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要約

ここでは、2000年代初頭にマルモラシュタイン、ピーチー、および同僚が最初に記述したDC-ERGとして知られている技術を用いて、マウスにおける網膜色素上皮(RPE)の光誘発電気応答を記録する方法を提示する。

要約

網膜色素上皮(RPE)は、網膜と絨毛キャピラリスの間に戦略的に位置する細胞の特殊な単層であり、光受容体の全体的な健康と構造的完全性を維持します。RPEは、極偏光され、アピカルに、そして基底位置の受容体またはチャネルを示し、水、イオン、代謝物、およびいくつかのサイトカインを分泌するベクター輸送を行う。

インビボでのRPE機能の非侵襲的な測定は、直接結合されたERG(DC-ERG)を使用して行うことができます。DC-ERGの背後にある方法論は、Marmorstein、Peachey、およびカスタマイズされた刺激記録システムを使用して、後に市販のシステムを使用して実証された研究グループによって開拓されました。DC-ERG技術は、ハンクの緩衝塩溶液(HBSS)で満たされたガラス毛細血管を使用して、感光体活性によるレリンタル空間の光誘発濃度変化から引き出されるRPEの遅い電気応答を測定する。長時間の光刺激とDC-ERG記録の長さは、それがドリフトやノイズに対して脆弱になり、使用できる録音の低収率をもたらします。ここでは、HBSSと電極ホルダーの外気に起因する気泡を減らす/除去するために真空圧を使用することにより、ノイズを低減しながら、記録の安定性を向上させる迅速で信頼性の高い方法を提示します。さらに、電源ラインのアーチファクトは、電圧レギュレータ/パワーコンディショナを使用して減衰されます。市販のERGシステムに必要な光刺激プロトコルと、C波、高速振動、光ピーク、オフレスポンスのDC-ERG成分の分析に必要な光刺激プロトコルが含まれています。記録の改善された容易さおよび急速な分析のワークフローのために、この簡易な議定書はRPE機能、疾患の進行、および薬理学的介入の評価の加齢に関連する変化を測定するのに特に有用である。

概要

網膜色素上皮(RPE)は眼の後部セグメントに並び、網膜恒常性1を維持するために重要な機能を発揮する特殊な細胞の単層である。RPEは、可視周期2と呼ばれるプロセスで光子捕捉視覚顔料を再生することによって、小屋外セグメント先端3の日経食類に参加することによって、光受容体と絨毛キャピラリ4,5との間の栄養素および代謝産物の輸送において光受容体を支持する。RPE機能の異常は、加齢黄斑変性症6、レーバーの先天性アマウロシス7、8およびベストビテッラ状黄斑ジストロフィー9のような多数のヒト網膜疾患の根下にある。ドナー眼組織は研究目的のためだけに得ることがしばしば困難であるので、遺伝子組み換えのある動物モデルは、10,11の疾患の発症を研究する別の方法を提供することができる。さらに、CRISPR cas9技術の出現と応用により、ゲノム導入(ノックイン)または欠失(ノックアウト)が、以前の遺伝子標的化技術12の限界を超える単純なワンステッププロセスで可能になりました。新しいマウスモデル13の可用性のブームは、非侵襲的にRPE機能を評価するために、より効率的な記録プロトコルを必要とする。

RPEの光誘発電気応答の測定は、直接結合された電気レティノグラム(DC-ERG)技術を用いて達成することができる。この感光体(a-wave)およびバイポーラ(b波)細胞応答を測定する従来のERG記録と組み合わせて使用すると、DC-ERGは、RPEの応答特性が、レチナル変性15、16、17、またはRPE機能障害が感光体喪失に先行するかどうかでどのように変化するかを定義することができる。このプロトコルは、最初にDC-ERG技術16、18、19、20を開発したMarmorstein、Peachey、および同僚の仕事から適応した方法を記述し、再現性と使いやすさを改善する。

