視葉可視化のためのショ ウジョウバエ の幼虫および成虫の脳の解剖、免疫組織化学、およびマウント

要約

このプロトコルは、イメージングのために幼虫および成虫の ショウジョウバエ の視葉を準備するための3つのステップを説明しています:1)脳の解剖、2)免疫組織化学、および3)マウント。ステップ3に重点が置かれ、特定の光学ローブ構造を視覚化するには明確な取り付け方向が必要です。

要約

ショウジョウバエ視葉は、椎弓板、髄質、小葉板、小葉板の4つの神経小孔で構成されており、神経多様性を生み出し、回路の組み立てを駆動する発達メカニズムを探索するための優れたモデルシステムです。その複雑な三次元構造を考えると、視葉の解析には、成体の神経胞と幼虫の祖先が互いに、そして中枢脳に対してどのように位置しているかを理解する必要があります。ここでは、視葉イメージングのための幼虫および成虫の脳の解剖、免疫染色、およびマウントのためのプロトコルについて説明します。特に、取り付け方向と視ローブの空間構成との関係に重点が置かれています。幼虫の3つの取り付け戦略(前部、後部、外側)と成虫の3つの取り付け方略法(前部、後部、水平)について説明し、それぞれが明確な視葉構造に理想的なイメージング角度を提供します。

概要

複眼とその下にある視神経葉で構成されるショウジョウバエの視覚系は、神経回路の発達と機能の研究のための優れたモデルです。近年、特に視葉は、神経新生や回路配線1,2,3,4,5,6,7,8などの神経発達過程を研究するための強力なシステムとして浮上しています。それは4つの神経胞から成り立っています:椎弓板、髄質、小葉および小葉板（後者の2つは小葉複合体を構成する)1,2,3,4,5,6。眼からの光受容体は、椎弓板と髄質のニューロンを標的とし、これらは視覚入力を処理して、それらを小葉複合体1,2,3,4,5,6の神経胞に中継します。小葉複合体の投射ニューロンは、その後、視覚情報を中枢脳^1,5,9の高次処理センターに送る。視葉の複雑な構成は、網膜トピーを維持し、さまざまな種類の視覚刺激を処理する必要性によって必要とされるため、高度な神経回路がどのように組み立てられるかを研究するための魅力的なシステムとなっています。特に、髄質は、その組織化と発達の両方で、脊椎動物の神経回路発達のモデルである神経網膜と顕著な類似性を共有しています^3,8。

視葉の発達は胚発生中に始まり、視プラコード ^2,4,5,6,7,8 を形成する ~35 個の外胚葉細胞が特定されます。幼虫の孵化後、視プラコードは2つの異なる原始に細分されます:1)椎弓板と外髄のニューロンを生成する外側増殖中心(OPC)、および2)内側髄質と小葉複合体のニューロンを生成する内部増殖中心(IPC)4,5,6,10 .後期のセカンドインスター幼虫では、OPCおよびIPCの神経上皮細胞が神経芽細胞に変化し始め、その後、中間神経節母細胞4,5,11,12を介してニューロンを生成する。視葉神経芽細胞は、空間的および時間的に制限された転写因子によってパターン化され、それらが一緒に作用してその子孫11,12,13,14に神経多様性を生成する。蛹では、視神経葉神経胞の回路は、プログラムされた細胞死^11,15、ニューロン移動^12,16、軸索/樹状突起ターゲティング^10,17、シナプス形成^18,19、およびニューロピル回転^10,17を含むいくつかのプロセスの調整を介して組み立てられます。

ここでは、視葉をイメージングするために、幼虫と成虫の脳を解剖し、免疫染色し、マウントする方法論について説明します。その複雑な三次元構造を考えると、視葉の解析には、成体の神経胞と幼虫の祖先が互いに、そして中枢脳に対してどのように位置しているかを理解する必要があります。したがって、取り付けの向きが視ローブ構造の空間構成にどのように関連しているかに特に重点を置きます。幼虫の脳には3つのマウント戦略(前部、後部、外側)と成虫の脳には3つのマウント戦略(前部、後部、水平)について説明し、それぞれが特定の視葉前駆細胞集団または神経孔をイメージングするための最適な角度を提供します。

