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要約

本プロトコールでは、RNA-Seqに基づくプリンヌクレオシダーゼ(PN,EC:3.2.2.1)の遺伝子マイニングおよび配列解析の方法について説明しました。ProtProm解析を適用して、PNのユニークな二次構造と三次構造を示しました。さらに、トランスクリプトームから PN 遺伝子をクローニングし、RNA-Seqの結果の信頼性を検証しました。

要約

キャタピラ菌(Ophiocordyceps sinensis)は、最も価値のある伝統的な漢方薬(TCM)の1つであり、アデノシンなどの有効成分を豊富に含んでいます。アデノシンは、さまざまな抗腫瘍作用および免疫調節作用を有する生物学的に有効な成分と考えられています。アデノシン生合成におけるプリンヌクレオシダーゼ(PN)のメカニズムをさらに解明するために、キャタピラ菌のRNA-Seqデータベースに基づいてPNをコードする遺伝子のマイニングに成功し、さらに解析を行いました。 PN の完全長cDNAは855 bpで、284個のアミノ酸をコードしていました。BLAST分析では、NCBIのヌクレオシド加水分解酵素と85.06%の最も高い相同性が示されました。ProtRom分析の結果、相対分子量は30.69 kDa、等電点は11.55でした。PNの二次構造は、Predict Proteinによって予測されました。その結果、アルファヘリックス構造が28.17%、ストランド構造が11.97%、ループ構造が59.86%を占めました。さらに、 PN 遺伝子をトランスクリプトームからさらにクローニングし、アガロースゲル電気泳動で検出して検証しました。この研究は、真菌TCMにおけるアデノシン生合成の遺伝的調節について、より十分な科学的根拠と新しいアイデアを提供します。

概要

真菌の伝統的な中国医学(TCM)は豊富な種資源を持っています1,2。キャタピラ菌(Ophiocordyceps sinensis)はよく知られた真菌TCMであり、革新的な医薬品の供給源と見なされています3,4。キャタピラ菌は、中国南西部のチベット高原で見られるワームと菌類の複合混合物であり、Hirsutella sinensisはキャタピラの体に寄生しています5。現在、H. sinensisは、分子的および形態学的生物学的証拠6,7によると、キャタピラ菌の唯一のアナモルフとして報告されており、野生のイモムシ菌8と比較して、関連する毒性や同様の臨床効果が少ない。その結果、H. sinensisは、ヌクレオシド、多糖類、エルゴステロールなど、さまざまな生物学的に有効な成分を保有しており、肝障害の修復などの広範な薬理学的効果を有することが明らかになった9,10,11。アデノシンは、毛虫菌から単離された典型的な有効成分であり、プリンアルカロイド12の一種です。アデノシンには、抗腫瘍活性、抗菌活性、免疫調節活性など、さまざまな生物学的活性があります13,14。残念ながら、アデノシンの生合成メカニズムと関与する主要な遺伝子はまだ不明です15,16。

アデノシンは、主に腫瘍微小環境における免疫抑制作用を通じてその抗腫瘍効果を示します17。アデノシンは免疫抑制機能を示し、これは損傷後の組織修復を開始し、過剰な炎症から組織を保護するために重要であると報告されました18,19。さらに、アデノシンを介した免疫の抑制は、がんの免疫サーベイランスを重篤に損なうだけでなく、腫瘍の成長を促進する可能性があることが実証されました20。したがって、抗腫瘍におけるその広範な応用のために、アデノシン生合成のメカニズムを研究することが急務です。

発現遺伝子とその発現量の全体像は、トランスクリプトーム21の次世代シーケンシングによって体系的に行えると報告されています。さらに、トランスクリプトームシーケンシングと分析を適用して、有効成分の生合成経路に関与する遺伝子を予測し、さらに異なる生合成経路の相互作用を調査しました22。プリンヌクレオシダーゼ(PN、EC 3.2.2.1)は、プリンヌクレオシドの配糖体結合を糖および塩基に加水分解することができるプリンヌクレオシドに対する基質特異性を有するヌクレオシダーゼのクラスである23。通常、アデノシン生合成において重要な役割を果たします。真菌TCMにおけるアデノシンの生合成経路が予測されたことが報告されました。qPCRと遺伝子発現は、アデノシン蓄積の増加が PN 遺伝子のダウンレギュレーションの結果であることを示し、 PN 遺伝子がアデノシン生合成に重要な役割を果たしている可能性があることを示しました15。したがって、アデノシン生合成における PN のメカニズムを早急に解明する必要があります。しかし、PNの配列情報とタンパク質構造、および真菌TCMのアデノシン生合成に関与する他の主要な遺伝子は、これ以上研究されていません。

