光変換可能なDendra2を用いた加齢C.エレガンスにおけるタンパク質代謝の定量化

要約

ここで提示される光変換可能なフルオロフォアDendra2に融合したタンパク質ハンチンチンの分解を監視するプロトコルが提示される。

要約

タンパク質は、恒常性を維持するために細胞内で絶えず合成され、分解されます。目的のタンパク質の分解を監視できることは、そのライフサイクルを理解するだけでなく、プロテオスタシスネットワークの不均衡を明らかにする鍵です。この方法は、疾患を引き起こすタンパク質ハンチンチンの分解を追跡する方法を示す。Dendra2に融合したハンチンチンの2つのバージョンは、C.エレガンス神経系で発現される:生理学的バージョンまたはグルタミンの拡大および病原性ストレッチを有する1つ。Dendra2は光変換可能な蛍光タンパク質です。短い紫外線(UV)照射パルスの際に、Dendra2は、その励起/発光スペクトルを緑から赤に切り替えます。パルス追跡実験と同様に、変換された赤デンドラ2の回転率は、新たに合成された緑色Dendra2からの干渉に関係なく、監視および定量化することができる。共焦点顕微鏡を用いて、そしてC.エレガンスの光学的透明性のために、生きている、老化した生物のハンチンタン-Dendra2の劣化を監視し、定量することができる。ニューロンハンチンデンドラ2は、変換後すぐに部分的に分解され、時間の経過とともにさらにクリアされます。分解を制御するシステムは、変異型ハンチンチンの存在下で欠損し、加齢に伴ってさらに損なわれる。同じ神経系内のニューロンサブタイプは、ハンチンデンドラ2に対して異なるターンオーバー能力を示す。全体として、Dendra2に融合した関心のあるタンパク質を監視することは、その劣化および関与するプロテオスタシスネットワークのプレーヤーだけでなく、その位置、人身売買、輸送に関する重要な情報を提供することができます。

概要

生物のプロテオームは常に自分自身を更新しています。タンパク質は、細胞の生理的要求に応じて連続的に分解され、合成されます。一部のタンパク質は迅速に排除され、他のタンパク質はより長生きします。タンパク質のダイナミクスを監視することは、遺伝的にコード化された蛍光タンパク質(FP)を使用する場合、より簡単で正確で侵襲性の低いタスクです。FPは自己触媒的に形成され、目的の任意のタンパク質(POI)に融合することができるが^、酵素を必要としない、または酸素1のために補因子を保存する必要はない。最近、新世代のFPは、決定された波長の光パルスで照射時に色を切り替える設計を行いました。これらの光活性化可能なFP(PAFP)は、POI、またはそれらが存在するオルガネラまたは細胞の標識および追跡を可能にし、そしてそれらの定量的および/または質的パラメータ²を調べることを可能にする。FPは、POIの動き、方向性、移動速度、拡散係数、移動画分対不動分数、1つのセルラーコンパートメントに存在する時間、および回転率を追跡することを可能にします。特定のオルガネラの場合、移動および輸送、または核分裂および核融合事象を決定することができる。特定のセルタイプでは、セルの位置、分割率、体積、形状を設定できます。重要なことに、PAFPの使用は、連続的な視覚化なしで、新しく合成されたプローブからの干渉なしに追跡を可能にする。細胞および生物全体の研究は、がんや転移の発生、細胞骨格の組み立てまたは分解、RNA-DNA/タンパク質相互作用3などの生体内の問題に対処するためにPAFPをうまく採用^{している。}本稿では、軽い顕微鏡法とPAFPを用いて、神経変性疾患のC.エレガンスモデルにおいて生体内の凝集しやすいタンパク質ハンチンチン(HTT)の回転率を明らかにする。

ここで説明するプロトコルは、融合タンパク質ハンチン-デンドラ2(HTT-D2)の安定性および分解を定量化する。Dendra2は、UVまたは可視青色光のいずれかに応答して発光/励起スペクトルを緑色から赤色に不可逆的に切り替える第2世代単量体^PAFP4であり、その強度は最大4,000倍^5、66に増加する⁵。ハンチンチンは、ハンチントン病(HD)、致命的な遺伝性神経変性疾患を引き起こす原因となるタンパク質です。ハンチンエキソン-1は、グルタミンのストレッチが含まれています (CAG, Q).タンパク質が39Q以上で発現すると、変異体、有毒、病原性タンパク質に誤って折り畳まれ、タンパク質が誤って発現します。変異HTTは凝集しやすく、ニューロン細胞死および変性を招き、短いオリゴマー種として、またはより大きな高度に構造化されたアミロイド⁷と同じである。