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プロトコル

1. 共焦点イメージングのための幼虫脳の準備

1. 解剖
   注:解剖を開始する前に、固定液(リン酸緩衝生理食塩水(PBS)中の4%ホルムアルデヒド)およびPBT(PBS中の0.1〜0.3%Triton)溶液を準備します。解剖中は、固定溶液を氷の上に置く必要があります。このプロトコルではパラホルムアルデヒド(PFA)固定剤が使用されますが、特定のエピトープについては、代替の固定戦略(PLP²⁰ またはPEM²¹を使用)が説明されています。幼虫の解剖には、2対の鉗子(Dumont #5または #55s)が必要です。詳細については、材料の表を参照してください。
   1. まず、解剖皿の各ウェルに400 μLの1x PBSを充填します。一対の鉗子を使用して、バイアルの内側を這うさまようサードインスターの幼虫を優しく摘み取ります。PBSで満たされた皿の最初のウェルに幼虫を置きます。
   2. 1匹の幼虫を取り、それを真ん中の井戸に移します。利き手ではない手を使って、幼虫の体を井戸の底に保持します。
   3. 利き手で幼虫の口フックをそっとつかみ、体から引き離します。幼虫の脳は、マウスフックやその他の付属組織に取り付ける必要があり、組織が引き離されると剥がれます。
   4. 付属の想像椎間板を取り外し、幼虫の脳を解剖皿の3番目のウェルに移します。想像円板は、幼虫の脳を取り囲む上皮組織であり、触角、目、脚、翼などの成体構造を生成する²⁰。組織上に残すと、想像上の椎間板が幼虫の脳の適切な免疫染色を妨げる可能性があります。
      1. 想像椎間板を切除するには、一対の鉗子を使用して、腹側神経索を介して脳をしっかりとつかみます。別の鉗子を使用して、ディスクをそっと引き抜きます。
      2. 眼板は脳葉の表面を包み込むため、慎重に取り外します。目の椎間板を取り外すには、一対の鉗子を使用して、脳を皿の底に押し付けます。腹側神経索を介して脳を保持する代わりに、鉗子を使用して脳葉を軽くつかみ、葉を圧迫しないように注意します。別の鉗子を使用して、アイディスクをそっと引き離します。
         注:目の想像椎間板は、最終的に網膜の光受容体を生じさせます。網膜と視神経葉の間の神経接続の研究に興味がある人は、眼板を脳に残すことができます。ただし、視葉の構造のみに興味がある場合は、脳の表面にあるため、画像の品質を妨げる可能性があるため、眼板を取り外すことをお勧めします。
   5. 十分な数の脳が収集されるまで(または30分の解剖時間が経過するまで)、手順1.1.2-u20121.1.4を繰り返します。組織の完全性が損なわれないように、解剖は30分を超えてはなりません。
   6. 解剖期間が終了したら、P200ピペットを使用して、3番目のウェルからPBSを慎重に取り出します。脳を浸し続けるために、少量の液体がウェルに残っていることを確認してください。
      注:プロトコルのすべてのポイントで脳を液体に浸し続けることが重要です。組織が乾燥すると、共焦点画像の望ましくない自家蛍光によって染色の品質が損なわれる可能性があります。
   7. 500 μLの冷間固定溶液を3番目のウェルに加えます。一対の鉗子を使用して液体を穏やかにかき混ぜ、脳が皿の中で渦巻くようにします。皿をスライドガラスで覆い、氷の上に30分間置き、組織を固定します。
   8. 固定液を取り出し、400μL PBTで脳を5回洗浄します。
      注:トリトンはPBTの洗剤で、脳が互いにくっついたり、皿にくっつかったりするのを防ぎ、抗体が最適に浸透するように組織を準備します。
2. 免疫組織化学
   注:Developmental Studies Hybridoma Bank(DSHB)には、特定の視葉構造または細胞タイプの標識に使用できるいくつかの一次抗体があります。DE-CadherinはIPCおよびOPC神経上皮を、Bruchpilot(Brp)は発達中の神経孔を、Dachsundは薄層および小葉ニューロン(および髄質ニューロンの小さなサブセット)を標識します。さらに、Elavはニューロンの標識に、Prosperoは神経節母細胞の標識に、Repoはグリアの標識に使用できます。
   1. 一次抗体溶液を調製するには、PBTに抗体を添加し、総容量100 μLまで添加します。ブロッキング剤(10%正常ヤギ血清)を使用して、一次抗体と組織との間の非特異的結合を防止することができる20,22,23。このプロトコルで使用される抗体は、ブロッキング剤を必要とせずに脳組織を特異的に標識します。
   2. 最終的な固定後洗浄液を取り出し、一次抗体溶液を添加します。抗体溶液を添加する前に、ウェル内に少量のPBTしか含まれていないことを確認してください。溶液を加えた後、鉗子で脳を5〜10回穏やかにかき混ぜます。スライドガラスで覆い、ラボ用フィルムで密封し、4°Cで一晩インキュベートします。
      1. あるいは、冷蔵オービタルシェーカーが利用可能な場合は、ディッシュをシェーカーに載せて、一晩のインキュベーションを最適化します。