本研究では、キャタピラ菌のRNA-Seqデータから PN 遺伝子の新規配列をマイニングし、遺伝子クローニングにより検証しました。さらに、PNの分子特性とタンパク質構造を包括的に解析し、アデノシン生合成の遺伝子制御に新たな方向性とアイデアを提供することができました。

プロトコル

注:キャタピラー菌(H. sinensis)のアナモルフ菌株が私たちの研究室に寄託されました。 大腸菌 DH5は、北京中医薬大学深セン病院で保存されました。

1. RNA-Seqの準備

  1. 菌糸体の収穫
    1. H. sinensisの発酵のための発酵培地を準備します:粉末コーン粉(1%)、カイコの蛹(1.5%)、酵母抽出物(0.5%)、トリプトン(1%)、グルコース(1.5%)、ふすま(1.5%)、デキストリン(0.5%)、KH2PO4(0.02%)およびMgSO4(0.01%)。
    2. スケールアップ培養用の10%発酵培地による接種を準備します(100 mL培地ごとに10 mL培地を追加します)。ロータリーシェーカーで150rpmの16°C条件で10日間水中発酵を行います。
    3. 毛虫菌のアナモルフの菌糸体を無性生殖し、10日間収穫します。発酵培地を遠心分離し、遠心分離後に上清を廃棄します。超純水100mLを3回加えて菌糸体を懸濁し、遠心分離により上清を除去します。洗浄した菌糸体を液体窒素を使用して粉末に粉砕します。
  2. RNA-配列
    1. 製造元のプロトコル(材料表)に従ってキャタピラ菌のアナモルフの全RNAを抽出し、さらにサンプルをRNaseフリーDNase I(材料表)で処理します。
    2. total RNA PolyATtract mRNA Isolation SystemsからmRNAを単離し、メーカーのプロトコルに従ってオリゴ(dT)入りビーズを使用してpoly(A) mRNAを単離します(材料表)。
    3. 短いフラグメントをテンプレートとして取り、メーカーのプロトコルに従ってランダムなヘキサマープライマーでファーストストランドcDNAを合成します(Table of Materials)。メーカーのプロトコルに従って二本鎖cDNAの合成を行います。
    4. その後、Ultra RNA Library Prep Kitを使用して、製造元のプロトコルに従ってシーケンシングライブラリを生成します(材料表)。
    5. 短いフラグメントは、メーカーのプロトコル(Table of Materials)に従ってPCR抽出キットで精製し、EBバッファーでそれぞれ分離します。
    6. 短いフラグメント(閾値300 bp)を、アガロースゲル電気泳動の結果に従ってシーケンシングアダプターで接続します。
    7. その後、適切なフラグメントから選択したテンプレートを使用してPCRで増幅を行います。
    8. Illumina HiSeq 4000 によるライブラリのシーケンシングを、メーカーのプロトコルに従ってペアエンドシーケンシングで行いましょう。生のシーケンスデータからダーティな生のリードをフィルタリングして、クリーンなデータを取得します。 denovo アセンブリを採用して、どちらの端でも拡張できない最小のNsを持つUnigenesを取得します。
    9. blastxによるUnigene配列をnr、Swiss-Prot、KEGG、COGなどのタンパク質データベースにアラインメントします(e-value < 0.00001)。与えられたUnigenesと最も高い配列類似性を持つタンパク質を、そのタンパク質機能アノテーションとともに取得します。RNA-Seqの結果をまとめます(Table of Materials)。
      注:上記の手順では市販のキットを使用し、すべての操作はメーカーのプロトコルに従って行われました。

