトウェアウィンドウの左隅にある [データ ] をクリックします。 PLGSの結果をインポート してクリックし、追加アイコンをクリックします。適切なディレクトリに移動して、ステップ 4.9 から処理済みデータ ファイルを選択します。
    2. [次へ]をクリックし、最低連続したイオン≥2、質量誤差= 5 ppm、ファイル閾値= 3のパラメータを指定します。[完了] をクリックします。
11. しきい値パラメーターに問題がなければ、HDX プロジェクトを保存します。すべてのHDXデータは、分析と表示のためにこのプロジェクトにインポートされます。
    注: 次のセクションで説明する重水素交換サンプルは、同一の LC-MS ワークフローで処理する必要があります。したがって、HDXアッセイ(セクション5)を進める前に、サンプル調製(セクション2)、ボトムアップLC-MSワークフロー(セクション3)およびデータ処理ワークフロー(セクション4)が、標的タンパク質の所望の再現性および配列カバレッジを提供していることを確認してください。これらのプロセスのいずれかを変更してカバレッジを改善する必要がある場合は、ステップ2.1に戻り、新しい参照サンプルを三重に準備し、セクション2-4を繰り返し(プロトコルに必要な調整をしながら)各ペプチドを再現的に生成して検出できるようにすることをお勧めします。

5. HDX反応の実施

1. HDX反応のためのワークスペースを準備します。
   1. アリコート前のクエンチバッファーは、適切に標識された0.5 mLチューブに入った。各時点、複製、および分析されるすべての生化学的状態に対して異なるチューブを用意します。HDX反応の50 μL部分の最終的なpH測定量を2.3の値に調整するために必要なステップ2.2からの適切な量のクエンチバッファを使用してください。
   2. 0.5 mLの槽を簡単に遠心分離し、すべてのクエンチバッファーをチューブの底部に移します。チューブを氷の上に置きます。
   3. 液体窒素で小さなデュワーを充填し、ワークスペースに隣接して保ちます。
2. HDX 反応を準備します。必要な交換ポイント数(所望のタイムポイントごとに1つの50 μLアリコート)を収集するのに十分な反応量があることを確認してください。タイムスケールで3-4桁以上の少なくとも4-5のタイムポイントを収集します(例えば、15 s、60 s、300 s [5分]、1,800 s [30分]、および14,400 s [4時間]のクエンチ時間は、ほとんどの酵素の交換ダイナミクスを十分にカバーします)。
   1. _D2Oのステップ1.1から全ての重水素成分(マイナス酵素)をプレミックスする。
   2. 検査される生化学的状態(遊離酵素、酵素+リガンド、酵素+阻害剤など)ごとに、少なくとも三重でHDX反応を調製する。
   3. 酵素を添加する前に、25°Cの温度管理水浴中に反応混合物を10分間インキュベートします。
      注:HDXアッセイへのプロチウムの添加を最小限に抑えるために、酵素は濃縮ストック溶液(〜100-200 μM、ステップ1.6)として調製する必要があります。
   4. 酵素を1~5μMの最終濃度に加えたら、タイマーを開始します。200 μL ピペットを使用して溶液を慎重かつ迅速に混合し、サンプル中に酵素が均等に分散されるようにします。
   5. 希望の交換時間ポイントで、HDX反応から50 μLのアリコートを取り除き、0.5 mLチューブ内の事前に引用された氷冷クエンチバッファーと素早く均等に混合します。
      注:混合ボリュームと混合手順は、2.3の望ましい最終的なクエンチpLがすべてのサンプルで迅速に達成されることを確実にするために、できるだけ正確かつ再現可能である必要があります。クエンチバッファー氷を冷たく保つことは、酵素の変性時の交換を最小限に抑えるのに役立ちます。
   6. HDXサンプルを焼き付けた直後に、チューブをキャップし、液体窒素でフリーズします。
   7. すべてのアッセイが完了するまで時間を収集し続け、サンプルを-80°C冷凍庫に移して保管します。
      注: これは停止点になる場合があります。すべてのHDXのタイムポイントを収集した後、LC-MS分析の準備ができるまで、サンプルは-80°Cで保存することができます。理想的には、3倍のHDX反応は、同じ日に関心のあるすべての生化学的状態に対して行われるべきである。少なくとも、特定の生化学的状態に対するすべての複製HDX反応は、同じ日に並行して実行する必要があります。
3. すべての急がいった HDX タイム ポイントを収集した後、サンプルを、ステップ 3.3 で説明したように開発された最適化されたボトムアップ LC-MS ワークフローに適用します。サンプル間に適切な数のブランクを含むランダム化された順序で HDX サンプルを注入して、ペプチドの持ち越しが最小限になるようにします。
   注: HDX データは MS^E モードで収集する必要はありません。したがって、高衝突エネルギーセグメント(ステップ3.3.7.2)はMSデューティサイクルから削除する必要があります。これは、ステップ 3.3 で説明したワークフローに対する変更のみです。
4. 収集中の HDX データの品質を評価します。
   1. 非全イオンクロマトグラムの全イオンクロマトグラムに存在するクロマトグラフィーピークが、重水素化サンプルで同じ保持時間に現れるようにします(図3D-F)。
   2. 質量スペクトルが参照および重水素化されたサンプルから特定の時間間隔で合計された値が、重水素化の証拠を示していることを確認します(すなわち、個々のペプチドの同位体エンベロープの変化は、重水素化サンプルの高いm/z値に[図6])。