         注:一次抗体のインキュベーションとその後のすべてのステップは、1.5 mLの微量遠心チューブで代替的に行うことができます。一次インキュベーションと二次インキュベーションの容量は100 μLのままでかまいませんが、洗浄ステップは800 μL以上のPBTで実行する必要があります。
   3. インキュベーション後、前項のステップ1.1.8と同様に、一次抗体をPBTで洗い流します。
      注:一次抗体溶液は、その後の実験で再利用できるため、4°Cで保存および保存する必要があります。多くの一次抗体は、最大4回まで再利用できます。
   4. 400 μLのPBTをブレインに加え、最終洗浄を行います。ディッシュをスライドで覆い、実験用フィルムで密封し、低速(100rpm)および室温(RT)でオービタルシェーカーに~4時間置きます。
      注:プロトコルはここで一時停止できます。脳は、4°Cで2〜3日間洗浄したままにしておくことができます。
   5. 二次抗体溶液を総容量100 μLで調製します。
      注:このプロトコルでは、すべての二次抗体を1:500の希釈で使用し、ブロッキング剤を使用しません。
   6. PBT洗浄液をウェルから取り出し、二次抗体溶液を加えます。一対の鉗子を使用して、溶液中の組織を混合します。皿をスライドと実験室用フィルムで覆います。皿をRTのオービタルシェーカーに置き、最小2時間のインキュベーション期間を確保します。二次抗体には光感受性蛍光色素が含まれているため、皿をアルミホイルで覆います。
      注:プロトコルはここで一時停止できます。脳は二次抗体溶液に4°Cで一晩放置できます。
   7. ステップ1.2.3で説明したように、二次抗体を洗い流します。400 μLのPBTをブレインに加え、最終洗浄を行います。皿をスライドで覆い、実験用フィルムとホイルで密封します。脳をRTのシェーカーに4時間置きます。
      注:プロトコルはここで一時停止できます。脳は、4°Cで2〜3日間洗浄したままにしておくことができます。
3. マウンティング
   1. 最終的なPBT洗浄液を取り外し、蛍光に安全な封入剤2滴と交換します。封入剤をスライドの中央に一滴垂らします。
   2. 鉗子を使用して、ウェルからスライド上のドロップに脳を移します。視葉の損傷を避けるために、スライドに移している間、脳を腹側神経索で保持することができます。
   3. 次の取り付け戦略に従って、頭脳を取り付けます(図1A)。
      1. 前方を上にして
         注:前髄質、椎弓板、または小葉プラグの視覚化に関心のある人にとって、この取り付け方向は理想的です。前部マウントと後マウントを区別する最良の方法は、脳葉に対する腹側神経索の位置を調べることです。
         1. 前向きを使用して、腹側神経索が葉の上に突き出ているのを観察します(図1B)。
      2. 後方を上にして
         注:このオリエンテーションは、OPC(pOPC)または^IPC10,11の後端を視覚化することに興味がある人に推奨されます。
         1. 後方向きを使用して、脳葉の下から突き出ている腹側神経索を確認します(図1C)。
      3. 側面図
         注:横方向の取り付け方向は、背腹軸と前後軸の両方の椎弓板、髄質、または小葉栓ニューロンの三日月を1つの平面で視覚化するために使用されます(図1G)。
         1. 横方向のマウントの場合は、脳葉を互いに分割して、椎弓板と小葉のプラグを上に向けて、脳葉を横に倒します。
         2. 2対の鋭い鉗子を使用して、腹側神経索を半分に分割し、コードが葉に付着する場所から始めます。2つの葉はすでに互いに分離しており、腹側神経索がそれらを無傷で保持していることに注意してください。したがって、腹側神経索を葉の間の切断点から下に分割して、それらを分離します。次に、各脳葉と取り付けられた腹側神経索を、側面を上に向けて裏返します。
            注意: 側面の場合 view マウントでは、先端が細いタングステン針を使用して、ブレインローブを横に向けることをお勧めします。マウント時の葉の向きや腹側神経索の向きをはっきりとイメージするために、顕微鏡の照明を調整することができます。グースネックLED光源を使用する場合は、グースネックをスライドの表面と平行に配置して、はっきりと見えるようにする必要があります。また、照明強度を増減して、脳構造間のコントラストを高め、取り付け時に明瞭さを提供することができます。
   4. 脳を含む封入剤の両側にPBSを少量滴下します。各滴にカバースリップを1枚ずつ置き、最後のカバースリップを脳の上に置きます。上部カバースリップの右端と左端は、他の 2 つのカバースリップ上に置く必要があります (図 1A)。
      注:脳の上にカバースリップを配置する前に、ブリッジを構築する必要があります。幼虫の脳の厚さは約200μmであるため、組織の完全性を維持するために、カバースリップとスライドの表面との間の距離を増加させるブリッジが作成されます。
   5. ブリッジの端をマニキュアでシールして、取り付けられた脳を固定します。
   6. 共焦点顕微鏡を使用して脳を画像化します。

