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要約

エンハンサーRNA(eRNA)は、活性エンハンサーから産生されるノンコーディングRNAです。eRNAの機能を研究するための最適なアプローチは、天然のクロマチン領域でそのレベルを操作することです。ここでは、CRISPR-dCas9融合転写活性化因子を使用して目的のeRNAの発現を誘導することにより、eRNA研究のための堅牢なシステムを紹介します。

要約

エンハンサーは、哺乳類のゲノムに散在する極めて重要なゲノム要素であり、組織特異的な遺伝子発現プログラムを決定します。エンハンサーは、転写因子(TF)のDNA結合モチーフを提供するだけでなく、eRNAと呼ばれるノンコーディングRNAも生成することを示す証拠が増えています。研究により、eRNA転写産物は生理学と疾患の両方において遺伝子調節に重要な役割を果たすことが実証されています。eRNAの機能を調べるために一般的に使用される方法は、eRNAのノックダウン、またはエンハンサー転写の化学的阻害による「機能喪失」アプローチに限定されています。ヒトのがんなど、eRNAが過剰発現することが多い特定の疾患状態を模倣するために、eRNAの「機能獲得」研究を行う堅牢な方法はありませんでした。本稿では、dCas9を介したSynergistic Activation Mediaators(SAM)システムを適用することにより、eRNAを精密かつ堅牢に活性化し、その役割を機能的に調べる方法を紹介します。eRNAの選択からgRNAの設計、RT-qPCRによるeRNA活性化の検証まで、eRNA活性化のワークフロー全体を紹介します。この方法は、遺伝子調節と疾患発生における特定のeRNAの役割を研究するためのユニークなアプローチを表しています。さらに、このシステムは、特定の疾患において表現型を駆動するeRNAターゲットを特定するためのバイアスのないCRISPRスクリーニングに使用することができます。

概要

ヒトゲノムには、調節因子1,2,3の星座が含まれています。これらの中で、エンハンサーは最も重要なカテゴリーの1つであることが浮かび上がっています4,5,6。エンハンサーは、発生の調節に重要な役割を果たし、細胞の同一性を決定するための時空間的・時間的な遺伝子発現プログラムを生成する役割を担っている5,6,7。従来、エンハンサーは、転写因子(TF)の結合モチーフを提供するDNA要素のみと考えられ、転写因子(TF)は標的遺伝子の発現を制御しています6,8。しかし、一連の研究により、多くの活性エンハンサーは、ノンコーディングエンハンサーRNA(すなわち、eRNA)も転写することがわかった4,9,10。

eRNA転写のレベルは、エンハンサーの活性と相関することがわかった4,10。活性エンハンサーは、H3K27acやH3K4me1など、活性転写に関連するより多くのeRNA転写産物を産生し、より高いレベルのエピゲノムマーカーを示します9,11,12。いくつかの研究では、eRNA転写産物が標的遺伝子の転写活性化に重要な役割を果たすことが実証されています10,12。ヒトのがん13、14、15、16では、多数のeRNAが調節解除されていることが同定され、その多くが高いがんの種類特異性と臨床的関連性を示しました。これらの知見は、腫瘍形成を促進/促進するeRNAの解明が、治療介入の新たな標的を提供する可能性をもたらす13,15。

eRNAの機能を研究する現在の方法は、ほとんどが低分子干渉RNA(siRNA)、ショートヘアピンRNA(shRNA)、またはアンチセンスオリゴヌクレオチド(ASO、そのうちロック核酸(LNA)が研究で一般的に使用されるタイプである)を使用したノックダウン戦略に基づいています10,12,17。しかし、がんなどのヒト疾患は、隣接する正常組織と比較して主にeRNAの過剰発現を示す15ため、機能研究のためには、疾患に関連する発現パターンを模倣するためにeRNAを「過剰発現」するツールが必要です。これを達成するために、プラスミドベースの異所性過剰発現システムは、eRNAの正確な転写開始部位と終結部位がほとんど不明のままであるため、最適ではありません。さらに、プラスミド発現系はeRNAの位置を変化させ、その機能の潜在的なアーティファクトを引き起こす可能性がある18。ここでは、CRISPR/dCas9-Synergistic Activation Mediators System(SAM)に基づく、eRNAの産生の天然ゲノム遺伝子座(すなわち、in situ)でeRNAの「過剰発現」を強制することにより、eRNAの機能特性評価を容易にするための詳細なプロトコルを提供します。

