EYFP タグ付き CENP-A (EYFP-CENP-A) のユビキタス性を同定するための質量分析分析

要約

CENP-Aのユビキタスは、細胞分裂間の二量体化によって受け継がれ、細胞の生存率に不可欠なセントロメレでのCENP-A沈着にとって重要な要件です。ここでは、EYFP タグ付き CENP-A (EYFP-CENP-A) タンパク質のユビキタス性を同定するための質量分析分析について説明します。

要約

キネトコレスとセントロメアの構造とダイナミクスを研究することは、染色体不安定性(CIN)および癌進行を理解する上で重要である。染色体の位置と中心の機能(すなわち、セントロメアの同一性)がどのように決定され、正確な染色体分離に参加しているかは、根本的な問題である。CENP-Aは、中心性同一性の非DNA指標(エピジェネティックマーク)であることが提案されており、細胞分裂間の二量体化によって継承されたCENTP-A沈着にはCENP-Aのユビキテレンスが必要であり、細胞生存能に不可欠である。

ここでは、CENP-A K124R変異タンパク質におけるEYFPタギングのために異なるリジンでのユビキタス化が誘導されることを示唆する、EYFP-CENP-A K124R変異体のユビ分量を同定するための質量分析分析について述べている。EYFP-CENP-A K124Rにおけるリジン306(K306)のユビキタス化が同定され、これは、質量分析を通じてCENP-Aのリジン56(K56)に相当する。GFP/EYFPの使用、またはタンパク質の機能を分析するツールとしての高分子量タンパク質のタグ付けについて注意点が説明されています。現在の技術的限界は、ユビキタスバンドの検出、部位特異的なユビキタス性の同定、および細胞全体の周期の間に生きている細胞または特定の単一細胞におけるユビキタス化の視覚化についても議論されている。

ここで提示される質量分析法は、異なるタグおよび他のセントロメアキネトコレタンパク質を有するヒトCENP-Aタンパク質に適用することができる。いくつかのアッセイ/分析からなるこれらの組み合わせ方法は、ユビキタスの機能的役割を特定することに興味を持っている研究者に推奨される可能性があります。

概要

ほとんどの真核生物では、スピンドル微小管は、セントロメアと呼ばれる各染色体の単一領域に付着する必要があります。キネトコレは、セントロメアに位置するタンパク質の複合体です。セントロメアとキネトコレタンパク質の動きのタイミングとキネトコレスとセントロメレスの構造を研究することは、染色体不安定性(CIN)および癌進行を理解するために重要です。重要な問題は、染色体の位置と中心の機能(すなわち、セントロメアの同一性)がどのように決定され、それらが正確な染色体分離にどのように関与しているかである。ほとんどの種では、CENP-Aと呼ばれる特定のヒストン様タンパク質を含む特殊なヌクレオソームの存在がセントロメア同一性を定義する。そこで、CENP-Aが中心同一性の非DNA指標(エピジェネティックマーク)であることを提案する。CENP-Aがヒトのセントロメア同一性をどのように定義するかを解明することが重要です。

ホリデイ接合認識タンパク質(HJURP)は、CENP-A特異的シャペロンであり、CENTP-Aを中心核組中^{11、2、32,3}に沈着させる。我々は、リジン124(K124)およびセントロメレローカリゼーション⁴のCENP-A ubiquityationに、CUL4A-RBX1-COPS8 E3リガーゼが必要であることを以前に報告している。また、我々の結果は、新たに合成されたCENP-Aのセントロメア募集には、既存のユビキタスCENP-A⁵が必要であることを示した。したがって、CENP-Aのユビキタス化は細胞分裂間の二量体化によって継承されることを示唆するモデルが提供された。

我々の調査結果及びYuらのそれとは対照的に、CENP-Aとその中心局在化に関する否定的な結果が最近発表された^6.記事は、リジン124(K124)に対するCENP-A修飾は、K124Rの突然変異がCENP-Aの局在性に影響を及ぼさなかったことを示す否定的な結果に基づいて、ヒトセントロメレの確立、維持、および長期機能に欠かせないと主張^した。しかし、彼らの結果と結論には議論の余地が十分にあり、我々はすでに彼らの前の出版物⁷にどのような問題があるかを説明しました。彼らは内因性CENP-Aのサイズよりもはるかに大きな分子量を持つCENP-Aとタンパク質を融合させることに注意を払う必要があります:例えば、彼らは〜30 kDa強化黄色蛍光タンパク質(EYFP)を〜16 kDa CENP-Aに融合し、RPE-1 CENP-A-F^{ノックアウト}中のEYFP-CENP-A K124R融合タンパク質を分析しました。K124ユビキチンは、構造予測⁴に基づいてHJURPに直接結合するとは考えられていないが、モノユビキチンの添加はCENP−Aのタンパク質の立体構造に影響を与えると予測される。CENP-Aの立体構造は、大きな融合タンパク質の存在によって変化する可能性があり、この立体構造変化は、ユビキサリ化の喪失によって引き起こされる構造変化を隠す可能性がある。我々は、大型タンパク質の融合が、EYFP-CENP-A K124R変異体におけるK124以外のリジンでのユビキスチン化を誘導し、別の部位におけるこのユビキタス化が、元のK124R単一変異型を阻害/マスクすることを示唆する。大きなタグタンパク質を有するCENP-A K124R変異タンパク質(EYFP)の異なるリジンにおいてユビキタンスが起こるという証拠は、我々の前の出版物⁸で報告された。EYFPタグはEYFP-CENP-A K124Rの別のリジン部位のユビキチン化を誘導し、EYFP-CENP-A K124R変異体がHJURPに結合することを発見した。その結果、別の部位でのこのユビキタス性は、元のK124R単突然変異表現型を阻害/マスクし、EYFP-CENP-A WTおよびK124R変異体の両方がセントロメア局在化を示した(pBabe-EYFP-CENP-A WTおよびK124R変異体をpBabe-EYFP対照と共に使用し、比較した)。この結果は、Flagタグ付きまたはタグなしCENP-A K124R変異体が致死的であるが、モノウビキチン融合によって救出できることを示し、CENP-Aのユビキタス化が細胞生存に不可欠であることを示唆した。