2. 共焦点イメージングのための成人脳の準備

1. 解剖
   注:成虫の脳解剖は幼虫の脳よりも困難であり、慎重な取り扱いが必要です。プロトコルのこの部分には、少なくとも1組の超微細鉗子(Dumont #55)を使用することを強くお勧めします。
   1. 麻酔は、針またはフライパッドを使用して_CO2で飛行し、氷の上の実験室のワイプまたはペーパータオルの上に置きます(麻酔をかけたままにするため)。
   2. ガラス皿の3つのウェルすべてに400μLのPBSを加えます。一対の鉗子を使用して、1匹の成虫のハエを翼でそっとつかみ、皿の最初のウェルに入れます。
   3. 利き手ではない手に持った一対の鉗子を使用して、ハエの胸部を井戸の底に押し付けます。利き手で、体の他の部分から頭をそっと引き抜きます。
   4. ヘッドを2番目のウェルに移します。多くの場合、ヘッドはPBSに浮いており、取り扱いが難しい場合があります。一対の鉗子を使用して、テングによって井戸の底に押し付けます。
   5. 両方の鉗子を使用して、目の間のキューティクルの領域を剥がします。脳はキューティクルの真下にあるため、下にある組織を傷つけないように、できるだけ穏やかにしてください。脳が露出するまで、キューティクルを一度に1つずつ剥がし続けます。脳に付着したままの付属組織(網膜、気管、気嚢など)をすべて取り除きます。
      注:網膜の除去は、以前のプロトコル^22,24に記載されているが、椎弓板は視葉の残りの部分からも分離することができる。これは、髄質または小葉複合体を研究したい人にとっては、椎弓板が表面に位置し、イメージング時にこれらの他の視神経葉の視覚化を妨げる可能性があるためです。椎弓板を取り除くには、鋭い鉗子のペアを使用して、椎弓板と髄質ニューロピルの間のくぼみをそっと引っ張ります。椎弓板はゆっくりと髄質から剥がれ始めます。椎弓板全体が取り除かれるまで、この動作を繰り返します。このプロセスでは、脳をしっかりと握り続けることが重要です。別の鉗子を使用して、脳を皿の底部に押し付け、中枢脳の上部と下部が鉗子の先端の間に完全に収まるように配置して、脳を皿の底に押し付けます。中枢脳をしっかりとグリップすることで、視神経葉への望ましくない損傷を防ぐことができます。
   6. きれいな脳を3番目の井戸に移します。十分な数の脳が得られるまで、または最大30分の解剖期間が経過するまで、手順2.1.2-u20122.1.6を繰り返します。
   7. 3番目のウェルのPBSを取り出し、500 μLの固定溶液を加えます。ここで、または洗浄ステップ中に脳が乾燥しないようにしてください。これにより、共焦点画像に背景の蛍光が発生します。皿をスライドガラスで覆い、脳を固定状態でRTで20分間インキュベートします。
   8. 固定後、400μLのPBTで脳を5回洗浄します。
      注:プロトコルはここで一時停止できます。脳はスライドガラスと実験用フィルムで覆い、4°Cで2〜3日間洗浄しておきます。 このシステムに不慣れな研究者にとっては、固定前や固定中に付属組織を脳に残す方が簡単かもしれません。これにより、研究者は特定の解剖期間に得られる脳サンプルの数を最大化することができます。組織を固定して洗浄した後、一次抗体溶液を添加する前に脳を慎重に洗浄することができます。副組織を持つ成体の脳は浮く傾向があるため、乾燥するリスクがあります。そのため、固定液を加える際には、一対の鉗子を使用してすべての脳を皿の中央に慎重にプールし、固定後すぐに脳をきれいにすることをお勧めします。
2. 免疫組織化学
   1. セクション1.2で幼虫の脳について説明したように、免疫組織化学を行います。
