磁気測定を用いて細胞の組み込みとそれに続く化学的合成酸化鉄ナノ粒子の生分解をモニタリングする

要約

酸化鉄ナノ粒子は、非水性ゾルゲル法を介して合成され、アニオン性短分子またはポリマーでコーティングされる。ヒト幹細胞内部の磁気ナノ粒子の組み込みや生体変換をモニタリングするための磁気測定の使用は、振動試料磁力計(VSM)を用いて実証されています。

要約

酸化鉄で作られた磁性ナノ粒子は、細胞内にしばしば内在し、その後内部に残される生物医学的用途の広い範囲に独特の関心を提示する。1つの課題は、信頼性の高い正確な方法論で細胞内環境における彼らの運命を評価することです。ここでは、振動サンプル磁力計(VSM)を用いて、磁気モーメントを測定することで、細胞内の磁性ナノ粒子の完全性を正確に定量化する。幹細胞は、まず2種類の磁性ナノ粒子で標識されます。ナノ粒子は、迅速かつ効率的なマイクロ波ベースの非水溶液ゾルゲル合成を介して生成される同じコアを有し、そのコーティングにおいて異なる:一般的に使用されるクエン酸分子は、ポリアクリル酸と比較される。3Dセルスフェロイドの形成は遠心分離によって達成され、これらの回転楕円体の磁気モーメントはVSMと異なる時間に測定される。得られた瞬間は、ナノ粒子の完全性の直接の指紋であり、ナノ粒子の分解を示す値が減少する。両方のナノ粒子について、磁気モーメントは培養時間の経過とともに減少し、その生分解を明らかにする。クエン酸と比較した場合、ポリアクリル酸コーティングの保護効果も示される。

概要

広範囲の生物医学用途に対する酸化鉄ナノ粒子の磁気的特徴に対する関心が高まっている。磁気共鳴に対する応答は、磁気共鳴画像法(MRI)の信頼性の高い造影剤を作り、磁気ナノ粒子で標識された細胞を移植¹後に生体内で追跡できる再生医療における利点である。磁場を使用すると、距離でセルを誘導することもできます。このように、セルラーススフェロイド^2、3、リング^4、またはシート⁵は、磁気的に設計され、また足場のない組織の開発における資産である⁶を遠隔刺激することができる。これらのナノ粒子の可能性の範囲はまた、薬物送達システム^{7、8および}癌細胞^9、10、11を殺すために磁気および光誘導性高熱治療^を含む。これらすべての用途に対して、ナノ粒子は、静脈内注射または細胞内の直接の内在化によって生物学的環境に統合され、その後、その中に残され、細胞内の運命に疑問をもたらします。

生体内分析は、生体内のナノ粒子の運命の一般的な理解を伝えた:血流中の注入時に、それらは最初に肝臓(クファー細胞)、脾臓および骨髄のマクロファージによって主に捕捉され、徐々に分解され、生物12、13、14、15、16、17、18、18の鉄プールに結合する。定性的な観察は、生物全体のナノ粒子の循環のためにのみ可能です。典型的には、透過電子顕微鏡(TEM)を使用して、ナノ粒子を直接観察することができ、器官中の鉄の存在は、投与量を介して決定することができる。最近では、それらの運命は細胞のプールで直接評価されており、鉄分けのない近い回路では、細胞レベル^20、21、22での生体変換の定量的測定が可能である。このような測定は、構造の完全性に密接に関連しているナノ粒子の磁気特性の分析によって可能である。振動サンプル磁気測定(VSM)は、誘導されたフラックスのコイル測定が適用された磁場でのサンプルの磁気モーメントを提供するようにサンプルを周期的に振動させる技術です。このような同期検出は、多数のサンプル^{20、21、22、23}の磁気モーメントを決定するための資産である迅速な測定^を可能にする。VSMによって得られた巨視的磁気シグネチャは、ナノ粒子のサイズと構造に直接相関する生物学的サンプル全体の定量的な概要を与える。特に、サンプルの飽和時の磁気モーメント(emuで表す)を提供し、これはサンプル中に存在する磁気ナノ粒子の数をそれぞれ特異的な磁気特性に直接定量するものである。

