RNA-seqを用いた分子進化と遺伝子発現を探るバイオインフォマティクスのパイプライン

要約

このプロトコルの目的は、RNAシーケンシングデータを用いて候補遺伝子の進化と発現を調べるものです。

要約

全ゲノムやトランスクリプトームデータなどの大規模なデータセットを蒸留して報告することは、しばしば困難な作業です。結果を分解する1つの方法は、生物にとって重要な1つ以上の遺伝子ファミリーに焦点を当て、研究することです。このプロトコルでは、系統を生成し、目的の遺伝子の発現を定量化するためのバイオインフォマティクスステップの概要を説明する。系統樹は、遺伝子が種の内外でどのように進化しているかについての洞察を与えるだけでなく、鳥類学を明らかにすることができます。これらの結果は、RNA-seqデータを用いて、異なる個体または組織におけるこれらの遺伝子の発現を比較するために増強することができる。分子進化と発現の研究は、種間の遺伝子機能の進化と保存のモードを明らかにすることができます。遺伝子ファミリーの特徴付けは、将来の研究のスプリングボードとして機能し、新しいゲノムまたはトランスクリプトーム論文で重要な遺伝子ファミリーを強調することができます。

概要

シーケンシング技術の進歩は、非モデル生物のゲノムおよびトランスクリプトムのシーケンシングを促進してきた。多くの生物からのDNAとRNAのシーケンシングの実現可能性の増加に加えて、関心のある遺伝子を研究するために豊富なデータが一般に公開されています。このプロトコルの目的は、目的の生物に重要な役割を果たす可能性のある遺伝子の分子進化と発現を調査するためのバイオインフォマティクスのステップを提供することです。

遺伝子や遺伝子ファミリーの進化を調査することで、生物学的システムの進化に関する洞察を得ることができます。遺伝子ファミリーのメンバーは、通常、保存されたモチーフまたは相同遺伝子配列を同定することによって決定される。遺伝子ファミリーの進化は、以前は遠縁モデル生物¹のゲノムを用いて調べられた。このアプローチの制限は、これらの遺伝子ファミリーが密接に関連する種でどのように進化し、異なる環境選択的圧力の役割が明確でないということです。このプロトコルでは、密接に関連する種のホモログの探索を含む。系統レベルで系統を生成することで、保存された遺伝子や系統特異的な重複などの遺伝子ファミリーの進化の傾向に注意することができます。このレベルでは、遺伝子がオルソログかパラログかを調べることもできます。多くのホモログは互いに同様に機能する可能性が高いが、必^{ずしも2の}場合ではない。これらの研究に系統樹を組み込....

プロトコル

このプロトコルは、UCアーバイン動物ケアガイドラインに従います。

1. RNA-セクライブラリ調製

1. RNAを分離するには、以下の方法を用いた。
   1. サンプルを収集します。RNAを後で抽出する場合、フラッシュは、サンプルを凍結するか、RNAストレージ溶液¹⁵⁽材料の表)に置く。
   2. 目的の組織を分離するために生物を安楽死させ、解剖する。
   3. 抽出キットを用いて全RNAを抽出し、RNA精製キットを用いてRNAを精製する(材料表)
      注:異なる種や組織の種類^16、17のためにより良く働くプロトコルやキットがあります。我々は、バタフライ¹⁸とゼラチン性ヒドラ¹⁹の異なる身体組織からRNAを抽出した(議論参照)。
   4. 各サンプルのRNAの濃度と品質を測定する(材料表)。RNA 完全性番号 (RIN) が 8 より高いサンプルを使用し、理想的には 9²⁰ に近い cDNA ライ....

結果

上記の方法は 図1 に要約され、 ヒドラ下品 組織のデータセットに適用された。 H. 下垂体 は、サンゴ、クラゲ、イソギンチャクを含むフィラム クニダリア に属する淡水無脊椎動物です。 H.下品は 出芽によって無性を再現することができ、二分すると頭と足を再生することができます。本研究では、 ヒドラ⁷における?.......

ディスカッション

このプロトコルの目的は、RNA-seqデータを用いて遺伝子ファミリーを特徴付けるためのステップの概要を提供することにある。これらの方法は、さまざまな種やデータセット^4、34、35に対して機能することが証明されています。ここで確立されたパイプラインは簡素化されており、バイオインフォマティクスの初心者が続く.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bioanalyzer-DNA kit	Agilent	5067-4626	wet lab materials
Bioanalyzer-RNA kit	Agilent	5067-1513	wet lab materials
BLAST+ v. 2.8.1			On computer cluster* https://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/executables/blast+/LATEST/
Blast2GO (on your PC)			On local computer https://www.blast2go.com/b2g-register-basic
boost v. 1.57.0			On computer cluster
Bowtie v. 1.0.0			On computer cluster https://sourceforge.net/projects/bowtie-bio/files/bowtie/1.3.0/
Computing cluster (highly recommended)			NOTE: Analyses of genomic data are best done on a high-performance computing cluster because files are very large.
Cufflinks v. 2.2.1			On computer cluster
edgeR v. 3.26.8 (in R)			In Rstudio https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/edgeR.html
gcc v. 6.4.0			On computer cluster
Java v. 11.0.2			On computer cluster
MEGA7 (on your PC)			On local computer https://www.megasoftware.net
MEGAX v. 0.1			On local computer https://www.megasoftware.net
NucleoSpin RNA II kit	Macherey-Nagel	740955.5	wet lab materials
perl 5.30.3			On computer cluster
python			On computer cluster
Qubit 2.0 Fluorometer	ThermoFisher	Q32866	wet lab materials
R v.4.0.0			On computer cluster https://cran.r-project.org/src/base/R-4/
RNAlater	ThermoFisher	AM7021	wet lab materials
RNeasy kit	Qiagen	74104	wet lab materials
RSEM v. 1.3.0			Computer software https://deweylab.github.io/RSEM/
RStudio v. 1.2.1335			On local computer https://rstudio.com/products/rstudio/download/#download
Samtools v. 1.3			Computer software
SRA Toolkit v. 2.8.1			On computer cluster https://github.com/ncbi/sra-tools/wiki/01.-Downloading-SRA-Toolkit
STAR v. 2.6.0c			On computer cluster https://github.com/alexdobin/STAR
StringTie v. 1.3.4d			On computer cluster https://ccb.jhu.edu/software/stringtie/
Transdecoder v. 5.5.0			On computer cluster https://github.com/TransDecoder/TransDecoder/releases
Trimmomatic v. 0.35			On computer cluster http://www.usadellab.org/cms/?page=trimmomatic
Trinity v.2.8.5			On computer cluster https://github.com/trinityrnaseq/trinityrnaseq/releases
TRIzol	ThermoFisher	15596018	wet lab materials
TruSeq RNA Library Prep Kit v2	Illumina	RS-122-2001	wet lab materials
TURBO DNA-free Kit	ThermoFisher	AM1907	wet lab materials
*Downloads and installation on the computer cluster may require root access. Contact your network administrator.