DC-ERG記録は、ノイズの中断や導入がデータの解釈を複雑にする可能性がある、取得時間(9分)が長いため、実行が困難です。この新しい方法の利点は、ベースラインが短時間で定常状態に達し、動物が麻酔から早期に目覚め、毛細血管の気泡形成を起こしにくい可能性を減らすことです。

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プロトコル

このプロトコルは、国立眼科研究所の動物ケアおよび使用委員会によって承認された動物研究プロトコルで概説されている動物ケアガイドラインに従います。

1. DC-ERG用光刺激プロトコルのインポート

注: 以下の指示に従って、DC-ERG の光刺激プロトコルを ERG システム ソフトウェア (表) にインポートします。プロトコルは0.5分前刺激間隔で構成され、その後に7分間の光のステップ(10 cd/m2)が続き、1.5分のポスト刺激間隔で終了する。10 cd/m2の光強度(1ログ10 cd/m2)は、WTマウス18,21におけるDC-ERGの全成分に対する最大応答の約半分を呼び起こすため選択された。c波および高速振動は、これらの電気応答の起源が十分に特徴付けられるため特に興味深く、インビトロRPEモデル(例えば、iPSC-RPE)で分離および研究することができる。他の光強度の適用は、追加の情報を抽出することができ、例えば、オフ応答は、明るい光刺激で極性の逆転を受け、この反転が起こる強度で違いを示す可能性があります。ユーザーは、自分の裁量で光強度の設定を自由に変更することができます。

  1. ERG システム ソフトウェアを開きます。
  2. [ データベース センター ] をクリックします。
  3. [ 新規作成 ] をクリックします (新しいデータベース ファイル名を指定します)。[ 保存 ] をクリックします。ポップアップ ボックスに "データベースが作成されました、新しいデータベース ファイルに接続しますか" と表示されます。[ はい] をクリックします。現在のデータベース名に新しいファイル名が反映されます。
  4. データベース コントロール センター ウィンドウで [ 転送 ] をクリックします。
  5. 補足ファイル 1: LightProtocols - 転送を選択します。EXP.[開く] をクリックします。
  6. プログレス バーの完了時に[ 閉じる ](データベース コントロール センター)をクリックします。
  7. 緑色の [スタート ] ボタンをクリックします。
  8. [患者の選択] ウィンドウで [新規] をクリックします。マウスモデルを説明する新しい患者の姓を作成し、生年月日(DOB、mm/dd/y)を入力し、性別(M/F)ボタンを適切な説明に切り替えます。[閉じる]をクリックして、実験の詳細を保存します。
  9. [ プロトコル] をクリックします。暗く適合する ERG および DC-ERG プロトコルが表示されるようになります。
  10. 最後に、Long Flash.col ファイルを次のフォルダ C:\ERG ユーザー ファイル\Long Flash.col に配置します。

2. 毛細管電極の準備

  1. セラミックタイル(材料表)を使用して1.5mmのガラス毛細血管を半分に切り、ガラスを採点し、テーブルを使用してきれいに割って物理的なカウンターフォースを提供し、ガラスを安定させます。
    注:必要に応じてカットエンドを鈍らせ。
  2. ブンゼンバーナー(材料表)を使用すると、火の上に鉗子を持ちながら、熱が毛細血管に小さな曲がりを作ることができます。