近年、多くの研究では、IN IN 9、10、11の両方で、CENP-Aタンパク質および他のセントロメアキネトコレタンパク質の翻訳後修飾(PTM)を同定するための異なるアッセイ^,10を11開発している。⁹クロマチンの機能を調節する主要なメカニズムであるヒストンタンパク質のPTMに類似した、中心クロマチン成分のPTMはまた、全体的な構造と中心の機能を調節するために不可欠なメカニズムに関与しています。CENP-A PTM部位の大部分はCENP-A含有ヌクレオソームに特異的であるが、それらのいくつかはヒストンH3で保存されているが、これらの残基の修飾が中心基質特異的な機能に寄与することを示唆している。リン酸化、アセチル化、メチル化、およびユビ価化を含むCENP-AのPTMは、以前に^{報告された9}であり、CENP-Aがそのアミノ末語およびC末語ヒストンフォールドドメイン上の様々なPTMおよびその組合せ配列を受けていることを示唆した。複数の機能におけるCENP-Aの変更の重要性は、我々を含む多くのグループによって明らかにされた。これらの機能は、セントロメアでのCENP-A沈着、タンパク質安定性、およびCCAN(構成中心性関連ネットワーク⁾⁹の募集を伴う。しかし、CENP-A PTMの限られた研究と所見は、直接的または間接的にその機能を調節する正規のヒストンの1つと比較される場合に前形化される。これらのCENP-A PTMを特定するための方法論に焦点を当てた技術報告書も制限されています。

CENP-Aの積み重ねには、細胞分裂⁵の間の二量体化によって継承され^、細胞生存率⁸に不可欠なCENTP-A沈着にはCENP-Aのユビメンテーションが必要であるため、CENP-Aのユビキタス性を同定する方法は、将来的には、中心の機能活性、位置、構造を研究するために不可欠である。そこで、ここでは、EYFPタグ付けがCENP-A K124R変異タンパク質⁸中の異なるリジンでのユビキタス化を誘導することを示唆するEYFP-CENP-A K124R変異体のユビキタス性を同定するための質量分析分析について説明する。他の制御アッセイおよび分析のプロトコル(免疫蛍光分析、コロニー成長アッセイ、インビボのユビキタスアッセイ)も提示され、主要な質量分析分析の結果を適切に議論する。

プロトコル

1. pBabe-EYFP-CENP-Aコンストラクトの細胞培養およびレトロウイルストランスフェクション

注:EYFP-CENP-Aは、内因性CENP-Aと同様のタンパク質レベルでpBabe-EYFP-CENP-Aから発現されます。総細胞性CENP-Aタンパク質は、RPE-1 CENP-A-----細胞6のようにCREリコンビナーゼによる^CENP-A-/Fアレルの破壊後に、このEYFP-CENP-Aと置換^される。

1. 293T包装細胞を用いたレトロウイルスを含む上清の調製。
   1. 0日目:6ウェル培養プレート(1.0 x 10⁶細胞/ウェル)に293T包装細胞を広げます。10%FBSおよび1%ペニシリンストレプトマイシンを有する高グルコースDMEM中の培養細胞。細胞を37°Cで5%CO2の雰囲気で24時間₂インキュベートします。
      注: 最適な結果を得るには、シード処理に使用するセル密度を実証的に決定します。
   2. 1日目:広がった後23時間前後でトランスフェクション反応を調製する(24時間点はトランスフェクションの0hポイント)。各pBabe-EYFP(B3182)のトランスフェクト発現プラスミド、pBabe-EYFP-CENP-A WT(B3161)、およびpBabe-EYFP-CENP-A K124R(B3164)(表1参照)
   3. 表2に記載されているヘルパー/パッケージングプラスミドの組み合わせを1つ選択し、上記のプラスミドの1つを含むチューブに追加します。ヘルパー/パッケージングプラスミドのこれらの3つの組み合わせが主にあります(表2)。これらの実験で任意の組み合わせが働き、同様のトランスフェクション効率を示した。
   4. 50 μLの減らされた血清培地を調製し、各pBabe-EYFP(B3182)、pBabe-EYFP-CENP-A WT(B3161)、およびpBabe-EYFP-CENP-CenP-A K124R(B3164)を混合します(表1) Table 2この混合物を室温で5分間インキュベートする。この混合物は、溶液Aである。
   5. さらに50μLの減らされた血清培地を調製し、それぞれ1.5μLのトランスフェクション試薬IとIIを混合する(材料表)。この混合物を室温で5分間インキュベートする。この混合物は、溶液Bである。
      注:必要に応じて、トランスフェクション試薬III(ポリエチレンイミン[PEI];1.0 mg/mL)のみを溶液Bに添加するか、トランスフェクション試薬IおよびIIに加えてトランスフェクション試薬Iiiを6.0 μL添加する(材料表)。
   6. 溶液AとBを混ぜ合わせ、室温で15分間インキュベートします。
   7. 培養細胞をPBSで1回洗浄した後、溶液AとB(すなわち、DNA-脂質複合体)の混合物を、500μL減少した血清培地を有する6ウェル培養板の各ウェルに直接添加する。プラスミドの最終濃度は3.3μg/mLです。
   8. 4.5時間5%CO2の雰囲気で37°Cで細胞をイン₂キュベートした後、10%FBSおよび1%ペニシリンストレプトマイシンで培地を高グルコースDMEMに変更します。培地交換後に培地を6ウェル培養板に2mL/ウェル入れる。
   9. トランスフェクション後48時間_5%CO2の雰囲気で37°Cの細胞を培養した。レトロウイルスを含む上清を用いて3日目にレトロウイルス感染を行う。
2. CENP-A-/F^RPE-1標的細胞のレトロウイルス感染。
   1. 2日目:感染の前日、CENP-A-/F^RPE-1標的細胞を広げて6ウェル培養ウェル(2.25 x 10⁵細胞/ウェル)にトランスフェクトする。DMEMの培養細胞:F12培地(材料表)10%FBSおよび1%ペニシリンストレプトマイシンを有する。
      注:コロニー伸長アッセイ、免疫蛍光、およびウェスタンブロット分析のための細胞をコントロールとして広げます。最適な結果を得るには、シード処理に使用する細胞密度を経験的に決定します。
   2. 3日目(ウイルス感染日):293T包装細胞のトランスフェクション後48時間で、0.45 μmフィルターを介してウイルスとフィルターを含む上清を収集します(ウイルスエンベロープをせん断する0.2 μmフィルタを使用しないでください)。ポリエーテルサルホン(PES)フィルタを使用することをお勧めします。
   3. ^CENP-A-/F RPE-1細胞をウイルスに感染させる。6ウェル培養プレートの1ウェルに対して、新鮮な培地1mL、1mLウイルス上清、ポリブレンを8μg/mLの最終濃度に加えます。^{CENP-A-/F RPE-1}細胞をトランスフェクション後7日目まで4日間5%CO2₂の雰囲気で37°Cでインキュベートします。
      注:^CENP-A-/F RPE-1細胞増殖のインキュベーション期間は、最適な結果を得るための分析を次のようにして経験的に決定する必要があります。