6. HDX データの処理

1. ステップ 4.11 で作成した HDX プロジェクトに HDX データ をインポートするには、データ |上部のツールバーの MS ファイル 。
   1. 必要に応じて 「新規状態 」と 「新規暴露 」をクリックして、分析に関連する生化学的状態(例えば、遊離酵素、酵素+リガンドなど)と重水素暴露時間を定義します。
   2. [新規 Raw]をクリックして、分析する HDX データ ファイルを選択します。インポートされる各生データ ファイルに、適切な交換時間と生化学的状態を割り当てます。
      注: データは、一括でインポートおよび処理することも、すべて一度に処理することもできます。プロジェクトにデータを追加しても、そのプロジェクト内で以前に実行された分析は元に戻りません。
2. データ ファイルを追加したら、[ 完了 ] をクリックしてデータ処理を開始します。少しの遅延の後、ソフトウェアは、ユーザーが続行する前に、データを保存する必要があるかどうかを尋ねます。[ はい] をクリックします。
   注:初期処理は、分析されるサンプルの数、最終的なペプチドリスト(ステップ4.10)に含まれるペプチドの数、クロマトグラフィーウィンドウのサイズ、およびスペクトル取得の頻度に応じて、数時間かかることがあります。
3. 必要に応じて、[ 構成] メニューの処理パラメータを変更して、イオン検索パラメータを変更します。特定のプロジェクト内のすべてのデータに対して同じイオン検索パラメータを使用してください。

7. HDXデータの分析と可視化

注:生データの初期処理が完了すると(ステップ6.2)、HDX処理ソフトウェアは、分析された各生データファイルのペプチドリスト(ステップ4.10で生成)からペプチドを配置します。リスト内のペプチドの同位体分布が生データファイルに配置されると、HDX処理ソフトウェアは各同位体を「スティック」で表します( 図6C-Eのように)。次に、特定のペプチドのスティックの相対強度を使用して、参照スペクトルに対する重水素取り込みの計算が行われます。HDX処理ソフトウェアは、ほとんどのペプチドに「スティック」を適切に割り当てるという素晴らしい仕事をしていますが、重水素取り込み値の大幅な手動キュレーションが必要です。