2. プリンヌクレオシダーゼの遺伝子マイニング

  1. RNA-Seqの結果ファイルをコンピュータにダウンロードします。RNA-Seqの結果から、アセンブルされたUnigenesのアノテーション結果ファイルを見つけます。
    注:ペアエンドリードは、足場のギャップ充填に再び使用され、どちらの端でも拡張できない最小のNsを持つ配列を取得しました。このような配列はUnigenesとして定義されました。Unigene annotationは、Unigeneの発現情報と機能アノテーションを提供します。
  2. 注釈ファイルのパスを開き、検索バーにmap 00230と入力します。次に、アノテーションファイルのKEGG分類でプリン代謝(map00230)を検索します。
  3. 注釈付きmap00230でEC:3.2.2.1 (PN)を赤とマークし、PNに注釈が付けられたアセンブルされたUnigenesがあったことを示します。
    注:EC番号3.2.2.1をクリックした後にPNに注釈が付けられ、注釈付きmap00230に示されている3つのUnigene(Unigene10777、Unigene14697、およびUnigene17827)がありました。
  4. EC番号3.2.2.1をクリックし、注釈付きのUnigenes情報を表示します。
  5. LTFViewerソフトウェアを開き、 Ctrl-O ショートカットを使用してUnigene.faファイルをインポートし、アセンブルされたUnigeneの配列情報を表示します。
  6. Unigene10777、Unigene14697、Unigene17827の配列情報を Ctrl-F ショートカットで検索します。
  7. Unigene10777、Unigene14697、Unigene17827の配列情報をCtrl-CおよびCtrl-Vショートカットでダウンロードします。
  8. Unigene10777 と Unigene17827 を、オープンリーディングフレーム (ORF) のシーケンスが短すぎるように排除します。
    注:基本的なシーケンス情報はLTFViewerソフトウェアに表示されていました。
  9. Unigene14697 (サイズ 1,705 bp、ギャップ 0 0%) を適切な長さの ORF で選択し、さらなる研究に利用してください。

3. バイオインフォマティクス解析

  1. PN遺伝子のORFをORFfinder(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)で解析します。
    1. シーケンスをボックスに貼り付けます。パラメータを次のように選択します、最小ORF長(nt):75、遺伝暗号:1.標準、使用するORF開始コドン:ATGのみ。 「Submit 」ボタンをクリックして、ORF情報を取得します。
  2. ProtParamツール(http://us.expasy.org/tools/protparam.html)を使用して、理論分子量と等電点を計算します。
    1. アミノ酸配列(1文字のコード)をボックスに貼り付け、[ パラメータの計算 ]ボタンをクリックして結果を取得します。
  3. SignalP5.0 Server (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/) を適用して、シグナルペプチドを予測します。
    1. タンパク質配列をFASTA形式で入力します。次のようにパラメータを選択します、生物グループ:Eukarya、出力形式:ロング出力。 [送信 ]ボタンをクリックして結果を取得します。
  4. BLAST(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)を適用して、タンパク質配列の相同性を解析します。
    1. Protein Blastボタンをクリックし、ボックスに配列を入力します。パラメータをデータベース:非冗長タンパク質配列(nr)、アルゴリズム:blastp(タンパク質-タンパク質BLAST)として選択します。[Blast]ボタンをクリックして結果を取得します。
  5. Clustal Xプログラム(http://www.clustal.org/)を適用して、さまざまな真菌からのPNの酸配列を整列させます。
    1. ファイルをアップロードするか、シーケンスをボックスに貼り付けます。パラメータを次のように設定します。出力形式は、ClustalW と文字数です。 [送信 ]ボタンをクリックして結果を取得します。Clustal XはFASTA形式のファイルのみを認識でき、ファイルのパスには英語の名前のみを含めることができます。
  6. MEGA 4.0(https://www.megasoftware.net/mega4/)を使用して系統樹を実行します。
    1. ソフトウェアを開き、[ ファイル ]ボタンをクリックしてシーケンスをアップロードします。データタイプとして Protein Sequencesを選択し、 OK ボタンをクリックして次のステップに進みます。続いて、[ Phylogeny ]ボタンをクリックして[ Bootstrap Test Phylogeny]を選択し、[ Neighbor Joining Tree]をクリックします。デフォルトのパラメータを選択し、[ Compute ]ボタンをクリックして結果を取得します。
  7. InterProScan(http://www.ebi.ac.uk/interpro/search/sequence/)を適用して、PNの触媒ドメインを特定します。
    1. ボックスにシーケンスを入力します。デフォルトのパラメータを選択し、[ 検索 ]ボタンをクリックして結果を取得します。
  8. Predict Protein(http://www.predictprotein.org/)をオンラインで適用して、タンパク質の二次構造を予測します。
    1. ボックスにアミノ酸配列(1文字のコード)を入力し、 predictProtein ボタンをクリックして結果を取得します。
  9. PN24の3次元構造を評価するためのオンラインツールSWISS-MODEL(http://swissmodel.expasy.org/)を適用します。
    1. 「モデリングの開始」ボタンをクリックし、ターゲットシーケンスをボックスに貼り付けます。プロジェクトのタイトルと電子メールの情報を入力し、[テンプレートの検索]ボタンをクリックして結果を取得します。