磁気ナノ粒子の細胞内処理は、その構造特徴²⁰と密接に結びついていることが示されている。これらの機能は、最適な合成プロトコルを介して制御することができます。各プロトコルには利点と制限があります。酸化鉄ナノ粒子は、一般的に、鉄イオン²⁴の共沈を介して水溶液中で合成される。ナノ粒子サイズの多分散性の限界を克服するために、ポリオール媒介ゾルゲル法などの他の合成方法が²⁵に開発されている。熱分解による非水性アプローチは、非常によく較正された酸化鉄ナノ粒子²⁶の製造につながる。しかし、オレイラミンやオレイン酸のような大量の界面活性剤を使用すると、生物医学の用途のために機能化と水の移動が複雑になります。このため、このような磁性ナノ粒子を、高い結晶性、純度、再現性²⁷に至る非水性ゾルゲル経路を介して合成する。このプロトコルは、温度変動²⁸によって調整することができる十分に制御されたサイズのナノ粒子を生成する。それにもかかわらず、マイクロ波支援非水性ゾルゲル経路は、12nm前後の得られたナノ粒子の上限サイズ制限を有する。この手順は、室温で強磁性粒子を使用するアプリケーションには適合しません。コア合成に加えて、検討されるもう一つの主な特徴はコーティングである。ナノ粒子の表面に横たわって、コーティングはアンカー分子として機能し、ナノ粒子の標的化された内在化を助ける、またはナノ粒子を分解から保護することができる。ベンジルアルコールは酸素源とリガンドとして同時に作用するため、追加の界面活性剤やリガンドを必要とせずに裸ナノ粒子が生成されます。ナノ粒子は、界面活性剤交換プロセスなしで合成後に容易に機能する表面化される。

本明細書において、2種類のナノ粒子が同じコアを有し、コーティングにおいて異なると評価される。コアは高速かつ高効率のマイクロ波ベースの技術を使用して合成されます。比較した2つのコーティングは、バイオメディカルアプリケーションで最も使用されるクエン酸^{、29、30、}およびポリアクリル酸(PAA)、キレート機能の高いポリマーコーティングで構成されています。VSM磁気測定は、まず細胞のナノ粒子取り込みの定量を行い、次に幹細胞内在化時のナノ粒子構造の完全性を直接評価するために使用されます。結果は、インキュベーション濃度がナノ粒子の取り込みに影響を与え、コーティングが劣化に影響を与えることを示し、PAAのアンカー分子の数が多く、コアを劣化から保護する。

プロトコル

1. 磁性ナノ粒子の合成

1. コア合成 – マイクロ波アシスト
   1. 400mgの鉄(III)アセチルアセトネートを溶解する(>99.9%)ベンジルアルコール10mL(BA、99.8%)30 mLモノウェーブガラスバイアル内。
   2. サスペンションの温度を20分間(11.25°C/minの速度で)25〜250°Cに上げ、マイクロ波反応器を使用して30分間250°Cで維持します。
   3. 得られたナノ粒子をベンジルアルコールに懸濁してガラスバイアルに移し、ネオジム磁石を用いてナノ粒子を30分間分離する。
   4. 前の100 mLガラスバイアルでジクロロメタン10mL、1M水酸化ナトリウム、エタノール、pH7水(3回)を各ステップで5分間ネオジム磁石を使用して沈殿物を洗浄し、ナノ粒子をペレット化し、上清を除去します。
   5. 1 M塩酸を使用してpH2に水中のナノ粒子懸濁液を調整し、100kDa超遠心フィルターで10分間2,200xgで遠心分離機を調整します。
   6. 濾液を取り除き、10-2Mの塩酸の12mLをナノ粒子溶液に加え、遠心分離機を100kDaの超遠心フィルターで100mgで10分間(3回)加える。次に、ナノ粒子溶液を^10-2M塩酸の10 mL以内で希釈してからコーティングします。
2. コーティング
   1. 100 mLガラスバイアルでpH2の水中で175mgのクエン酸とポリアクリル酸を希釈し、1M塩酸溶液でpHを2に調整した。
   2. 10 mLナノ粒子をコーティング分子溶液に加え、被覆分子とナノ粒子との間の質量比5に対応する。室温で磁気撹拌を行う場合は2時間撹拌する。
   3. 反応後、1M水酸化ナトリウムでpHを7に調整します。
   4. ナノ粒子溶液を100kDa超遠心フィルターで100kDaの脱イオン(DI)水で3回遠心分離し、10分間2,200 x g; 濾液を取り除き、ナノ粒子溶液を12mLのDI水で希釈してください。