1. ペプチド重水素摂取値の分析
   1. ペプチドリストの最初のペプチドを選択し、ビューメニューから積み上げスペクトルプロットを開きます。積み上げスペクトルプロットウィンドウで上下にスクロールすると、選択したペプチドの質量スペクトルが重水素交換時間の関数として表示されます(図7D,E)。
   2. マウスクリックを使用してスティックを割り当て、割り当て解除して、適切な同位体分布がデータに配置され、各同位体のピークが割り当てられていることを確認します(割り当てられたスティックは青色に表示されます)。スタックされたスペクトルプロット (図 7D,E)のスペクトルをクリックすると、アクティブなデータビューアウィンドウでスティックを割り当て/割り当て解除できるようになります (図7C)。
   3. 積み上げスペクトルプロットウィンドウの上部にある充電状態を切り替えて、各充電状態のスティック割り当てを確認します。
   4. 対象の生化学的状態ごとに、ステップ 7.1.1~7.1.3 を繰り返します。生化学的状態は、積み上げスペクトルプロットウィンドウの上部で切り替えることもできます。最も正確な重水素取り込み差の測定のために、各生化学的状態のための電荷状態の同じセットにスティックが割り当てられていることを確認してください。
   5. ペプチドリストのペプチドごとにステップ7.1.1-7.1.4を繰り返します。
   6. カバレッジマップを使用して、ペプチド重水素取り込み値の標準偏差を確認します。
      1. 対象となるタンパク質のアミノ酸配列に沿ってマッピングされたペプチドリストの各ペプチドを表示する ビュー メニューからカバレッジマップにアクセスします(図8C)。相対標準偏差(Daの単位)に従ってペプチドを着色します。
      2. 相対標準偏差が高い外れ値ペプチドを視覚的に検索します。カバレッジ マップの外れ値ペプチドをクリックして、積み上げスペクトルプロット (図8B) とデータ ビューア ウィンドウ (図 8A) にターゲット ペプチドを入力します。
      3. 積み重ねられたスペクトルプロットを使用して、外れ値ペプチドのすべての電荷状態とすべての時間ポイントが適切にスティックを割り当てられていることを注意深く確認してください。
         注: ほとんどの場合、標準偏差が大きいペプチド(>0.3 Da)は、ソフトウェアによって適切に割り当てられていない同位体ピークを有します( 図8Bに示されています)。欠落しているスティックを割り当てると、一般にペプチドの相対標準偏差を <0.3 Da に縮小できます。
      4. 相対標準偏差を0.3Da未満に減らすことができない場合は、リストからペプチドを非表示にします。
2. 目的のタンパク質の構造モデルにマッピングするための2つの生化学的状態間のHDX差データをエクスポートします。
   1. カバレッジ マップの関心の差を表示します。カバレッジ マップを右クリックして、差分データを.csv ファイルにエクスポートします。データ |に移動して状態データを (.csv形式で) エクスポートします 。 メインツールバーで 状態データをエクスポート します。
      注: 差分データと状態データ ファイルの適切なフォーマットは 、サポート情報 に記載されています。
   2. 目的のタンパク質の差分データ、状態データ、および pdb ファイルを Deuteros²⁸にインポートします。[99% 信頼区間] を選択し、[ 合計を有効にする] を選択してデータを処理します。
      メモ:マテロスを実行するには、MATLABをPCにインストールする必要があります。Deuterosは、データセット内の反復測定値を使用して、各ペプチドの取り込みデータの標準偏差を計算します。この標準偏差は、プロットに表示される有意な交換の信頼区間を定義するために使用されます。
   3. PyMOLオプションで、輸出取り込み|のエクスポートを使用して、重要な交換の違いの領域を、PyMOLソフトウェアを使用して目的のタンパク質のpdb構造にマッピングするPymolスクリプトを生成します。
      注: このプロトコルで説明されているワークフローを使用すると、特定のペプチドに対する有意な重水素取り込み差の 99% 信頼区間は、通常 0.3-0.5 Da です。すべての交換時間ポイントで合計される差の 99% 信頼区間は、通常 0.7-1.0 Da です。

結果

タンパク質分解消化の品質とサンプル注射の各セットのワークフローの再現性を評価する必要があります。したがって、HDX-MSアッセイを行う前に、目的のタンパク質のタンパク質分解、逆相液体クロマトグラフィーと気相イオン移動度を用いたペプチドの分離、およびMSを用いたペプチドの検出に有効な条件を確立することが不可欠です。この目的のために、対象となるタンパク質(重水素の?...

ディスカッション

このプロトコルで提示されるHDX-MSワークフローは、タンパク質中の構造的に動的な要素の空間分布をマッピングし、これらのダイナミクスが摂動(リガンド結合、酵素変異生成など)にどのように変化するかを調査するための非常に堅牢なプラットフォームを提供します。HDX-MSは、立体構造ダイナミクスの調査に一般的に使用される他の構造生物学アプローチに対して、いくつかの明確な利点?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
[glu-1]-fibrinopeptide B (Glu-Fib)	BioBasic	NA
0.5 mL Amicon Ultracel 10k centrifugal filtration device (Millipore)	Milipore Sigma	UFC501096
acetonitrile	Fisher	A955-1
AMP-PNP	SIGMA	A2647-25MG
ATP	SIGMA	a2383-5G
D2O	ALDRICH	435767-100G
formic acid	Thermo Fisher	28905
guanidine-HCl	VWR	97063-764
HEPES	Fisher	BP310-1
Magnesium chloride	SiGMA-Aldrich	63068-250G
Potassium chloride	BioBasic	PB0440
potassium phosphate	BioBasic	PB0445
TCEP Hydrochloride	TRC Canada	T012500	peptide was synthesized upon request
Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
software
Deuteros	Andy M C Lau, et al	version 1.08
DynamX	Waters	version 3.0
MassLynx	Waters	version 4.1
Protein Lynx Global Server (PLGS)	Waters	version 3.0.3
PyMOL	Schrödinger	version 2.2.2
Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Instrument and equipment
ACQUITY UPLC BEH C18 analytical Column	Waters	186002346
ACQUITY UPLC BEH C8 VanGuard Pre-column	Waters	186003978
ACQUITY UPLC M-Class HDX System	Waters
HDX Manager	Waters
microtip pH electrode	Thermo Fisher	13-620-291
Waters Enzymate BEH column or Pepsin solumn	Waters	186007233
Waters Synapt G2-Si	Waters