SAMシステムは当初、メラノーマ細胞のBRAF阻害剤耐性に関連するコード遺伝子および長い遺伝子間ノンコーディングRNA(lincRNA)を活性化するために開発されました19。他のCRISPR活性化(CRISPRa)技術とは異なり、SAMシステムは転写活性化因子の組み合わせで構成されており、標的領域の強力な転写活性化を実現します。これらの活性化剤には、酵素的に死んだCas9(dCas9)とVP64(すなわち、dCas9-VP64)が融合したものが含まれます。2つのMS2 RNAアプタマーとMS2-p65-HSF1融合活性化タンパク質を含むガイドRNA。gRNAにMS2アプタマーが存在すると、MS2-p65-HSF1融合タンパク質がdCas9/gRNA結合部位の近くに動員されます。これらのうち、VP64は単純ヘルペスVP16転写活性化因子ドメインの人工四量体であり、一般的な転写因子を動員することにより遺伝子転写を強力に活性化することが示されている20,21,22。MS2-p65-HSF1融合タンパク質は3つの部分から構成されています。最初の部分であるMS2-N55Kは、より強い親和性を持つMS2結合タンパク質の変異型です23。この融合タンパク質の他の2つの部分は、p65のトランス活性化ドメインと熱ショック因子1(HSF1)であり、これらは両方とも強力なトランス活性化ドメインを持ち、堅牢な転写プログラムを誘導することができる転写因子である24,25。したがって、SAMシステムは本質的に、指定されたコード遺伝子およびlincRNAの転写を活性化するための非常に強力な活性化因子複合体を作成した19。

プロトコル

このプロトコルのワークフロー全体を 図1に示します。

1. エンハンサーRNA(eRNA)の選択

  1. クロマチン免疫沈降シーケンシング(ChIP-Seq)データ、すなわちヒストン修飾(H3K4me1およびH3K27acなど)または転写コアクチベーター(p300など)の結合ピークを用いて、推定されるエンハンサーの関心領域を同定します。
  2. ChIP-SeqのピークとRNA-seqシグナル(total RNA-seqやGlobal Run-On Sequencing(GRO-Seq)などの新生RNA-seqなど)と交差させることで、目的のeRNAを同定します。
    注:gRNAの設計のために選択する領域は、通常、TFまたはコアクチベーター(p300など)が明確なChIP-seqピークを示した「エンハンサーコア」領域に限定する必要があります(図2A)。dCas9とその融合コアクチベーターは、コアクチベーターのネイティブ結合を模倣するために、gRNAによってこの領域にリクルートされます(図2A)。Cap Analysis of Gene Expression(CAGE)4 やGRO-cap26 などの特定のデータセットが利用可能な場合、それらを使用して「エンハンサーコア」、つまり反対方向に転写されたeRNAの2つの転写開始部位間の領域を正確に決定することができる4、10、26。

2. gRNAデザイン

  1. CRISPOR27 などの一般的なCRISPR gRNAデザインツールを使用して、オフターゲティング(http://crispor.tefor.net/)の可能性が低いgRNAを選択します。
    注:Benchling28やCHOPCHOP29 などの他のツールも、gRNAデザインの追加オプションとして使用できます。
  2. エンハンサーコアDNA配列をCRISPORウェブサイトの ステップ1 列に貼り付け、ドロップダウンボタンをクリックして、 ステップ2 列に対応するゲノム(ヒトなど)を選択します。ドロップダウンボタンをクリックして、 ステップ3 列でProtospacer Adjacent Motif(PAM)配列を「NGG」に設定し、「Submit」ボタンをクリックして20 bpの長さのガイド配列を生成します。
  3. CRISPORツールで特異度スコアが最も高い、つまりオフターゲット電位が低いガイドを選択し、5'末端にCACCG、3'末端にCをそれぞれ追加します。
    注:特異度スコアが最も高いガイドを選択します(CRISPORの>85が望ましい)。
  4. 各センスおよびアンチセンス配列のオリゴヌクレオチドを市販のソースから注文します。
    注:CRISPR/Cas9 gRNA設計に関する追加の指示は、他の研究30,31に記載されています。ステップ2.2のオーバーハングにより、gRNAはBsmBI制限酵素を使用するSAM gRNAバックボーン (Addgene #61427) と適合性を持つようになります。