2. pBabe-EYFP-CENP-Aを含む細胞の蛍光免疫分析

1. 7日目:pBabe-EYFP-CENP-Aコンストラクトのレトロウイルス感染の4日後、吸引により培地を除去する。TBS(25 mMトリス-HCl、pH 7.5;125 mM NaCl)で細胞を一度リンスします。細胞の表面を乱さないように培養井戸の側面にTBSを適用します。
   注: 細胞固定の最適な時間ポイントは経験的に決定する必要があります。EYFP-CENP-A WTおよびK124Rの両方の免疫蛍光シグナルは、クレ感染がなくてもpBabe-EYFP-CENP-A構築物のレトロウイルス感染後少なくとも4日後のセントロメアで検出可能である(Cre感染を伴うデータについては図Figure 11C-E)。
2. メタノール細胞固定及び免疫蛍光染色を行う^13.
3. 一次抗体は、抗GFP抗体(1:1,000希釈)および抗CENP-B抗体(希釈比1:200)を4%ヤギ血清を含むTBS中のセントロメア位置マーカーに使用します(抗体使用の表を参照)。
4. ペーパータオルで余分な取り付け媒体を取り除き、最後のステップでマニキュアでカバースリップの端を密封します。
5. 免疫蛍光画像観察、取得、定量、およびセントロメアでのEYFP-CENP-Aの残りのシグナルの分析については、前述の方法¹³を参照してください。
6. ソフトウェア A またはソフトウェア B1 および B2 を使用した画像取得処理、デコンボリューション、定量化、および解析を行います (資料表を参照)。コンフォーカルレーザー走査顕微鏡には、オプションでソフトウェア C1-C3 (材料表を参照) を使用します。
   注: ソフトウェア A で使用されるすべてのコマンドについては、補足コード ファイルの 2.6.1 を参照してください。ソフトウェア B1 および B2 で使用されるすべてのコマンドについては、補足コーディングファイルの 2.6.2 を参照してください。

3. レトロクレウイルス感染後のpBabe-EYFP-CENP-Aを用いたコロニーの成長アッセイ

注:このアッセイを行う理由は、CREリコンビナーゼによる^CENP-A-/F対立遺伝子の破壊後のEYFP-CENP-A WTとK124R変異体の細胞生存率を比較するためです(全細胞CENP-Aタンパク質の置換後)。