線虫は、その操作の容易さ、アイソジェニックな性質、短い寿命、および光学的透明性8のおかげで老化と神経変性を研究するためのモデルシステム^である。生体内でHTTの安定性を研究するために、C.エレガンスの神経系に融合構造が発現した。25Qs(HTTQ25-D2)の生理学的ストレッチまたは97Qs(HTTQ97-D2)の病理学的ストレッチのいずれかを含むHTT-D2トランスジーンは、線虫の寿命⁹を通して汎ニューロンを過剰発現する。生きたC.エレガンスを短く焦点を合わせた光の点に当てることによって、単一のニューロンが光交換され、変換されたHTT-D2が時間の経過とともに追跡される。HTT-D2分解量を確立するために、新たに変換されたHTT-D2の赤色信号との差は、決定された期間の後のHTT-D2の残りの赤色信号と比較される。したがって、その生理学的形態と比較して、ハンチンチンが拡大し、有毒な形態で見つかった場合にどのように分解されるかを調べることができ、その結果として、より多くのハンチンチンが分解される可能性があります。Q97対Q25の存在に対して、前ニューロンまたは後部ニューロンがどのように異なって反応するか、特に長期間にわたって。老化時のプロテオスタシスネットワーク(PN)の崩壊が分解率の違いにどう寄与しているか。これらの結果は、HTT-D2の売上高に関する少数の観測値のみを記述します。しかし、タンパク質凝集とプロテオスタシスの両方の分野に関連する多くの生物学的な質問は、このin vivoアプリケーションで対処することができます。

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プロトコル

ニューロンハンチン-デンドラ2融合タンパク質を発現するC.エレガンスの生成

1. 線虫発現ベクター(すなわち、pPD95_75、addgene #1494)でPOIをコードする遺伝子をクローン化し、従来の制限酵素消化^酵素10、ギブソンアセンブリ^11、または任意の任意の選択方法によって。プロモーターを挿入して、所望の組織または所望の発達段階で発現を駆動させる。Dendra2フルオロフォアをPOIとフレームにN-またはC末端に挿入します。
2. 融合構造を発現するトランスジェニックC.エレガンスを生成(例えば、マイクロインジェクションを介して^)12.
   注: トランスジーンを運ぶプラスミドは、染色体外配列として残ります。コンストラクトの統合は必要ありませんが、必要であれば¹³.このプロトコルにおいて、C.エレガンスは、汎神経プロモーター Prgef-1の制御下で融合構築物ハンチンチンエキソン1-Dendra2(HTT-D2)を運ぶプラスミドをマイクロインジェクションした。C.エレガンス発現骨格は、クレイスら¹⁴から得られた、Q25またはQ97のいずれかを有するハンチンチンエキソン1は、ジュエンマンら¹⁵から得られ、デンドラ2はハマーららから得^られた。

2. C.エレガンスの年齢マッチングとメンテナンス

1. 年齢は、アルカリ次亜塩素酸溶液処理¹⁷または20°Cで4時間産卵を介していずれかの同期させることにより、すべての線虫と一致する。産卵の場合は、10人の大人を新しい播種線虫増殖培地(NGM)プレートに置き、取り除く前に4時間放置します。この時間スパンで産卵した卵は、同期した線虫を生み出す。
2. 試験的なC.エレガンスを、標準的な線虫の畜産¹⁸に続いて、細菌の食料源大腸菌OP50を播種した線虫増殖培地(NGM)プレートに保管する。
3. 目的の段階に20°Cで線虫を成長させる。このプロトコルの場合、必要な年齢は 4 日目と 10 日です。
   注:4日目の若い成人は、生殖腺に卵が存在し、その高い可動性によって識別することができます。10日目の線虫は肥沃な後、組織悪化と機関車の衰退を受ける^19.
4. 10日目の線虫については、3日目のL4ステージ後の毎日の通過は、一度線虫が肥沃になると、混合集団を避ける。

3. イメージング用顕微鏡スライドの作成

1. イメージングの日に顕微鏡スライドを準備します。電子レンジでは、ddH₂Oで3%(w/v)の濃度で一般グレードのアガロースを溶かして、わずかに冷却します。
2. 1 mL ピペットチップの先端を切り、溶かしたアガロースを約 400 μL 吸い上げます。きれいなガラスのスライドにアガロースの数滴をそっと置き、すぐに別のスライドを上に置き、2つの間にアガロースの薄いパッドが作成されるようにします。上のスライドをそっと滑ったり持ち上げたりする前に乾かします。
3. アガロースパッドのスライドを加湿容器に入れ、乾燥を防ぎます。これらは2-3時間以内に使用することができる。
   注:線虫が内部に閉じ込められる可能性がありますので、アガロースの小さな泡の形成を避けてください。