4. 遺伝子クローニングと組換えプラスミドの構築

  1. リバースプライマーに NotI部位が含まれ、フォワードプライマーに EcoRI部位があるプライマーを設計しました。
  2. フォワードプライマーをAGAGAATTCATGACCATGCCAGATTCT (5'–3')、リバースプライマーをATAGCGGCCGCCTAACGCGTGCCGTTAGA (5'–3') by Primer Expressとして表示します。
  3. PN遺伝子のクローニングのために、イモムシ菌のプライマーとcDNAを調製します。PCRは、95°Cで5分間の予変性、94°Cで45秒間の変性、55°Cで60秒間の再生、72°Cで90秒間の延長、35サイクルの繰り返し、および72°Cで10分間の延長としてPCRを実施します。
  4. PCRフラグメントを取得し、アガロースゲル電気泳動で検出して検証します。PCRフラグメントをpMD18-Tでライゲーションします。PMD18-Tのライゲーションシステムは、PMD18-T1 μL 1 1 μL、Solution1 4 μL Solution1、および5 μLの標的遺伝子で行います。条件を次のように設定します:16°Cで16時間維持し、65°Cで15分間不活性化します。
  5. 運用マニュアル25に従って、組換えプラスミドをコンピテント大腸菌JM109細胞に移す。
  6. 組換えpMD18-T/PN プラスミドとベクターppic9Kを EcoRIおよび NotIで消化し、T4 DNAリガーゼによる消化後にフラグメントをライゲーションします。
  7. さらなる異種発現のために、組換えプラスミドppic9K/PN を構築します。

結果

PN遺伝子のORF配列の長さは855 bpで、284個のアミノ酸をコードし、計算分子量は30.69 kDa、予測等電点は11.55であり、PNがアルカリ性タンパク質であることを示しています。シグナルペプチドを同定するためにSignalP4.0 Serverを適用したところ、PNにはシグナルペプチドが存在しないことが示された。さらに、BLASTP検索の結果、キャタピラ菌由来のPNは、Purpureocillium l...

ディスカッション

人間の健康は、腫瘍、心血管、脳血管疾患などの一連の主要な医学的問題に直面しています26,27。TCMは、その豊富な種資源と有効成分の多様な構造と機能により、革新的な医薬品の研究開発の源と見なされてきました28,29。キャタピラ菌は、鱗翅目の幼虫に寄生する真菌性寄生虫?...

開示事項

著者らは、利益相反を報告していません。

謝辞

本研究は、中国国家自然科学基金会(31871244年、81973733年、81803652年)、広東省自然科学基金会(2019A1515011555、2018A0303100007)、深セン健康家族計画基金会(SZBC2018016)、深セン市龍崗区経済技術発展特別基金(LGKCYLWS2020064年、LGKCYLWS2019000361年)の支援を受けた。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
RNase-free DNase ITaKaRa2270B
PolyATtract mRNA Isolation SystemsPromegaIII
Random hexamer-primersThermo ScientificSO142
NEBNext1 Ultra RNA Library Prep KitNEBE7530S
PCR extraction kitQiaQuick
AgaroseTransGen BiotechGS201-01
High-throughput sequencerIlluminaHiSeq™ 4,000
LTF ViewerLTFV5.2
ORF programNCBI
ProtParam toolSIB Swiss Institute of Bioinformatics
SignalP ServerDTU Health Tech5.0
BLASTNCBI
Clustal X programUCD Dublin
MEGACenter for Evolutionary Medicine and Informatics4.0
InterProScanEuropean Molecular Biology Laboratory
Predict ProteinTechnical University of Munich
WISS-MODELSwiss Institute of Bioinformatics
Primer ExpressApplied Biosystems3.0
EcoRINEBR0101V
NotINEBER0591
pMD18-T VectorTaKaRa6011
agaroseSigma-AldrichGS201-01
Trans2K® Plus II DNA MarkerSigma-AldrichBM121-01
6×DNA Loading BufferSigma-AldrichGH101-01
GelStainSigma-AldrichGS101-02
50 x TAESigma-AldrichT1060
Gel imaginganalysis systemSyngeneG:BOX F3
E. coli JM109Promega
T4 DNA ligaseEarthOxBE004A-02
pPIC9KGenlociGP0983

参考文献

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