1. pBabe-EYFP-CENP-Aコンストラクトのレトロウイルストランスフェクション。
   1. セクション1に記載されているように^CENP-A-/F RPE-1細胞のレトロウイルストランスフェクションを行う。DMEMにおける培養細胞:F12培地は、ウイルス感染後72時間、10%FBSおよび1%ペニシリン・ストレプトマイシンを有する。
   2. pBabe-EYFP-CENP-Aコンストラクトのレトロウイルス感染の3日後(6日目)、コロニー成長アッセイおよびコントロール実験に使用されるトランスフェクション細胞を含むウェルにブラストシジンS(10μg/mL)を添加する。細胞は、ブラストシジンS.の存在下でウイルス感染後少なくとも14日後に増殖し、5日ごとにブラストシジンSを含む培地を変化させる。
      注:コロニーアッセイの播種前に細胞が約80%の合流率に達した場合(3.2.7.および3.2.8)、トリプシン法と6ウェル培養プレートでのめっきにより、細胞を1:2および1:5比で通過させます。
   3. 7日目にウェスタンブロットの細胞を採取し、Cre感染のないpBabe-EYFP-CENP-Aコンストラクトのタンパク質発現を確認します。セクション 4 で説明されているように、ウェスタン ブロット分析を実行します。結果は図1B(レーン1-4)に示されている。
   4. クレウイルス感染によるコロニーの成長アッセイについては、ブラストシジンSの存在下でウイルス感染後14日間細胞を増殖させ続ける(すなわち、ここで提示された結果については17日目まで培地を含むブラストシジンSで細胞を増殖させる)。
2. pBabe-po-Creのレトロクレウイルス感染
   注: ステップ 3.2.1 の 0 日目はセクション 3.1 の 13 日目に対応します。
   1. 0日目から3日目まで:pBabe-puro-Cre(B3027)を発現プラスミドとして使用して^CENP-A-/F RPE-1細胞のレトロウイルストランスフェクションを行う(詳細はセクション1を参照)。ブラストシジンS(10μg/mL)を培地に添加してください。
   2. 4日目:細胞をトリプシン化してプレートから取り外す。プレート500または5,000細胞を6ウェル培養プレートに三重化する。DMEMにおける培養細胞:F12培地10%FBSおよび1%ペニシリンストレプトマイシンを有する。
   3. 5日目:ブラストシジンS(10μg/mL)を培地に添加します。5,000または500細胞のメッキの場合、ブラストシジンS(10 μg/ml)3-24日([3.2.7]の14日目まで)または3-28日([3.2.8]の18日目まで)を含む細胞を選択します。
      注:このコロニーの成長アッセイでは、pBabe-EYFP-CENP-Aのトランスフェクションと共にpBabe-puro-Creのトランスフェクションが追加されます。pBabe-EYFP-CENP-Aのトランスフェクションは3.1で行われます。pBabe-puro-Creのトランスフェクションは3.2.1で行われます。
   4. 10日目(レトロクレウイルス感染から7日目):10日目にレトロクレウイルス感染後の内因性CENP-Aのタンパク質枯渇および/またはpBabe-EYFP-CENP-A構築物のタンパク質発現を確認するために、ウェスタンブロッティング分析用の細胞を収集します。
   5. 同じ10日目のセクション4に記載されているように、ウェスタンブロッティングを行います。結果は図1B(レーン5-7)に示されている。
   6. 免疫蛍光分析(上記2項)を行い、残存する内因性CENP-Aアレルの不活性化から7日後にEYFP-CENP-A WTおよびK124Rの両方がセントロメアに局在することを確認した。結果は 図1C-1Eに示されています。
   7. 14日目:5,000個の細胞を播種したプレートでコロニーの成長アッセイを行う。メタノール中の10分間の細胞を固定し、結晶バイオレット溶液中で10分間染色する(2.3%結晶バイオレット、0.1%シュウ酸アンモニウム、20%エタノール(図2B参照)。OpenCFU ソフトウェアを使用してコロニーの数をカウントします (図 2Cを参照)。
   8. 18日目:500個の細胞を播種したプレートを使用します。ステップ 3.2.7 で説明されているようにセルを固定して染色します (図 2Bを参照)。コロニーの数をカウントします (図 2Cを参照)。

4. pBabe-EYFP-CENP-Aを用いたウェスタンブロット分析

注:図1Bおよび図2AおよびEYFP-CENP-Aタンパク質の材料表に示されている抗体を用いたウェスタンブロット分析については、前述の方法¹³を参照してください。

1. 異なるウイルス感染で増殖した細胞を除去することによってタンパク質を分離する。次に、20 μgのタンパク質をSDS PAGEゲルの1ウェルに使用します。上記のとおりにPVDF膜にタンパク質を移す¹³.
2. 一次二次抗体でインキュベーション後に膜3xを洗浄します。免疫ブロット検出用の赤外線画像システムおよび/または化学発光イメージャーを用いて、膜上のタンパク質バンドを検出して分析します。これらの結果は、図 1Bおよび図 2Aに示されています。
   1. 赤外線イメージングシステムでタンパク質バンドを検出して解析するには、「補足的なコーディングファイル」のステップ4.2.1を参照してください。
   2. 化学発光イメージャーを使用してタンパク質バンドを検出して分析し、補足的なコーディングファイルのステップ4.2.2を参照してください。このシステムでは、超高感度の高められた化学発光(ECL)基板(材料表)を使用します。
   3. 必要に応じて、ウェスタンブロットストリッピングバッファーを使用して、PVDF膜から事前インキュベートされた抗体を取り除き、ウェスタン分析の次のターンのために異なる抗体でリブロットします。使用する最適なインキュベーション時間と温度を経験的に決定します。

5. 細胞培養、トランスフェクション、および生体内での pQCXIP-EYFP-CENP-A を用いたインビボユビエキシトリションアッセイ

注:pQCXIP-ベクターから発現されるEYFP-CENP-Aのタンパク質レベルは、内因性CENP-Aタンパク質レベルよりも〜10倍高い。このベクターの使用は、EYFP-CENP-Aタンパク質の高い量の免疫沈降、EYFP-CENP-Aのユビキタスバンドの観察、および質量分析を通じたEYFPタグ付きCENP-A(EYFP-CENP-A)タンパク質のユビキタス性の同定を促進する。