4. 共焦点顕微鏡パラメータの定義

注: 線虫を取り付けてデータを取得する前に、コンフォーカル取得ソフトウェアのすべての設定を定義します。この設定は、選択したイメージングハードウェアおよびソフトウェアに合わせて調整できます。

1. 共焦点ソフトウェアを開き、レーザーイメージング設定を定義します。緑デンドラ2(486-553 nm)、赤色デンドラ2(580-740 nm)の励起/発光の光路を設定します。両方のチャンネル/レーザーのパワーとゲインを、蛍光素の強度に合わせて調整します。デジタルゲインまたはオフセットを変更せず、ピンホールを完全に開く設定にしないでください。
2. 集録設定を定義する:シーケンシャルチャンネルモードを選択し、フレームごとにトラックを切り替えます。スキャン モードをフレームとして、フレーム サイズを 1,024 x 1,024 に設定し、行ステップは 1 です。平均を 2 に設定し、平均法と単一方向線のモードで平均を設定します。ビット深度を 8 ビットに設定します。
3. Dendra2 の変換に関する多次元集録設定を定義します。変換および漂白のために60%のエネルギー力で設定された405 nmダイオードレーザーを使用してください。可能な場合は、検出器を保護するために安全な漂白GaAsPをアクティブにします。
4. 2 サイクルの時系列を選択し、その間に 0.0 ミリ秒間隔を設定し、通常の開始と停止を行います。2 の 1 をスキャンした後に漂白を開始し、30 回の繰り返しを繰り返します。強度が50%に低下したら、漂白を停止します。
5. 取得/ピクセルのドウェルの速度を、高速(最大 = 12)変換用、および中速度(例えば、中= 5)でスナップ画像をキャプチャする速度を定義します。
   注: ここで定義されている漂白パラメータはガイドラインです。他のDendra2タグ付きPOIの場合、レーザーパワー設定と漂白反復と値を経験的に確立する必要があります。

5. C.エレガンスを顕微鏡スライドに取り付ける

注:可能であれば、取り付け実体顕微鏡を共焦点顕微鏡の設定の近くに置き、画像化の直前に線虫を取り付けます。

1. アガロースパッドの反対側のガラスカバースライドに、永久的なマーカーを持つ4つの正方形を持つウィンドウを描き、それらを番号付けします。
2. アガロースパッドの中央にレバミゾールのピペット15 μL。レバミゾールの濃度は線虫の年齢によって異なります:画像化4日目の線虫が2mMレバミゾールを使用する場合。10日目の線虫をイメージングする場合は、0.5 mMレバミソールを使用します。
3. ワイヤーピックを使用して、液体に4線虫を転送します。まつげピックの助けを借りて、個々の線虫を窓の正方形にそっと動かします。大腸菌OP50の痕跡が希釈され、蛍光バックグラウンドがシグナル獲得を妨げないように、まつげを回転させます。
4. 線虫がほとんど動かなくなるのを待ち、液体の上にカバースリップをそっと置き、アガロースパッドとカバースリップの間のレバミゾールの層に線虫を固定します。
5. 線虫をイメージするために、反転したスライドを共焦点ステージに置きます。