3. 毛細管電極の充填

  1. 真空デシケータをインラインフィルタ(材料表)を介して実験室の真空ラインに接続します。
  2. ハンクスのバランス塩溶液(HBSS)( 材料表)の 30 mLを開いた50 mL円錐形チューブに注ぎ、真空チャンバーに(キャップを取り外して)入れます。
  3. コンピュータと録音機器の電源を入れながら、真空をオンにしてHBSSの電源を切ります。
  4. 5\u201210分後に真空をオフにし、脱ガスしたHBSSを使用して、付属の25G針を通して12 mLの注射器を充填します。気泡を導入しないように特別な予防措置を取って電極ホルダーの基盤を満たすためにそれを使用してください。
    1. これを行うには、ねじねじキャップを取り外し、シリコーンゴムガスケットを通してシリンジ針を慎重にスライドさせてホルダーの裏壁(銀/塩化銀ペレット)に到達します。
      注: 銀/銀塩化物ペレットは、銀線を使用するホルダーよりも有利であり、より多くの表面積を提供し、安定した低ノイズベースラインを実現します。しかし、銀/塩化銀ペレットは、良好な接続を達成するために気泡から自由に液体界面を必要とします。そのため、このプロセス中に気泡を導入しないように細心の注意を払ってください。
    2. 徐々にHBSSを注入してマイクロ電極全体を充填し、注射針をゆっくりと引き込みます。ネジ付きキャップを再び取り付けますが、締め付けはしないでください。ギリンジ針を再挿入して、キャップ内の空きスペースをHBSSで埋めます。その後、ガラスの毛細管を水平に保持したまま、溶液が他の端から逃げるのを防ぎます。
    3. 曲がった端からガラスの毛細管を保持し、緩んだキャップを通して反対側の端をゆっくりと挿入し、スクリューキャップを所定の位置に締めます。
      注:HBSSで満たされたガラス電極は、マウスの目の潤滑を維持し、標準的な金ループ電極の使用で発生する角膜脱水を防ぎます。
  5. 気泡が流出できるように、キャピラリー電極を上向きに傾けた電極ホルダーを配置します。5\u201210分間真空を実行して脱気します。ガラスやプラスチック表面からガスが抜け出すと、電極ホルダーからHBSSが押し出されます。
  6. 停止し、ゆっくりと真空を解放します。前述のように電極ホルダーとガラスキャピラリを補充します。
    注:気泡はシリコーンゴムガスケットの上または近くに集まり、また、スレッドキャップの溝に隠すことができるので、これらの領域をバブルフリーに保つために特別な注意を払う必要があります。
  7. マイクロ電極ホルダーをカスタムメイドのTクリップ/磁気ボールジョイントスタンドに取り付けて固定します(図1A、インセット)。マイクロ電極ホルダーのカスタムスタンドを作るために、片側の黒いポリアセタールクリップを取り除いてTクリップ(5/16"-11/32"ODチューブ)#8(材料表)を修正します。磁気ボールジョイントのシリンダーベースを半分に加工して高さを調整します(材料表)。M3サイズのナットで磁気ボール取り付けネジに修正されたTクリップを固定します。
  8. マイクロ電極ホルダーを修正されたTクリップに入れ、綿の先端クリーニングスティック(材料表)を斜めで壊して作られた約1インチの先細り木製ハンドルをスライドさせてしっかりと固定します。希土類磁石シリンダーベースを使用して、カスタマイズされた電極ホルダーをステージの金属板にしっかりと配置し、180°軸上で360°回転を可能にします。

4. テスト電極

  1. 小さな容器(例えば、50 mL円錐管のキャップ)にHBSSを注ぎます。
  2. 完全に組み立てられたHBSS充填されたキャピラリー微小電極をHBSSを含むキャップにそっと下げて電極を事前平衡化し、同じHBSS内に針接地電極(尾/後脚)とAg/AgCl焼結ペレット参照電極(口)を配置して回路を完成させる(図1A)。
    注:薄暗い赤色のライトの下で、以降のすべての手順を実行します。赤い光の懐中電灯を使用して、マウスとキャピラリー電極を配置します。録音を開始する前に、すべての光源を完全にオフにすることを忘れないでください。
  3. テストするマウスを説明する適切な識別子(ファミリ名)を選択または作成し、次の順序に従って登録を完了して実行するDC-ERGプロトコルを選択します。
    1. [ プロトコル] をクリックします。 [DC-ERG]を選択します。[ 実行] をクリックします。ダイアログ ボックスがポップアップ表示されます:"現在の患者は XXX [DOB: XX/XX/XX) これは実行されているテストに対して正しいですか?"[ はい] をクリックします。その後、「ステップ1/6」に進みます。
  4. ファラデーケージのドアを閉めます。
  5. インピーダンスモードを表示するには、 インピーダンス をクリックし、口参照、テールグラウンド、および記録電極の値が許容可能であることを確認します( 図 1Bを参照)。
  6. ステップ(前方矢印)をクリックして ステップ 4/6「長いフラッシュなしの光」を選択して、ベースラインの安定性(ノイズとドリフト)をテストします。
    注:HBSSバスに電極を置いたときに観測されるドリフトの量は、一般的に安定化した後、80sあたり500μV未満であり、電極がマウスに接続されたときに観察されるドリフトと同等です。したがって、HBSS浴中の電極の電気的読み出しは、電極の状態の重要な指標である。ピークからピークまでのノイズは、一般にHBSS浴よりもマウスの場合は10\u201215%大きくなります。これはおそらく呼吸からの動きのアーティファクトの付加によるものである。
  7. [プレビュー] をクリックしてトレースの表示を開始します。トレースは、ピークからピークへの振幅<200 μVの低ノイズである必要があります。ベースラインに徐々にフェードするわずかなドリフト(<500 μV/80 s)は許容可能です(図1C)。