3. gRNAをレンチウイルスコンストラクトにクローニングする

  1. オリゴをアニーリングするには、ペアとなる各オリゴ 1 μL を 100 μM で混合し、10x T4 ライゲーションバッファー 1 μL を 1 μL で、T4 DNA リガーゼ 0.5 μL (400,000 ユニット/mL)、H2O 6.5 μL を混合して総容量 10 μL にします。インキュベートするには、37 °C で 30 分間インキュベートし、次に 95 °C で 5 分間インキュベートします。 5°C/分で25°Cまで下げます。H2Oを使用して100 μLに希釈します。
  2. 10x Restriction Enzyme (RE) Buffer 2 μL、300 ngのlenti_gRNA(MS2)_zeoバックボーンプラスミド (Addgene #61427) を1 μL、1 μLのBsmBI酵素、16 μLのH2Oを混合してgRNA骨格を消化し、総容量20 μLになるようにします。55°Cで15分間インキュベートしてください。
  3. 25 μLのシステムに2.5 μLの10x T4ライゲーションバッファー、1 μLの希釈アニーリング生成物、1.5 μLのT4 DNAリガーゼ(400,000ユニット/mL)を加えて、ライゲーション成分を20 μLの消化産物と混合します。室温で30分間インキュベートします。
  4. ステップ3.3のライゲーションミックス2 μLをStbl3コンピテント 大腸菌 細胞に形質転換します。アンピシリンLB寒天プレートにプレートし、37°Cで一晩インキュベートします。
  5. 単一の細菌コロニーを選択して接種し、プラスミドを抽出します。サンガーシーケンシングに送って、gRNA配列が正しく挿入されていることを確認してください。
    注:プライマーおよびgRNAの配列は 、補足表1に記載されています。 Stbl3化学的にコンピテントな 大腸菌 細胞は、不安定性になりやすいレンチウイルスプラスミドを生成するときに、プラスミドDNA収量が高く、プラスミドの安定性が高いため、ここでの使用が推奨されます32。

4. gRNA効率試験

注:すべてのgRNAに必要というわけではありませんが、研究者は、良質のgRNAによってのみ効率的に生成できるインデルまたは突然変異を検出するために、Surveyorアッセイ(すなわち、ミスマッチ切断アッセイ)を実施することによりgRNAの品質を調べることをお勧めします33,34。分解によるインデルの追跡(TIDE)などの他の方法も、gRNAの効率を決定するために用いることができる30,35。Surveyor Nucleaseは、ミスマッチのある二本鎖DNAを切断できるミスマッチ特異的エンドヌクレアーゼファミリーのメンバーです(図3A)。gRNAの品質は、より小さなDNA種を産生する有効性によって明らかにすることができます。実際には、サーベイヤーの切断効率は、gRNAやCas9のトランスフェクション効率によっても影響を受ける可能性があります。

  1. 脂質ベースのトランスフェクション試薬を用いて、Cas9タンパク質を発現するpSpCas9(BB)-2A-Puroプラスミド(Addgene #62988)とともにgRNAを293T細胞にトランスフェクションします。6ウェルプレートのウェルあたり各プラスミドに1.2 μg/mLを使用します。トランスフェクション後3日間、細胞の培養を続けます。ゲノムDNAを採取し、製造元のプロトコルに従って抽出する36。
  2. ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を使用して、ゲノムDNAから標的エンハンサー領域を増幅します。 補足表2に示すPCR条件を使用してください。 補足表1 のプライマーを使用して、エンハンサーの例、NET1eを使用します。PCR産物を95°Cで10分間インキュベートして変性させ、95°Cから25°Cまで-0.3°C/sの速度で下げて再ハイブリダイズし、gRNA誘導性インデルまたは突然変異の有無にかかわらず一本鎖DNA(ssDNA)が互いにアニールできるようにします。
  3. ハイブリダイズされたDNAをSurveyorヌクレアーゼ(図3A)で、製造元のプロトコル37に従って消化します。ステップ 4.2 のハイブリダイズ DNA 400 ng、Surveyor ヌクレアーゼ 1 μL、Surveyor エンハンサー 1 μL、0.15 M MgCl2 5 μL を 50 μL システムで混合します。42°Cで60分間インキュベートします。アガロースゲルでDNAを解析します。アッセイおよびゲル電気泳動では、Cas9のみを使用し、gRNAを標的としない細胞などのネガティブコントロールを使用します(図3B)。