1. pQCXIP-EYFP-CENP-Aを用いたインビボのユビキタス化アッセイのトランスフェクション。
   1. シード 36.2 x 10^{5 CENP-A-/F} RPE-1 細胞を 10 cm の組織培養皿に入れます。10%FBSおよび1%ペニシリンストレプトマイシンを有する高グルコースDMEM中の培養細胞。
      注: 最適な結果を得るには、シード処理に使用するセル密度を実証的に決定します。1つの免疫沈降(IP)サンプルに対して少なくとも2つの皿を準備し、最低1mgの総タンパク質を得る。
   2. 5%CO2の雰囲気で37°Cで細胞を18時間₂インキュベートします。
   3. 播種後17時間で、トランスフェクション試薬を調製する。
   4. 各pQCXIP-EYFP(B3252)、pQCXIP-EYFP-CENP-A WT(B3254)、pQCXIP-EYFP-CENP-A-A K124R(B3256)(表1)を335μLの減らされた血清培地の335 μLに混合することによって、溶液Aを作る、 室温で5分間インキュベートし、pCGN-HA-ユビキチン(B2806)の6.7 μgプラスミドを全てのサンプルに加えます。
      注 : すべてのベクトルは、表 1に示されています。
   5. トランスフェクション試薬IとIIをそれぞれ335μL減らした血清培地に混合し、室温で5分間インキュベートして溶液Bを作ります。
      注:オプションのステップは、40.2 μLトランスフェクション試薬III(ポリエチレンイミン[PEI];1.0 mg/mL)のみを溶液Bに添加するか、またはトランスフェクション試薬IおよびIIに加えて、40.2 μLトランスフェクション試薬IIIを加える(材料表) です。
   6. 溶液AとBを混ぜ合わせ、室温で15分間インキュベートします。
   7. 培養細胞をPBSで1回洗浄した後、3.35 mL μL減少した血清培地を有する個々の10cm組織培養皿のそれぞれに、溶液AとB(すなわちDNA-脂質複合体)の混合物を直接加える。
      注意:最終濃度はプラスミドの1.67 μg/mLです。
   8. 37°Cインキュベーターで細胞を4.5時間_5%CO2でインキュベートします。4.5時間後、10%FBSと1%ペニシリンストレプトマイシンで培地を高グルコースDMEMに変更します。
   9. トランスフェクション後48時間5%CO2で₂37°Cで細胞を培養した。細胞ライセート調製のための細胞を収集します。
2. 抗GFP抗体と結合したプロテインAビーズの調製。
   1. 25 μL (50% v/v) のプロテイン A ビーズを使用して、免疫沈降(IP)の1つの反応を行います。バッファーA1(材料表)を使用して洗浄してEtOHを除去し、バッファーA1(20 mM Tris-HCl、pH 7.4;50 mM NaCl;0.5%ノニデットP-40;0.5%デオキシコール酸;0.5%SDS;1 mM EDTA;完全なEDTA阻害剤)で50%溶液を作る。
   2. 上で調製したビーズに抗GFP抗体(Anti#76:自家製抗体)を2.0 μL添加し、純ビーズ量と比較して10倍のバッファーA1を追加します。
   3. 4~18時間4°Cでエンドツーエンド回転を行います。エンドツーエンド回転の最適な時間長さは、免疫沈降の効率に基づいて経験的に決定されなければならない。
   4. 100 x gでビーズを 1 分間遠心し、バインドされていない上清を取り除きます。バッファ A1 を追加して、ビーズの 50% (v/v) 溶液を作り直します。IPの1つの反応のためにこの解決の25 μL(50%v/v)を使用して下さる。
3. 抗GFP抗体と結合したプロテインAセファローズビーズを用いた免疫沈降(IP)
   1. ステップ5.1.9で得られた細胞を超音波処理および凍結融解処理によりバッファA1で行う。
   2. 異なるIPサンプル間でタンパク質濃度を測定し、タンパク質量を正規化します。各チューブからサンプルの5%を取り出し、SDS-PAGEで5%入力サンプルとして実行します。
      注:5%入力サンプルは、液体窒素で凍結し、1日以内にロードされていない場合は-80°Cでストックすることができます。
   3. 残りの95%のリセートを、ステップ5.2で調製した抗GFP抗体に結合したプロテインAビーズの25μL(50%v/v)と混合します。4~18時間4°Cでエンドツーエンド回転を行います。
      注: エンドツーエンド回転に最適な時間の長さは、経験的に決定する必要があります。
   4. 遠心分離タンパク質Aは、100xgで100xgのタンパク質に結合したタンパク質(すなわち、免疫g沈降物)を有するビーズを1分間、上清を除去する。100 x gで1分間遠心分離して緩衝A1で免疫沈降物を洗浄し、このステップ4xを行います。
   5. 5%入力と残りの95%の免疫沈降物を2xおよび4x SDS-PAGE負荷バッファー¹⁴とそれぞれ混合する。これらの2つのサンプルを5分間沸騰させ、異なるレーンで電気泳動のために10.0%変性SDSポリアクリルアミドゲルにロードします。電気泳動には大きなSDS-PAGEゲル(例えば、17cm x 15 cm)を使用してください。サンプルを小さなゲルで実行すると、明確/鋭いユビキタスバンドを観察できないことがあります。
   6. 前の報告⁸に示された抗体を用いて、セクション4で説明したようにウェスタンブロット分析を行う。結果は図 2Aに示されています。
   7. ウェスタンブロットストリッピングバッファーを使用して、PVDF膜から事前インキュベートされた抗体を取り除き、次のウェスタンブロット分析のために異なる抗体でレブロットします。