5. マウスと電極の位置決め

  1. 暗い適応のために換気の良いライトタイトボックスに一晩マウスを保管してください。
  2. ケタミン(80mg/kg)およびキシラジン(8mg/kg)の腹腔内注射によって動物を麻酔する。
  3. 角膜を麻酔するために局所的に0.5%プロパラカインHClの低下を適用するだけでなく、2.5%フェニレフリンHClと0.5%のトロピックアミドの低下は、瞳孔を拡張するために。
  4. 録音中に不注意なぴくぴくがガラスの毛細血管電極を乱さないように、マウスウィスカーをハサミでトリミングします。
    注: ERG システム内の DC-ERG 刺激プロトコルには、 ステップ (前方矢印) または ステップ (後方矢印) をクリックして選択できる、いくつかの組み込みの刺激ルーチンがあります。DC-ERG 記録を準備して実行するには、ソフトウェアのステップ 1、4、および 5 のみが必要です。
  5. ERGシステムソフトウェアで、正しい患者が選択されていることを確認します。緑色の [プロトコル] ボタンをクリックします。[ プロトコルの説明] で 、[DC-ERG] を選択します。次に、[ 実行] をクリックします。 [はい] をクリックして、正しいテストが実行されていることを確認します。
  6. ステップ 1/6 指定赤信号刺激を使用して、ドーム内の赤色光を点灯し、インピーダンスの変化を観察しながらマウスと電極を配置します。
  7. 熱くした記録テーブルの上にマウスを置き、鉗子を使用して後脚の皮膚を慎重にテントに入れる。針の電極を片手にしっかりと持ち、皮下に後脚に挿入して所定の位置に固定します。
  8. 目印Ag/AgCl電極(材料表)を口の中に入れて、焼結したペレットが後頬に沿って置かれ、歯の後ろに所定の位置に保持されるようにします。
    注: 金線電極は、インピーダンス特性が異なり、ピークからピークまでのノイズが増すため、口の参照電極として使用しないでください。
  9. マウスの目に毛細血管を配置する前に、電極ホルダーをガラスキャピラリーを垂直に保持し、電極ホルダーを人差し指でフリックして、導入された気泡を除去します。25G針をシリンジに取り付けてHBSSでチップを充填し、先端にエアバブルが閉じ込められないように点検します。HBSS充填キャピラリーの開いた先端が角膜に優しく接触するように、電極ホルダーを立ててください。
  10. 潤滑剤の目のゲルディスペンサーを逆に保持し、初期の滴を捨てて気泡を導入しないように特別な注意を使用してください。各目に潤滑剤の目のゲルを滴下して、導電性を維持し、記録中の乾燥を防ぎます。