5.レンチウイルスの生成

  1. 1.5mLのポリプロピレンチューブに、psPAX2、pMD2.G、およびターゲットプラスミド (例:lenti_dCas9-VP64_Blast、Addgene #61425、またはlenti_MS2-p65-HSF1_Hygro、Addgene #61426) を3 μg : 1 μg : 4 μgの比率で添加してください。これらを500 μLのOpti-MEMと混合し、室温で5分間インキュベートします。
  2. 別のチューブに、脂質ベースのトランスフェクション試薬10 μLをOpti-MEM 500 μLに入れ、室温で5分間インキュベートします。
  3. ステップ5.1と5.2の産物を組み合わせ、室温で20分間インキュベートします。
  4. トランスフェクションの1日前に293T細胞をプレート化し、トランスフェクション時に10 cmのディッシュで~30%のコンフルエンスに到達させます。4 mLの通常の培地(10% FBSを含むDMEM)を加え、ステップ5.3の複合体を細胞に滴下します。10% FBSを含むDMEMを添加して、最終容量を最大6 mLにします。細胞インキュベーターで37°C、5%CO2で一晩インキュベートします。
  5. 翌日、培地を10%FBSを含む新しいDMEM10mLに変更します。培地交換の24時間後に培地を収穫します。シリンジフィルター(0.45 μmなど)を使用してウイルス含有培地をろ過し、ステップ6に進むか、ウイルスを-80°Cで保存します。
    注:レンチウイルスの操作には、バイオセーフティレベルIIキャビネットが必要です。ウイルス関連の実験を安全に取り扱うには注意が必要です。また、容器がウイルス培地と直接接触する場合は、バイオハザードとして廃棄する前に20分以上漂白する必要があります。

6. 細胞培養

  1. CO2 細胞培養インキュベーターで細胞を37°C、5%CO2で維持します。
  2. 10% FBSを含むDulbeccoのModified Eagle Medium(DMEM)培地でMCF7および293T細胞を培養します。
  3. 10 cmの皿で細胞を増殖させ、コンフルエントの場合は1:3〜1:5の比率で分割します。

7. 細胞感染と細胞選択

  1. 0.5 mLのlenti_dCas9-VP64_Blast (Addgene #61425) および0.5 mLのlenti_MS2-p65-HSF1_Hygro (Addgene #61426) を含むウイルス培地混合物に、標的細胞 (MCF7など) を直接播種します。8 μg/mL の臭化ヘキサジメトリンを添加して、感染効率を高めます。抗生物質選択の有効性を調べるためのネガティブコントロールとして、感染していない細胞のウェルを使用してください。
    注:ウイルス培地の量は、10 cmディッシュに6 mLウイルス培地、6ウェルプレートのウェルに1 mL、12ウェルプレートに0.5 mLを推奨します。
  2. 感染後24時間で、ブラストシジン(MCF7細胞の場合は5μg / mL)とハイグロマイシン(MCF7細胞の場合は200μg / mL)を含む新鮮な培地を細胞に加えます。.
  3. ネガティブコントロール細胞が死滅するまで、細胞を抗生物質選択培地に保管します。
    注:細胞株が安定するまでの時間は異なる場合があります。MCF7の場合、感染していない細胞が完全に死滅するまでに通常5〜7日かかります。実験の前に、さまざまな抗生物質濃度を使用した殺傷曲線を新しい細胞株で試験する必要があります。次のステップに細胞混合物を使用することは許容されますが、別の方法として、2つのエフェクタータンパク質の発現に関して均質な単一細胞コロニーを選択することがあります。得られた安定系統を、本論文ではSAMエフェクタ親系統(例:MCF7 SAMエフェクタ系統)と呼ぶ。特にそれらの効果を比較する場合は、異なるターゲティングまたは非ターゲティングgRNAによる感染には、共有のSAMエフェクター親細胞株を使用することが推奨されます。
  4. ウェスタンブロッティングを使用して、細胞が2つのエフェクタータンパク質を安定して発現しているかどうかを判断します(例を 図4Aに示します)。2つのmRNA(dCas9-VP64およびMS2-p65-HSF1、 図4B)の発現レベルを調べるための代替方法として、全RNAの逆転写とそれに続く定量的PCR(RT-qPCR)を使用します。
    注:2つのdCas9エフェクターのmRNAレベルを調べるためのプライマーは、 補足表1で入手できます。
  5. ステップ3.5で構築したgRNAのレンチウイルスを作製し、dCas9-VP64とMS2-p65-HSF1を二重に発現する安定SAM細胞株に個々のgRNAレンチウイルスを感染させます。ゼオシン(MCF7細胞の場合は100 μg/mL)をgRNAウイルス形質導入後24時間で培地に添加します。親SAM細胞株でノンターゲティングgRNA(NT-gRNA)を発現するネガティブコントロールを生成します。
    注:選択薬が目的の構成物に特異的であることを確認してください。