2. 幹細胞の培養・磁気標識

1. ヒト間葉系幹細胞(MSC)を37°Cおよび5%CO2で完全な間葉系幹細胞増殖培地(MSCGM)で培養する。細胞が合流率90%のとき、トリプシン-EDTAの10 mLを150 cm²フラスコあたり37°Cであらかじめ加え、2〜3分間放置して細胞を取り外します。
   1. 細胞が剥離するタイミングを知るために、明視野顕微鏡でそれらを観察します。MSCGMで剥離した細胞を再懸濁し、4つの150 cm²フラスコに分けます。この方法で細胞を4~5の範囲まで増幅する。
2. 細胞標識用の磁性ナノ粒子の溶液を調製:グルタミンなしで血清遊離ロズウェルパーク記念研究所培地(RMPI-1640)中に酸化鉄ナノ粒子の選択濃度を分散させる。RPMIは、DMEMよりもイオン強度が低く、ナノ粒子凝集事象を防ぐため、ナノ粒子インキュベーション(および関連するリンスステップ)に使用されます。
3. 細胞が4または5および90%コンフルエントの通路にある場合、MSCGM培地を取り除き、血清を含まないRPMI(グルタミンなし)で細胞をすすいで、150cm2培養フラスコあたり10mLの酸化鉄ナノ粒子溶液を加え、すべての細胞をカバーするのに必要な最小体積である。
4. 37°Cおよび5%CO2で30分間インキュベートし、ナノ粒子溶液を廃棄する。血清フリーRPMI-1640(グルタミンなし)で1回洗浄し、ダルベックコの修正イーグルミディアム(DMEM)でインキュベートし、10%FBSと1%ペニシリンストレプトマイシン(15mL/150 cm²フラスコ)を一晩で37°Cで、5%CO2でインキュベートして内部ナノ粒子の内部を完成させます。

3. 幹細胞スフェロイドの形成

1. DMEM高グルコースで構成された新しい細胞スフェロイド培地を、L-グルタミンを50 μM L-アスコルビン酸2リン酸、0.1 μMデキサメタゾン、1 mMナトリウムピルビン酸、0.35 mM L-プロリン、インスリン、ヒトトランスフェリンおよびセレン酸(ITS-PREmix)を含む1%のユニバーサル培養サプリメントを添加した。
2. 150 cm² フラスコあたり 37 °C で 0.05% トリプシン EDTA の 10 mL を 2~3 分間加えて、磁気 CS を取り外します。細胞が剥離したら、10%FBSを添加したDMEMの体積の1/3を加え、37°Cで予め加温したペニシリン・ストレプトマイシンを1%添加して、すぐにトリプシンを不活性化する。
3. 解約細胞を5分間260xgで遠心分離し、培地を吸引し、約50μLの培地で20万個の細胞を有するなどの細胞スフェロイド培地の少量(150cm²フラスコあたり1mL未満)で細胞を再懸濁する。ヘモサイトメーターを使用してセル数をカウントし、必要に応じて音量を調整します。
4. 15 mLの無菌円錐形遠心分離機チューブに作りたての細胞スフェロイド培地を1 mL加え、200,000個の細胞に対応する再懸濁液の体積を加えます。
5. これらの磁気標識細胞は、チューブの底部に細胞ペレットを形成する等の3分間180xgで遠心分離し、上清、細胞培養培地である上清を保つ。
6. チューブをわずかに開けて空気交換を可能にし、5%CO2で37°Cで最大21日間インキュベートし、細胞が凝集した3D構造を形成する培養時間で完全に形成されたスフェロイドを生じる。週に2回メディアを変更します。
7. 特定の日に、脱塩水で希釈した0.2Mカコチル酸カコジレートバッファーでスフェロイドを2回洗浄し、2%グルタルアルデヒドを0.1Mのカコチル化緩衝液で0.1Mのカコチル化緩衝液を室温で30分間希釈して固定します。VSM測定またはTEMイメージングに使用されるまで、固定されたスフェロイドをPBSに保管してください。この固定ステップは、すべての生物学的プロセスを停止し、長期的な保全を可能にします。

4. 振動サンプル磁力計(VSM)を用いた溶液中およびセルロ中の磁気ナノ粒子の定量化

1. 特定の体積の磁気ナノ粒子溶液(最大10 μL)または単一のセルスフェロイドを、VSMに収まるように特別に設計されたサンプルホルダーに配置します。
2. サンプルを VSM に挿入し、サンプル オフセットをスキャンします。サンプルを最大磁化に対応する位置に配置します。
3. 低磁場(-1500 Oe~+1500 Oe)で、最初の測定を20 Oe/sのレートで行います。
4. 200 Oe/sの速度で高磁場(-30 000 Oeと+30 000 Oeの間)で2回目の測定を行います。