6. DC-ERG記録

  1. ステップ 4/6「長いフラッシュなしの Li」を選択するには、 ステップ (前方矢印) をクリックします。
  2. インピーダンスをクリックします。インピーダンスチェック画面を使用して、左右の目の抵抗を調べます。各眼の記録電極のインピーダンス値は、類似していると予想されます(〜39 kΩ)。接地電極と基準電極の両方のインピーダンス値は、10 kΩ未満と予想されます。
  3. [ プレビュー ]をクリックして、左右の目のトレースを表示します。安定したベースラインが達成されるまで待ちます(<10分)。[ 停止 ]をクリックしてトレースプレビューを終了します。
    注:録音中のドリフト方向や異常なノイズの急激な変化は時間とともに改善されず、注意が必要な毛細管電極を識別する必要があります。最も可能性の高い原因は、電極の先端に導入された気泡である。先端にHBSSを補充します。ベースラインを確認するには、もう一度 [プレビュー] をクリックします。
  4. ステップ(前方矢印)をクリックしてステップ5/6「長いフラッシュ10 cd 7分」を選択します。
  5. [実行] をクリックして記録を開始します (図 1D)。

7. データエクスポート

  1. エクスポートするマウス記録を説明する「患者」(家族名)を選択します。
  2. [ 古いテスト] をクリックします。
  3. [ プロトコルの説明] で [DC-ERG]を選択します。緑色の [ロード ]ボタンをクリックして、以前に取得したデータをロードします。
  4. ステップ5/6 「長いフラッシュ10 cd 7分」に進むには、 ステップ (前方矢印)をクリックしてください。
  5. [ エクスポート] をクリックします。
  6. ファイル名を指定します (ファイル名.csvなど)。有効なファイル名は、文字、数字、またはアンダースコアの後に文字で始まる必要があります。特殊文字やハイフンは使用しないでください。データ分析プログラム (DCERG_Analysis.exe) では、テーブル項目が変数名の要件を満たしている必要があります。
  7. [ データ テーブル] の横にチェックマークを付けます。[区切り記号] の横にある [タブ] を選択します。チェックマークを付ける (タイトル、 縦方向) 、すべて含める (ステップ、 ステップ、結果 、 データ列 ) (コンテンツ、 結果、 スイープ)、およびフォーマット (ファイル) 。
  8. 次に、[ エクスポート ] をクリックします (図 1E)。これにより、*.csvファイルがC:\マルチフォーカルフォルダに保存されます。

8. データ分析

  1. 適切なランタイムインストーラをダウンロードしてインストールする (資料一覧)
  2. DCERG_Analysis.exeインストーラをダウンロードしてインストールします。
    注 : このコマンドは、DC-ERG コンポーネントの分析を実行するスクリプトをインストールし、[スタート] メニュー] フォルダでプログラムを実行するためのショートカットを作成します。
  3. [ スタート] メニュー > [プログラム] フォルダに作成したショートカット を クリックします。
  4. 分析用にエクスポートされたデータ ファイル (*.csv) を選択します。複数のファイルを選択するには、Ctrl キーを押しながらマウスを左クリックします。
    注: 実行可能ファイルは 2 種類のプロットを生成します: 1) 生データは測定されたドリフトを示す最適な線でプロットされます。2)ドリフト補正応答は、移動平均(〜5秒のスパン)で平滑化された後にプロットされます。このプロットから、DC-ERG成分の振幅とピークまでの時間が特定されます:c波、高速振動、光ピーク、およびオフ応答。その後、データはテーブル形式でエクスポートされ、各シートが異なるマウス記録に対応するExcelにエクスポートされます。これらのシートの後には、(i) DC-ERG振幅 (mV) がコンパイルされた 2 つの要約シートが続きます。(ii) コンパイルされたDC-ERG時間ピーク(ライトオンセット、t = 0分)。

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結果

図2はmiR-204 ko/ko cre/+(条件付きKO)マウスと野生型(WT)マウスからのサンプルデータセットです。MiR-204 ko/ko cre/+は、網膜色素上皮におけるマイクロRNA204の条件付きノックアウトを有するマウスである。これらのマウスは、VMD2-CREマウス23を用いてフロックスmiR-204マウス(NEIGEFによって産生される)22を交流することによって生成される。MiR-204?...