8. eRNAレベルを調べるためのRNA抽出と定量的RT-PCR

  1. NT-gRNAまたは標的gRNAのいずれかを発現するSAM細胞株から、RNA抽出キット38、または他のフェノールクロロホルムベースの方法を使用して全RNAを抽出します。RNA抽出には、6ウェルプレートの1ウェルで~80%のコンフルエントの細胞を使用します。
    注:市販の結合カラムまたはフェノールクロロホルム試薬のいずれかによってRNAを抽出した場合、eRNA検出の実践において有意差は観察されませんでした。
  2. 精製されたRNAから、メーカーのプロトコール39に従って、ランダムな六量体との逆転写反応により相補的なDNA(cDNA)を作製する。 補足表2の使用条件。
    注:eRNAの大部分は非ポリアデニル化1,2,4,9,10であるため、cDNAの生成にはランダムな六量体が日常的に使用されています。
  3. 評判の良いプライマー設計ツール(Primer 3など)を使用して、ターゲットeRNAを測定するRT-qPCR用のプライマーを設計します。プライマーが直列希釈されたcDNAを直線的に増幅し、予想されるqPCRサイクルの違いを示すかどうかを調べることにより、プライマーペアの増幅直線性をテストします。 補足表2の使用条件。
    注:RT-qPCRのプライマーは、新生RNA-seqの高度に転写された領域を標的とすべきであり、プライマーの直線性試験には、遭遇する可能性のあるすべてのeRNAレベルがテストされることを保証するために、広範囲のcDNA希釈を含める必要があります。線形性テストの例を 図5Aに示します。
  4. コントロール細胞(NT-gRNAを含むSAM細胞株)およびeRNA標的gRNA(NET1e gRNA#1など)を持つSAM細胞株(図6Aなど)でRT-qPCRを実施し、eRNA発現レベルを解析します。NET1e RNAのプライマーを補足表1に示します。補足表2の使用条件。  

9. dCas9 ChIPおよびqPCR

注:このステップは、特定のgRNAによるdCas9/SAM-gRNA複合体の標的エンハンサーへの結合を検証するためのオプションの実験です。この手順を実行することをお勧めしますが、すべてのgRNAをテストする必要はありません。 図 5B に示す例を参照してください。 補足表1に記載されているプライマーを参照してください。