6. EYFP-CENP-A K124R変異体のユビキタス部位を同定するための質量分析

1. pQCXIP-EYFP-CENP-Aを用いた質量分析のためのトランスフェクション
   1. 10 cmの組織培養皿に^CENP-A-/F RPE-1細胞をシードします。細胞密度が1皿あたり36.2 x 10^5セルであることを確認してください。10%FBSおよび1%ペニシリンストレプトマイシンを有する高グルコースDMEM中の培養細胞。1つの免疫沈降(IP)サンプルに対して少なくとも20個の皿を準備し、少なくとも10mgの総タンパク質を得る(5.3参照)。
      注: 最適な結果を得るには、シード処理に使用するセル密度を実証的に決定します。
   2. 37°Cの細胞を18時間5%CO2の雰囲気で₂インキュベートし、広がった後にトランスフェクション試薬~23時間(24時間点はトランスフェクションの0hポイント)を準備します。
   3. 播種後17時間で、トランスフェクション試薬とトランスフェクト細胞を(4.1.3)として調製する。トランスフェクトされた細胞は、pCGN-HA-ユビキチン(B2806)およびpQCXIP-EYFP-CENP-A K124R(B3256)を有する。
   4. トランスフェクション後48時間_5%CO2の雰囲気で37°Cの細胞をインキュベートします。細胞のライセートのための細胞を収集します。
   5. リーゼ細胞は緩衝A1内で、(5.2)および(5.3)として免疫沈降を行う。以下の2つの免疫沈降法を(6.1.6)および(6.1.7)として実行します。
      注: (6.1.6) では、サンプルを標準のトリスグリシンゲルで実行します。(6.1.7)で、市販のビストリスタンパク質ゲルでサンプルを実行します。「ディスカッション」も参照してください。
   6. EYFP-CENP-Aのユビキタンスを確認し、セクション5に記載されているようにユビキチン化EYFP-CENP-Aの位置を正確に決定するために、免疫沈降剤全体の10%に対して1つのサンプルを保持します。このサンプルを標準的なトリスグリシンゲルで実行します。SDS-PAGEおよびウェスタンブロットは(5.3)として行った。
   7. 質量分析のために、免疫沈降物質全体の90%を別のサンプルに保管してください。市販の4%-12%ビストリスタンパク質ゲルの2つのウェル内でこのサンプルを実行します。クマシーブルー溶液を使用してクマシーブルー染色を行います。50-70 kDaのゲル領域を切り出して切り出す(推定モノ-Ub-EYFP-CENP-A K124R領域)。質量分析分析にこのゲル領域を使用します。
2. インゲル消化を用いた質量分析法解析
   1. 目的の各ゲルスライスを小さく(1mm²⁾にダイスし、0.5mLのタンパク質低結合チューブに入れる。
   2. 100 μL 50%(v/v)アセトニトリルを25 mM NH₄HCO₃で洗浄し、渦10~15分、スピンダウン、上清を捨て、3倍に繰り返します。
   3. ベンチトップ真空濃縮器を使用してサンプルを30分間濃縮し、ゲル片を乾燥させます。
   4. 10 ng/μLシーケンシンググレードのトリプシンを10 μL加え、ゲル片を5分間水分補給します。
   5. 25 mM NH₄HCO₃を追加するだけでゲル片をカバーし、一晩で37 °Cで消化します。
   6. 消化した上清をクリーンな0.65 mLシリコンチューブに移します。50%(v/v)アセトニトリル/5%(v/v)ギ酸(30 μLまたはカバーするのに十分)、渦10分、スピン、および同じ抽出管への転写を加えます。3x を繰り返します。
   7. ゲル片に10μLのアセトニトリルを加え、5分で渦を巻き、スピンダウンします。上清を同じチューブに移します。
   8. ベンチトップ真空濃縮器を使用してサンプルを2 μLに濃縮し、サンプルに8 μL 3%(v/v)アセトニトリル/2%(v/v)ギ酸、15分間の渦、30分間16,000 x gでスピンダウンします。
   9. 液体クロマトグラフィーシステム(表)と質量分析計装置(材料表)を使用して、LC-MS/MSでMSデータ取得を行います。
   10. 再構成したサンプルを8 μLの逆相液体クロマトグラフィー(RPLC)カラムに注入します。
   11. 60分間に2~80%の溶媒Bの勾配でペプチドを分離し、勾配は40分間で2%から22%、12分間で22%から35%の溶媒Bに増加し、4分で80%の溶媒Bに上昇し、最後の40分間は一定の量で80%の溶媒Bで保持することを確認します。
       注:ソルベントAは0.1%のギ酸および2%アセトニトリルを含み、溶媒Bは0.1%のギ酸および98%のアセトニトリルを含んでいる。すべての濃度は体積/体積として表示されます。
   12. データ依存取得モードを使用して質量分析データを収集します。簡単に言えば、MSスペクトルを350~1500 m/zで250 msで収集し、さらに断片化を行う場合は、チャージ2~5の上位50個の強烈な前駆体を選択します。MS/MSスペクトルを100~2000 m/zで100 msで収集し、15秒の再選択から前駆体イオンを除外します。
   13. データベース検索の場合は、デスクトップ上の質量分析データを分析するために、商用ソフトウェア(「材料表」を参照)を開きます。
   14. 新しい検索を行う場合は、上部メニューの[LC]ボタンをクリックします。次に、[追加] ボタンをクリックして、元の MS 生データ ファイルをアップロードします。
   15. データベース検索方法として「パラゴン法」の「ヒトタンパク質ID」を選択します。元の MS 生データ ファイルを UniProt Homo Sapiens データベース (160,566 のシーケンスを含む)から検索http://www.uniprot.org/proteomes/UP611385640。
   16. 次のように検索パラメータを設定:消化酵素としてトリプシンを選択し、最大3つの欠損切断、4つの修飾および2〜5の電荷をペプチドあたり可能にする。最初の検索では最大 20 ppm の質量誤差を設定し、断片化したイオンの場合は 0.02 Da に設定します。タンパク質、ペプチド、および修飾部位の偽発見率(FDR)閾値を1%未満で指定します。ソフトウェアの他のすべてのパラメータをデフォルト値に設定します(質量分析解析の場合は図3を参照)。
   17. 上部メニューの右側にある [名前を付けて保存]ボタンをクリックし、検索結果を保存するフォルダを選択し、検索名を入力して [保存] ボタンをクリックします。
   18. 上部メニューの右側にある [処理] ボタンをクリックして、検索を開始します。検索が終了すると、入力した検索名を持つデータが、選択したフォルダに自動的に保存されます。データはソフトウェアFによって容易に開くことができる。
   19. 特定のペプチドの MS/MS スペクトルを取得するには、検索結果をダブルクリックしてソフトウェア F で開きます。まず、メニュー上部のタンパク質リストでタンパク質をクリックし、メニューの中央にあるペプチドをクリックします。このペプチドのMS/MSはメニューの下部に表示されます。
   20. MS/MS スペクトルをエクスポートして保存するには、メニューの下部にある MS/MS スペクトルを右クリックし、[コピー] を選択して、PPT 形式や doc. 形式などの適切なファイルに貼り付けます。