   2. DSHBからの有用な一次抗体には、セクション1.2の幼虫免疫組織化学のプロトコルに記載されているものが含まれます。抗体および対応する希釈液の完全なリストについては、 材料の表 を参照してください。
      注:成人の脳は、洗浄液の表面に浮遊し、溶液を除去するとウェルの側面で乾燥するリスクがあるため、成人の脳の洗浄ステップでは特筆すべき注意が必要です(これはバックグラウンド蛍光につながります)。良い習慣は、片手でピペットを持って液体を追加したり引き出したりし、もう一方の手で一対の鉗子を持って脳を水中に保つことです。
3. マウンティング
   1. 取り付け手順の前に、PBSで最終洗浄を行います(PBTの代わりに)。PBSは脳をわずかにべたつく原因となり、取り付け時に脳を希望の向きに保つことができます。
   2. 最終洗浄液を取り出し、蛍光に安全な封入剤を3滴と交換します。封入剤を顕微鏡スライドの中央に一滴垂らします。
   3. 鉗子を使用して、ウェルからスライド上のドロップに脳を移します。視葉の損傷を防ぎ、組織の乾燥を防ぐために、毛細血管作用によって脳を慎重に回収します。脳の周りの一対の鉗子をゆっくりと閉じて、脳を含む少量の液体が先端の間に引き寄せられるまで閉じます。
      注:脳をスライドに移すときは、鉗子を閉じないように注意してください。あるいは、P200ピペットを使用して脳を移植することもできます。こて先の端を切り落として開口部を広げ、脳がこて先の内側にくっつかないようにPBTで事前にすすぎます。
   4. 次の戦略に従って脳をマウントします(図2A)。
      1. 前方を上にして
         注:椎弓板と髄質のニューロンを視覚化するには、脳を前側を上に向けます(図2B)。これは、中央の触角葉の解剖学的構造と曲率を調べることで達成できます。
         1. 一対の鉗子で、脳をそっと横に向け、前面と背面の両方を調べます。前面では、脳の湾曲が顕著で、触角葉が中心からわずかに外側に突き出ていることを観察してください。
      2. 後方を上にして
         1. 後部(平ら)側を上にし、触角葉を下に向けて脳を配置します(図2C)。
            注:これにより、小葉と小葉プレートがイメージング面に近づき、小葉の複雑なニューロンの視覚化に関心のある方に最適です。
      3. 水平ビュー
         注意: すべての視葉神経胞を同時に視覚化するには、水平取り付け戦略を使用します(図2G)。この向きでは、ニューロンの細胞体、軸索の軌跡、樹状突起の樹状化を同じ平面で視覚化できます。
         1. 最初に、脳の向きを前面を上にして向きを変えます。タングステン針で脳をゆっくりと90°上向きに傾け、触角葉が外側を向いて背側に座るようにします。この向きで脳の前面と後部の両方が見えることを確認します。
   5. カバースリップブリッジの代わりに、粘土を使用してスライドからカバースリップを持ち上げます。粘土を使用すると、イメージング後に脳を再マウントできます(ディスカッションセクションで説明)。
      1. カバースリップの各角に粘土の小片を置きます。粘土の各部分が比較的同じ厚さであることを確認してください。粘土片の厚さは0.5〜1mmである必要があります。カバースリップを脳の上にそっと置き、角に少し圧力をかけます。カバースリップはすぐに液体をキャッチし、シールを形成する必要があります。これで、スライドをイメージングする準備が整いました。
         注意: スライドを長期間保管する場合は、カバーガラスをマニキュアで密封し、光から4°C離して保管することをお勧めします。