  1. クロスリンクセル
    1. 培地を細胞から取り出し、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)に溶解した1%ホルムアルデヒドを加えます。10分間放置します。
    2. 2.5 Mグリシンを1:20の容量で添加して架橋をクエンチし、氷冷PBSで細胞を2回洗浄します。氷冷したPBS700μLを加え、細胞を1.5mLのチューブにこすり落とします。
    3. 2,000 x g で4°Cで5分間遠心分離します。 手順9.2に進むか、スナップフリーズして-80°Cで保存します。
  2. 超音波処理
    1. 新しいLB1、LB2、LB3バッファーを作成します。LB1:50 mM Hepes-KOH(pH 7.5)、140 mM NaCl、1 mM EDTA、10%グリセロール、0.5% NP-40、0.25% Triton-X 100および1x Protease阻害剤。LB2:10 mM Tris-HCl(pH 8.0)、200 mM NaCl、1 mM EDTA、0.5 mM EGTAおよび1x Protease阻害剤。LB3:10 mM Tris-HCl(pH 8.0)、100 mM NaCl、1 mM EDTA、0.5 mM EGTA、0.1% Na-デオキシコール酸、0.5% N-ラウロイルサルコシン、および1xプロテアーゼ阻害剤。実験前に、1x Protease inhibitorを新たにバッファーに補充してください。
    2. 1 mLのバッファーLB1を細胞ペレットに加え、ピペットウェルで4°Cで10分間回転させ、2,000 x g で4°Cで5分間遠心します。 上清を注ぎ取り、LB2バッファー1 mLを加え、4°Cで10分間回転させ、2,000 x g で4°Cで5分間遠心します。 上清を注ぎ、余分なLB2バッファーを取り除きます。バッファーLB3を300μL加えます。
    3. 適切なソニケーターシステムを使用して、クロマチンDNAを平均サイズ200~400 bpまで超音波処理し、断片化します。超音波処理後、30μLの10%Triton-X 100を加えてよく混ぜます。新しい細胞株を使用する場合は、適切な超音波処理時間をテストします。
    4. 14,000 x g で遠心分離してペレットを取り出します。上清を新しいチューブに移し、630 μL の LB3 と 70 μL の 10% Triton X-100 を合計 1 mL まで加えます。2 μgのCas9抗体を上清に加え、4°Cで一晩回転させます。
  3. 免疫複合体捕捉と逆架橋
    1. RIPAバッファー(50 mM HEPES pH 7.6、1 mM EDTA、0.7% Na-デオキシコール酸、1% NP-40、0.5 M LiCl)および溶出バッファー(1% SDSおよび0.1 M NaHCO3)を調製します。
    2. Protein GダイナビーズをPBS中の1% BSAで3回、LB3バッファーを1回洗浄します。
    3. 30 μLのProtein G ダイナビーズをサンプルに加え、4°Cで4時間インキュベートします。
    4. ビーズ免疫複合体を500 μLのRIPAバッファー6xで洗浄します。ビーズを乾かさないでください。
    5. ビーズ免疫複合体をTEバッファーで一度洗浄します。バッファーを取り外します。
    6. 200 μLの溶出バッファーをビーズ免疫複合体およびボルテックスに加えます。次に、65°Cに設定された温度調整可能な加熱シェーカーに入れ、600rpmで6〜16時間振とうして逆架橋します。
  4. DNA抽出
    1. シェーカーからチューブを取り外し、ビーズを短時間回転させて磁気スタンドに置きます。上清200μLを新しいチューブに移し、TEバッファー200μLを加えます。
    2. 1 μLのRNase A(1 mg/mL)をチューブに加え、37°Cで1時間インキュベートします。
    3. 1時間のインキュベーション後、2 μLのプロテイナーゼK(20 mg/mL)をサンプルに加え、65°Cで2時間インキュベートします。
    4. 短時間遠心分離し、フェノール-クロロホルム-イソアミルアルコール混合物400μLを加えます。よく混合し、10,000 x gで5分間遠心分離します。
    5. 上層の400μLを、16μLの5 M NaClと1 μLのグリコーゲン(20 μg/μL)を入れた1.7 mLチューブに移し、よく混合します。
    6. 100%エタノール800μLを加え、-20°Cで一晩放置します。
    7. 翌朝、チューブを4°C、14,000 x g で15分間遠心分離します。
    8. 上清を取り除き、ペレットを1mLの70%エタノールで洗浄します。14,000 x g で10分間スピンダウンします。
    9. エタノール、空気乾燥ペレットを除去し、50 μL の TE (10 mM Tris-HCl、pH 8.0、1 mM EDTA) に再懸濁します。
  5. ChIP-qPCRを実施して、一対のエンハンサーコアターゲティングプライマーによるSAM複合体の標的部位への動員を調べます。ネガティブコントロールとして無関係な領域を標的とするプライマーペアを使用します。

10. 細胞増殖アッセイおよびeRNA過剰活性化のその他の機能試験

  1. 非標的gRNAまたはeRNA標的gRNAを発現するSAM細胞株をトリプシン処理し、96ウェルプレートでウェルあたり~3,000個の細胞をプレート化します。
  2. 生細胞イメージャーまたはその他の方法(細胞計数、水溶性テトラゾリウム塩-1アッセイなど)を使用して細胞増殖を測定します。
  3. 半値阻害濃度(IC50)を使用して、SAM15によるNET1e過剰発現の有無にかかわらず、細胞内の特定の抗がん剤に対する細胞応答をテストします。
    注:乳がん細胞の細胞増殖アッセイおよび薬剤感受性試験の結果は、NET1e15と呼ばれたNET1遺伝子に隣接して転写されたeRNAの過剰発現後に提示されます。他のアッセイは、各特定のプロジェクトのニーズに基づいて、細胞レベルまたは生物レベルで実施できます。

結果

図 1 は、このプロトコルの全体的なワークフローを示しています。私たちは、乳がんで過剰発現する代表的なeRNAであるNET1e15に着目し、SAMシステムを使用して、遺伝子発現、細胞増殖、がん薬物応答の調節におけるその生物学的役割を活性化し、研究しました。このNET1エンハンサーでは、転写されたeRNA転写産物(<...