結果

EYFP-CENP-A K124変異体は、ユビエキタリミン、HJURPとの相互作用、およびセントロメア局在化の欠陥を示さない細胞致死性を示す。ここでファキネッティらによって報告されたシステム(2017)6⁶は再構成された:1つの破壊を運ぶ二倍化ヒト(RPE-1)細胞と1つの'floxed'CENP-Aアレル(CENP-A-/F)、EYFP-CENP-AはpBabe-EYFPウイルスベクターから発現した。CENP-A^-/F CENP-A?...

ディスカッション

ここでは、EYFPタグ付けがCENP-A K124R変異タンパク質⁸の異なるリジンでのユビキタス化を誘導することを示唆するEYFP-CENP-A K124R変異体のユビキタンスを同定するための質量分析分析の方法を説明した。結果として、質量分析によりCENP-Aのリジン56(K56)に対応するEYFP-CENP-A K124Rのリジン306(K306)のユビキタンスを同定しました。ここで説明する質量分析法は、以前にCENP-A WT-Flag12のリ?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Equpiments/Tools
0.5 ml protein low binding tubes	Eppendorf	022431064	For mass spectrometry analysis
10cm cell culture dish	BIOFIL/JET, China	700224	10 cm tissue culture dish (Yohei lab, PN63)
6 Well Cell Culture Cluster	Fisher/Corning Incorporated	07-200-83	6-well culture plate
CentriVap	LABCONCO	-	Benchtop vacuum concentrator for vaccum dry peptides for mass spectrometry analysis
ChromXP C18CL, 120A, 15 cm x 75 μm	Eksigent Technologies	805-00120	Liquid chromatography (RPLC) column for mass spectrometry analysis
HCX PL APO 100x oil immersion lens	Leica	LEICA HCX PL APO NA 1.40 OIL PHE	100X Oil immersion lens
HCX PL APO 63x oil immersion lens	Leica	LEICA HCX PL APO NA 1.40 OIL PH 3 CS	63X Oil immersion lens
Immobilon-FL PVDF Transfer Membrane	EMD Millipore	IPVH00010	For western blot
Leica DM IRE2 motorized fluorescence microscope	Leica	-	motorized fluorescence microscope
Leica EL6000 compact light source	Leica		External light source for fluorescent excitation
Micro Cover glass (22 mm x 22 mm)	Surgipath	105	Cover glass (22 mm x 22 mm)
Model V16-2 polyacrylamide gel electrophoresis apparatus	Apogee Electrophoresis/CORE Life Sciences	31071010	Gel electrophoresis apparatus I to apply bigger SDS-PAGE gel
nanoLC.2D	Eksigent Technologies	-	liquid chromatography system for mass spectrometry analysis
NuPAGE 4%-12% Bis-Tris Protein Gels	Thermo Fisher	NP0335BOX	The commercially available 4%-12% Bis-Tris protein gels for mass spectrometry analysis
Olympus FLUOVIEW FV3000 confocal laser scanning microscope	Olympus	-	Confocal laser scanning microscope (https://www.olympus-lifescience.com.cn/en/support/ downloads/#!dlOpen=%23detail847250519)
ORCA-R2 Degital CCD camera	Hamamatsu	C10600-10B	CCD camera
PAP Pen	Binding Site	AD100.1	For a water repellant barrier in immunofluorescent staining
TISSUE CULTURE DISHES 10CM	VWR	25382-166	10 cm tissue culture dish
Vertical electrophoresis for gel running (big size)	Junyi, China	JY-SCZ6+	Gel electrophoresis apparatus II to apply bigger SDS-PAGE gel (Yohei lab, PE23)
VWR Micro Slides, Frosted	VWR International	48312-013	Micro slides
Primary antibodies
Anti-CENP-A antibody	Stressgen/Enzo Life Sciences	KAM-CC006	Mouse monoclonal antibody
Anti-CENP-B antibody	Novus Biologicals	H00001059-B01P	Mouse monoclonal antibody
anti-GAPDH	ABCAM	ab37168	Rabbit polyclonal antibody
anti-GAPDH	Invitrogen	PA1987	Rabbit polyclonal antibody
anti-GFP antibody	ANTI #76 (Homemade antibody)		Rabbit polyclonal antibody
anti-HA (3F10)	Roche	11815016001	Rat monoclonal antibody
anti-HJURP	Proteintech Group	15283–1-AP	Rabbit polyclonal antibody
anti-Ubiquitin	Bethyl Laboratories	A300-317A-1	Rabbit polyclonal antibody
Reagents
Bio-Rad Protein Assay	Bio-Rad	500-0006	Commercial protein assay reagent I for measurement of protein concentration (compatible with 0.1% SDS)
Branson SONIFIER 450			Sonicator
Branson Ultrasonics sonicator Microtip Step, Solid, Threaded 9.5 mm	VWR Scientific Products Inc.	33995-325	Disruptor horn for sonication
Branson Ultrasonics sonicator Microtip Tapered 6.5 mm	VWR Scientific Products Inc.	33996-185	Microtip for sonication
Buffer A1	-	-	20 mM Tris-HCl, pH 7.4; 50 mM NaCl; 0.5% Nonidet P-40; 0.5% deoxycholate; 0.5% SDS; 1 mM EDTA; complete EDTA-free protease inhibitor reagent