5. 透過電子顕微鏡(TEM)解析

1. ナノ粒子溶液の場合、水溶液の10μLをカーボンコーティングされた銅グリッドに堆積させ、室温で乾燥させます。
2. 細胞内に内在化したナノ粒子については、0.1Mカコジレート緩衝液で希釈した0.5%のウーロン茶抽出物(OTE)と固定セルスフェロイドを対比し、1.5%のシアノフェレートカリウムを含む1%オスミウム四酸化1%で後固定し、等級エタノール浴中で脱水し、エポンに含まれる。70 nmの超断面をスライスし、クーパーグリッドに堆積させます。
3. 80kVの電子顕微鏡を使用して、細胞全体を観察するために1kから40kまでの拡大で、内視鏡コンパートメントの観察のために画像を撮ります。

結果

マイクロ波支援合成を用いて、単分散8.8±2.5nmコアサイズの磁性ナノ粒子が製造され、クエン酸またはPAAのいずれかでコーティングされる(図1A)。次いで、これらのナノ粒子を一定の濃度で培養培地に分散させて培養し、細胞内エンドソーム内でエンドサイトーシスと閉じ込めを行う(図1B)。次いで磁気幹細胞を培地に懸濁し、遠心分離し、形成され?...

ディスカッション

高速かつ効率的なマイクロ波ベースの合成を使用して、磁気ナノ粒子は、制御されたサイズで、容易に合成することができ、さらに与えられた分子でコーティングされています。重要なステップは、鉄塩とベンジルアルコールを真空下でストックし、小さな分散液を小さく保つことです。ベンジルアルコールは溶媒とリガンドの両方として作用すると同時に、追加のリガンドを必要とせずに?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.05% Trypsin-EDTA (1x)	Life Technologies	25300-054
Benzyl alcohol for synthesis	Sigma Aldrich	8.22259
Dexamethasone	Sigma	D4902	Prepare a 1 mM stock solution diluted in Ethanol 100% and store at -20°C
Dichloromethane ≥99% stabilised, GPR RECTAPUR	VWR Chemicals	23367
DMEM with Glutamax I	Life Technologies	31966-021	No sodium pyruvate, no HEPES
Ethanol absolute	VWR	20821.310
Fetal Bovine Serum	Life Technologies	10270-106
Formalin solution 10% neutral buffered	Sigma	HT5012
Hydrochloric acid, 1.0N Standardized Solution	Alfa Aesar	35640
Iron(III) acetylacetonate (> 99.9%)	Sigma Aldrich	517003
ITS Premix Universal Culture Supplement (20x)	Corning	354352
L-Ascorbic Acid 2-phosphate	Sigma	A8960	Prepare a fresh concentrated solution (25 mM) diluted in distilled water
L-Proline	Sigma	P5607	Prepare a 175 mM stock solution diluted in distilled water and store at 4°C
Mesenchymal Stem Cell (MSC)	Lonza	PT-2501
Monowave glass vial	Anton Paar	82723_us
Microwave reactor	Anton Paar	Monowave 300
MSCGM BulletKit medium	Lonza	PT-3001	For the complete medium, add the provided BulletKit (containing serum, glutamine and antibiotics) to the MSCGM medium
PBS w/o CaCl2 w/o MgCl2	Life Technologies	14190-094
Penicillin (10.000U/mL)/Streptomicin (10.000µg/mL)	Life Technologies	15140-122
Poly(acrylic acid, sodium salt)	Sigma Aldrich	416010	MW = 1200 g/mol
RPMI medium 1640, no Glutamine	Life Technologies	31870-025	No sodium pyruvate, no HEPES
Sodium hydroxide, 1.0N Standardized Solution	Alfa Aesar	35629
Sodium pyruvate solution 100mM	Sigma	S8636
Sterile conical centrifuge tube	Falcon	352097	15 mL tubes
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red	Thermo Fisher Scientific	25300054
Tri-sodium citrate	VWR	33615.268	Prepare a 1 M stock solution diluted in distilled water and store at 4°C
Tri-Sodium Citrate Dihydrate, Certified AR for Analysis	Sigma Aldrich	10396430
Ultra centrifugal filter	Amicon	AC S510024