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ディスカッション

重要なステップ

良好なDC-ERG記録は、アウトガスや温度変化に非常に敏感であるため、アーティファクトや不要なドリフトを作成する気泡から自由である安定した電極を必要とします。マウスの記録を進める前に、HBSSバス溶液に電極を配置する際に安定したベースラインを達成することが不可欠です。小さな気泡は、キャピラリー電極の基部またはシリコン?...

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開示事項

著者らは開示するものは何もない。

謝辞

この作品はNEIの壁内資金によって支えられた。著者らは、シェルドン・ミラー博士の科学的指導、技術的助言、RPE生理学と疾患の専門知識について心から認めている。著者らは、マウスコロニーを管理してくれたメーガン・コペラと動物ケアスタッフ、タルン・バンサル博士、レイモンド・ジョウ博士、元王博士に技術支援を求めた。

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資料

NameCompanyCatalog NumberComments
Ag/AgCl (mouth) ElectrodeWPI IncEP1Mouth reference electrode for mouse
Ceramic TileSutter InstrumentCTSUsed to cut the glass capillary tube to an appropriate size
Cotton Tipped Cleaning StickPuritan Medical Products867-WC No GlueTo be used as a spacer to improve the fit of the electrode holder assembly
Electroretinogram (ERG) SystemDiagnosys LLCE3 SystemVisual electrophysiology system to diagnose ophthalmic conditions in vision research and drug trials
Bunsen BurnerArgos TechnologiesBW20002460Or equivlaent to shape glass under flame
Glass Capillary Tube (1.5 mm)Sutter InstrumentsBF150-75For filling with HBSS and making contact to the cornea
Hank’s Buffered Salt Solution (HBSS)Thermo Fisher Scientific Inc14175-095Commercially available. Maintain at RT
In-Line FilterWhatman6722-5001To protect vacuum pump from aerosols
Low Noise Cable for Microelectrode HoldersWPI Inc5372Suggested for improving the length and placement of the cables and electrode holder assemblies
Magnetic Ball JointWPI Inc500871For magnetically positioning the electrode holder assembly on the stage
MatLabMathworksMatLab: For editing the analysis software
MatLab Curvefit ToolboxMathworksToolbox for MatLab (only required for editing the analysis software)
MatLab CompilerMathworksToolbox for MatLab (only required for editing and re-releasing the analysis software)
MatLab Runtime version 9.5MathworksR2018b (9.5)Required to run the analysis software: https://www.mathworks.com/products/compiler/matlab-runtime.html
Microelectrode Holders (45 degrees)WPI IncMEH345-15For holding the capillaries
Needle (25 ga)Covidien8881250313For filling the capillary tubes with HBSS
Needle (ground) ElectrodeRhythmlink13mm - one elctrodeSubdermal needle electrode (ground) for mouse (13mm long, 0.4mm diameter needle, 1.5m leadwire)
Regulator/Power ConditionerFurmanP-1800Or equivalent to remove DC-offset from noise introduced through power line
Syringe (12 mL)Monoject1181200777For filling the capillary tubes with HBSS
T-clipCole-Parmer06852-20For electrode holder assembly
Vacuum DesiccatorBel-Art420120000Clear polycarbonate bottom & cover
Pharmacological treatment
Lubricant eye gelAlcon0078-0429-47Helps lubricate corneal surface and maintain electrical contact with capillary electrodes
Phenylephrine Hydrochloride 2.5%Akorn17478-201-15Short acting mydriatic eye drops (for pupil dilation)
Proparacaine Hydrochloride 0.5%Akorn17478-263-12Local anesthetic for ophthalmic instillation
Tropicamide 0.5%Akorn17478-101-12Short acting mydriatic eye drops (for pupil dilation)
XylazineAnaSedsc-362949RxAnalgesic and muscle relaxant
Zetamine (Ketamine HCl)VetOne501072Anesthetic for intramuscular injections

参考文献

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