Complete EDTA-free protease inhibitor cocktail	Roche	11-873-580-001	Complete EDTA-free protease inhibitor reagent for buffer A1
Coomassie brilliant blue R-250	BBI Life Sciences	CAS 6104-59-2	Coomassie blue solution for mass spectrometry analysis
Crystal violet solution (2.3% crystal violet, 0.1% ammonium oxylate, 20% ethanol)	SigmaI-Aldrich	HT90132-1L	For colony staining
DAPI	SIGMA-SLDRICH	D9542	For nuclear staining
DMEM: F12 Medium	ATCC	30-2006	DMEM: F12 Medium
Fetal Bovine Serum, certified, heat inactivated, US origin	Life Technologies/Gibco	10082	FBS (fetal bovine serum)
High-glucose DMEM (Dulbecco’s modified Eagle’s medium)	Life Technologies/BioWhittaker	12-604	high-glucose DMEM
Lipofectamin 3000	Life Technologies/Invitrogen	L3000	Transfection reagent I for chemical transfection
Lipofectamin 3000, P3000 solution	Life Technologies/Invitrogen	L3000	Transfection reagent II for chemical transfection
Methanol	Fisher	A412-4	Fixation reagant
Non fat powdered milk (approved substitution for carnation powdered milk)	Fisher Scientific	NC9255871 (Reorder No. 190915; Lot# 90629)	Non-fat skim milk
Opti-MEM I	Life Technologies/Invitrogen	31985	Reduced serum media
p-phenylenediamine	SIGMA-SLDRICH	P6001	For mounting medium
Penicillin, Streptomycin; Liquid	Fisher/Gibco	15-140	Penicillin-streptomycin
Poly-L-Lysine SOLUTION	SIGMA-SLDRICH	P 8920	Poly-L-Lysine, 0.1% w/v, in water
Polyethyleneimine [PEI]; 1.0 mg/ml	Polysciences	23966–2	Transfection reagent III for chemical transfection
Protein A sepharose CL-4B beads	GE Healthcare/Amersham	17-0963-03	Protein A sepharose CL-4B beads for in vivo ubiquitylation assays using pQCXIP-EYFP-CENP-A
Restore Western Blot Stripping Buffer	Thermo Scientific	PI21059	Western Blot Stripping Buffer I
Sequencing grade trypsin	Promega	V5111	For mass spectrometry analysis
SuperSignal West Femto Maximum Sensitivity Substrate	Thermo	34095	Ultra-sensitive enhanced chemiluminescent (ECL) substrate
UltraPure Distilled Water	Life Technologies/Invitrogen/Gibco	10977	Sterile tissue culture grade water
Western Blot Stripping Buffer II ((50 mM Tris-HCl, pH 6.85; 2% SDS; 50 mM DTT; 100 mM 2-Mercaptoethanol)	-	-	Western Blot Stripping Buffer II
Secondary antibodies
Alexa Fluor 488 Goat Anti-Rabbit IgG	Life Technologies/Invitrogen	A11008	fluorophore-conjugated secondary antibody (Affinity-purified secondary antibody)
Alexa Fluor 594 Goat Anti-Mouse IgG	Life Technologies/Invitrogen	A11005	fluorophore-conjugated secondary antibody (Affinity-purified secondary antibody)
Softwares
Acquisition FV31S-SW software	Olympus	-	Sofware C1 (https://www.olympus-lifescience.com.cn/en/support/ downloads/#!dlOpen=%23detail847250519)
Analysis FV31S-DT software	Olympus	-	Sofware C2 (https://www.olympus-lifescience.com.cn/en/support/ downloads/#!dlOpen=%23detail847250519)
cellSens Dimension software Ver. 1. 18	Olympus	-	Sofware C3 (https://www.olympus-lifescience.com.cn/en/ software/cellsens/)
Image Studio Analysis Software Ver 4.0	LI-COR Biosciences	-	Software D
Molecular Imager Versadoc MP4000 System	Bio-Rad	-	Chemiluminescence imager for immunoblot detection
Odyssey CLx Infrared imaging System	LI-COR Biosciences	-	Infrared imaging system for immunoblot detection
OpenCFU saftware	-	-	For colony counting (http://opencfu.sourceforge.net/)
Openlab version 5.5.2. Scientific Imaging Software	Improvision/PerkinElmer	-	Software A
ProteinPilot Software version 4.5	AB SCIEX	-	Software F for mass spectrometry analysis
Quantity One 1-D analysis software	Bio-Rad	-	Software E
TripleTOF 5600+ System	AB SCIEX	-	Mass spectrometry instrument
Volocity version 6.3 3D Image Analysis Software (Volocity Acquisition)	PerkinElmer	-	Software B1
Volocity version 6.3 3D Image Analysis Software (Volocity Quantification)	PerkinElmer	-	Software B2