6. 緑デンドラ2の変換:時間ゼロでのデータ取得

注:パルスチェイスの実験は、Dendra2融合タンパク質を緑色の発光フルオロフォアから赤いタンパク質に不可逆的に変換することから始まります。

1. 顕微鏡の接眼レンズを使用して、緑色の蛍光の下で20倍の目的を持つ最初の線虫を見つけます。頭部または尾部に焦点を合わせ、共焦点モードに切り替えます。
2. 488 nmの青色レーザーでライブレーザースキャンを開始し、EGFPグリーンチャンネル(ex/em = 486-553 nm)の緑色のDendra2を視覚化します。単一のニューロンを選択し、フォーカスに持って来ます.3倍ズームして、レーザービーム⁴のターゲットを増やします。
   注: 線虫ごとに 1 つのニューロンを選択します。各ニューロンは、1 つのサンプルまたはデータ ポイントを構成します。
3. 最大投影面を見つけ、フルオロフォアの明るさに応じて、ゲインまたはレーザーパワーを増減し、色範囲インジケータで識別可能な飽和しているが露出過多の画像を得る。この定義が完了したら、スキャンを停止します。
   注:可視青色の488 nm光を有する励起はまた、ゆっくりとかつあまり効率的ではないがDendra2を変換することができるように、あまりにも長い間、またはあまりにも多くの電力でサンプルを照射しないでください^4.
4. ソフトウェアで、タブを開いて対象領域(ROI)を選択し、選択したニューロンの周囲に最初のROIを描画します。線虫の頭部を包含し、第1のROIを含む、より大きな第2の関心領域を定義する。
5. 漂白設定で、取得、漂白、分析する最初のROIを選択します。2 番目の ROI を取得して分析するが、漂白は行わない場合に選択します。
6. スキャンの速度を最大(すなわち、高速ピクセルのドウェル)に設定し、選択されたDendra2ニューロンを変換する実験を開始する。
   メモ:実験が完了すると、取得した画像は、変換前と変換後の2つの画像になります。緑のチャンネルの場合、最初の画像は緑色のDendra2の変換によって2番目の画像で減少する緑色の信号を持っている必要があります。赤チャンネルの場合、最初の画像は負で信号を表示しない必要があり、変換後の画像には赤色の信号が表示されます。緑色の信号が減少しない場合は、変換が行われず、405 レーザーパワーや反復回数などの設定を変更する必要があります。最初の画像に赤色の信号がある場合、使用される488nmレーザーパワーが高すぎて、緑色のDendra2の一部がすでに赤に変換されています。この場合、新しいニューロン/線虫を選択する必要があります。
7. 変換後すぐに、緑色の 561 nm レーザーでライブスキャンを開始し、デンドラ 2 を赤チャンネルで視覚化します (ex/em = 580-740 nm)。過剰露出を避けるために範囲色インジケーターを使用して、変換されたニューロンのフォーカスとそれぞれの最大投影を見つけます。
8. スキャン速度を低いピクセルのドウェル速度(例えば5倍)にすばやく設定し、両方のチャンネルのスナップショット画像を高い解像度で取得します。この画像は、変換後のタイムポイント 0 (T0) として定義されます。
   注: 変換された画像の取得速度は変更できます。ただし、選択した場合、この速度はデータ収集全体で一定に保たれる必要があります。
9. スキャンを、識別可能な名前または番号、その後にタイム ゼロ ラベル (T0) を付けて保存します。
   注:変換前の赤信号の欠如とその後の外観を示すために、変換実験(ステップ6.6)の画像を保存することをお勧めします。

7. 選択した第二の時点でのデータ取得のための変換された赤いDendra2の画像化

1. Dendra2 の経時劣化を追跡するには、同じ線虫/ニューロンを再イメージ化する 2 番目のタイムポイントを定義します。関連する生物学的問題に対処するために、実験的に2番目のタイムポイントを選択します。ここで説明するプロトコルについては、Dendra2は、変換後2h(T2)と24時間(T24)の両方で画像化される。
   1. 選択した時点で、接眼と赤の蛍光を使用して同じ線虫/ニューロンを見つけます。
   2. それぞれの線虫/ニューロンのT0画像を開き、画像設定をリロード/再利用します。T0、T2、および T24 h イメージを取得する場合は、スナップショットの取得設定が正確に同じであることを確認します。
   3. スキャンは、赤いチャネルに生きて, フォーカスに変換された赤いニューロンをもたらします.赤いDendra2は時間の経過とともに劣化するので、範囲インジケータは、より強い最大投影を示します.取得パラメータを変更せず、最初の画像と同じ速度(例えば5倍)でスナップショットを取得しないでください。
2. Dendra2の劣化を4時間以上経過後に追跡するには、変換後に線虫を救出してください。
   1. 4本の線虫を変換してイメージングした直後に、顕微鏡からスライドを取り外します。カバースリップをそっと取り外し、ワイヤーピックを使用して、アガロースパッドから各線虫を持ち上げます。
   2. 各線虫を適切にラベル付けされたNGMプレートに個別に配置します。
   3. 2番目の時間ポイントについては、線虫を新鮮なアガロースパッドに再度取り付け、セクション6の指示に従って変換された赤いDendra2のイメージングを進めます。