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結果

プロトコルに記載されている向きに取り付けられた幼虫および成虫の視葉の共焦点画像を 図1 および 図2に示します。

図1は、前向き、後向き、および横向きに配置された幼虫の脳の概略図と代表的な共焦点スライスを示しています。前方の取り付け方向では、OPC上皮(DE-カドヘリン)、髄質神経芽細胞(?...

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ディスカッション

このプロトコルでは、ショウジョウバエの幼虫と成虫の脳を免疫染色し、それらをいくつかの向きにマウントする方法について説明します。幼虫および成虫の脳を染色する方法は以前に説明されてきたが22,23,24,27,28、特定の視葉構造の最適な視覚化のためのマウンティング戦略はあまり注目されてこなかった²⁸。

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資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
10x PBS	Bioshop	PBS405
37% formaldehyde	Bioshop	FOR201
Alexa Fluor 488 (goat) secondary	Invitrogen	A-11055	use at 1:500
Alexa Fluor 555 (mouse) secondary	Invitrogen	A-31570	use at 1:500
Alexa Fluor 647 (guinea pig) secondary	Invitrogen	A-21450	use at 1:500
Alexa Fluor 647 (rat) secondary	Invitrogen	A-21247	use at 1:500
Cover slips	VWR	48366-067
Dissecting forceps - #5	Dumont	11251-10
Dissecting forceps - #55	Dumont	11295-51
Dissection Dish	Corning	722085
Dry wipes	Kimbery Clark	34155
Goat anti-Bgal primary antibody	Biogenesis		use at 1:1000
Guinea pig anti-Bsh primary antibody	Gift from Claude Desplan		use at 1:500
Guinea pig anti-Vsx1 primary antibody	Erclik et al. 2008		use at 1:1000
Laboratory film	Parafilm	PM-996
Microcentrifuge tubes	Sarstedt	72.706.600
Microscope slides	VWR	CA4823-180
Mouse anti-dac primary antibody	Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)	mabdac2-3	use at 1:20
Mouse anti-eya primary antibody	DSHB	eya10H6	use at 1:20
Mouse anti-nc82 primary antibody	DSHB	nc82	use at 1:50
Mouse anti-svp primary antibody	DSHB	Seven-up 2D3	use at 1:100
Polymer Clay	Any type of clay can be used
Rabbit anti-GFP	Invitrogen	A-11122	use at 1:1000
Rat anti-DE-Cadherin primary antibody	DSHB	DCAD2	use at 1:20
Slowfade mounting medium	Invitrogen	S36967	Vectashield mounting medium ( cat# H-1000) can also be used
Triton-x-100	Bioshop	TRX506