ディスカッション

私たちのデータに基づいて、SAMシステムは、細胞増殖や薬剤耐性などの細胞表現型を調節するeRNAの役割を研究するのに適していると結論付けています。しかし、以下の理由により、堅牢なeRNAの活性化には慎重なgRNA設計が必要です。まず第一に、各特定の細胞株/タイプにおけるeRNAの転写開始部位(TSS)は、あまり明確に注釈されていません。このため、エピゲノム情?...

開示事項

内容は著者の責任であり、必ずしもテキサス州がん予防研究所の公式見解を表すものではありません。

謝辞

この研究は、WL(テキサス州がん予防研究所、CPRIT RR160083およびRP180734;NCI K22CA204468;NIGMS R21GM132778;テキサス大学UTスターズ賞。およびウェルチ財団AU-2000-20190330)、およびJ.L.へのポスドクフェローシップ(UTHealth Innovation for Cancer Prevention Research Training Program Post-doctoral Fellowship、CPRIT RP160015)。私たちは、現在のフィギュアの一部がクリエイティブ・コモンズ・ライセンス(https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/)に従って採用された元の公開15 を認めます(変更あり)。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
BlasticidinGoldbioB-800-100
BsmBI restriction enzymeNew England BioLabs Inc.R0580S
Cas9 mAbActive Motif61757Lot: 10216001
Deoxynucleotide (dNTP) Solution MixNew England BioLabs Inc.N0447S
Dulbecco’s Modified Eagle MediumCorning10-013-CM
Dynabeads Protein GThermo Fisher Scientific65002
EDTAThermo Fisher ScientificBP118-500
EGTASigmaE3889
Fetal Bovine SerumGenDEPOTF0900-050
GlycogenThermo Fisher Scientific10814010
Hepes-KOHThermo Fisher ScientificBP310-100
Hexadimethrine BromideSigmaH9268
Hygromycin BGoldbioH-270-25
IGEPAL CA630SigmaD6750
IncuCyte live-cell imagerEssen BioScienceIncuCyte S3 Live-Cell Analysis System
lenti_dCAS-VP64_BlastAddgene61425
lenti_gRNA(MS2)_zeo backboneAddgene61427
lenti_MS2-p65-HSF1_HygroAddgene61426
LiCLSigmaL9650
Lipofectamine 2000Thermo Fisher Scientific11668-500
NaClSigmaS3014
Na-DeoxycholateSigmaD6750
NaHCO3Thermo Fisher ScientificBP328-500
N-lauroylsarcosineSigma97-78-9
Opti-MEM Reduced Serum MediumThermo Fisher Scientific31985070
PES syringe filterBASIX13-1001-07
Protease Inhibitor Cocktail TabletRoche Diagnostic11836145001
pSpCas9(BB)-2A-PuroAddgene62988
Q5 High-Fidelity DNA PolymeraseNew England BioLabs Inc.M0491S
Q5 Reaction BufferNew England BioLabs Inc.B9027S
Quick-DNA MiniprepZYMO ResearchD3025
Quick-RNA MiniprepZYMO ResearchR1054
Restriction enzyme bufferNew England BioLabs Inc.B7203S
RT-qPCR Detection SystemThermo Fisher ScientificQuant Studio3
SDSThermo Fisher ScientificBP359-500
SonicatorQsonicaQ800R2
Sso Advanced Universal SYBR Green SupermixBio-Rad Laboratories1725274
Stbl3 competent cellThermo Fisher ScientificC7373-03
Superscript IV reverse transcriptThermo Fisher Scientific719000
Surveyor Mutation Detection KitsIntegrated DNA Technologies706020
T4 DNA LigaseNew England BioLabs Inc.M0202S
T4 DNA Ligase Reaction BufferNew England BioLabs Inc.B0202S
TE bufferThermo Fisher Scientific46009CM
Thermal cyclerBio-Rad LaboratoriesT100
ThermomixerSigma5384000020
ZeocinThermo Fisher Scientificant-zn-1p

参考文献

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