8. 変換されたデンドラ2の画像解析

注意:Dendra2の劣化の分析は、フィジー/ImageJソフトウェア²⁰で行われます。

1. フィジーを開き、.lsm ファイルをフィジー バーにドラッグ アンド ドロップします。変換直後に撮影したT0画像と、変換後に選択した時点で撮影した同じ線虫の画像(T2またはT24h)を開きます。
   注: Dendra2 に融合した目的のタンパク質の分解を追跡するには、赤いチャネルのみを分析する必要があります。
2. メニューから測定パラメータを設定する:分析 |測定を設定する。[面積]および[統合密度]機能を選択します。
3. 赤チャンネルで取得した画像を選択します。フィジーバーからポリゴン選択ツールを選択します。
4. T0 画像上の変換されたニューロンを識別し、選択ツールを使用して周囲の ROI を描画します。
   1. ニューロンの輪郭を適切に識別するには、バーの[画像]から選択して強度のしきい値をハイライト表示します。調整 |しきい値:バーカーソルをドラッグして、ポリゴン ツールを使用して、しきい値を示し、この領域を追跡します。正確なROIを生成するために、緑色チャネルから選択したニューロンの輪郭を使用することもできる。
5. 赤チャンネルウィンドウで選択が完了したら、分析 |測定します。[結果]という名前のポップアップ ウィンドウが表示され、[エリア]、[IntDen]、および[RawIntDen]の ROI 値が表示されます。
6. 2番目のタイムポイントの画像に対して同じ選択と測定の処理を行う(T2またはT24h)。
7. 取得した値をスプレッドシートソフトウェアにコピーし、変換後のT0で値を適切に記録し、変換後のT2またはT24時間に適切に記録するように注意してください。

デンドラ2分解率の計算

1. 劣化率を計算するには、まず 1 (または 100%)を時間を設定すると、時間がゼロの時点から(つまり、変換直後に、変換された赤デンドラ2のすべてがまだ存在する場合)これは、T0 の IntRawDen の値を単独で除算した結果です。
2. 赤色Dendra2強度信号の減少を経時に、分解して算出するために、第2の時点のRawIntDenの値(例えば、T2またはT24h)をT0のRawIntDenの値で割る。結果の数値は 1 未満である必要があります。これらの値は、T0 を 100% として定義する割合として表すこともできます。
3. 変換された線虫ごとにセクション7を繰り返します。Dendra2 の劣化をグラフィカルに表現する場合、散布図または棒グラフを、y 軸で取得した蛍光減少の割合または比率の値を使用してグラフ化します。目的の統計分析を適用し、グラフ上に図示します。

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結果

光変換可能なタンパク質Dendra2を有するフレーム内のハンチンチンエキソン-1タンパクフラグメントを発現する2つの線虫株がマイクロインジェクションを介して得られ、プラスミドを染色体外配列として保持した。融合構築物は、老化を通じて発達から全体のC.エレガン神経系で発現した。ここで、HTT-D2は、生理学的25ポリグルタミンストレッチ(HTTQ25-D2、

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ディスカッション

タンパク質の機能を理解するには、その合成、位置、分解を理解することが重要です。新しく、安定した、明るいFPの開発に伴い、POIの可視化と監視がより簡単かつ効率的になりました。Dendra2のような遺伝的に発現した融合PAFPは、POIの安定性を研究するためにユニークに配置されています。紫色の青色光に曝されると、Dendra2は保存されたアミノ酸のトライアド内の正確な位置で壊れます。?...

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資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agar-Agar Kobe I	Carl Roth GmbH + Co. KG	5210.2	NGM component
Agarose, Universal Grade	Bio & Sell GmbH	BS20.46.500	Mounting slide component
BD Bacto Peptone	BD-Bionsciences	211677	NGM component
Deckgläser-18x18mm	Carl Roth GmbH + Co. KG	0657.2	Cover slips
EC Plan-Neufluar 20x/0.50 Ph2 M27	Carl Zeiss AG		Objective
Fiji/ImageJ 1.52p	NIH		Analysis Software
Levamisole Hydrochloride	AppliChem GmbH	A4341	Anesthetic
LSM710-ConfoCor3	Carl Zeiss AG		Laser Scanning Confocal Micoscope
Mounting stereomicroscope	Leica Camera AG		Mounting microscope
neuronal-HTTQ25-Dendra2	this paper		C. elegans strain
neuronal-HTTQ97-Dendra2	this paper		C. elegans strain
OP50 Escherichia coli	CAENORHABDITIS GENETICS CENTER (CGC)	OP50	Nematode food source
Sodium Chloride	Carl Roth GmbH + Co. KG	3957.2	NGM component
Standard-Objektträger	Carl Roth GmbH + Co. KG	0656.1	Glass slides
ZEN2010 B SP1	Carl Zeiss AG		Confocal acquisition software