マウス海馬興奮性およびクラス特異的阻害ニューロンの異なるorganotypics Slice培養における単細胞エレクトロポレーション

要約

ここで提示される単細胞エレクトロポレーションのためのプロトコルは、体外海馬スライス培養年代の範囲にわたって興奮性および阻害性ニューロンの両方の遺伝子を送達することができる。このアプローチは、細胞自律機能や細胞間機能を調べるために使用できる個々の細胞内の遺伝子の正確かつ効率的な発現を提供します。

要約

エレクトロポレーションは、特定の遺伝子を細胞に移してその機能を理解するための重要な方法としての確立を確立しました。ここでは、マウスの組織性海馬スライス培養における興奮性およびクラス特異的阻害ニューロンにおけるインビトロ遺伝子トランスフェクションの効率(約80%)を最大化する単細胞エレクトロポレーション技術について述べている。大きなガラス電極、テトロドトキシン含有人工脳脊髄液および軽度の電気パルスを用いて、培養海馬CA1錐体ニューロンおよび阻害性インターニューロンに関心のある遺伝子を送達した。さらに、エレクトロポレーションは、トランスフェクション効率の低下を伴う21日間までの培養海馬スライスで行うことができ、様々なスライス培養の発達段階の研究を可能にする。多様な細胞型にわたって遺伝子の分子機能を調べることに関心が高まる中、既存の電気生理学装置や技術で行うことができるマウス脳組織におけるインビトロ遺伝子トランスフェクションに対する信頼できる簡単なアプローチを実証しています。

概要

分子生物学では、研究者にとって最も重要な考慮事項の1つは、その機能を解明するために細胞または細胞の集団に関心のある遺伝子を送達する方法です。異なる送達方法は、生物学的(例えば、ウイルスベクター)、化学的(例えば、リン酸カルシウムまたは脂質)、または物理的(例えば、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、またはバイオリストクス^)1、2のいずれかに分類することができる。生物学的方法は高効率で、細胞種に特異的であるが、特定の遺伝的ツールの開発によって制限される。化学アプローチは、インビトロでは非常に強力ですが、トランスフェクションは一般的にランダムです。さらに、これらのアプローチは主にプライマリセル専用です。物理的アプローチの中で、バイオリスティクスは技術的な観点から最も簡単で最も簡単ですが、再び比較的低い効率でランダムトランスフェクション結果を生成します。遺伝的ツールを開発する必要なく特定の細胞への転送を必要とするアプリケーションについては、単一細胞エレクトロポレーション^3、4に目を向けます。

エレクトロポレーションはフィールドエレクトロポレーションのみを指していたのに対し、過去20年間に、特異性と効率^を向上させるために複数のin vitroおよびin vivo単一細胞エレクトロポレーションプロトコルが開発され、エレクトロポレーションが遺伝子を個々の細胞に移すことができることを実証し、したがって、非常に正確であることが実証されています。しかし、この手順は技術的に要求が厳しく、時間がかかり、比較的非効率的です。実際、最近の論文では、機械化されたエレクトロポレーションリグ^8,9の実現可能性を調査しており、このようなロボット工学の設置に興味を持つ研究者にとってこれらの障壁のいくつかを排除するのに役立ちます。しかし、より単純な手段を探している人にとって、エレクトロポレーション、すなわち細胞死、トランスフェクション障害、ピペット詰まりの問題は依然として懸念される。

我々は最近、より大きな先端ガラスピペット、穏やかな電気パルスパラメータ、および以前の方法よりもはるかに高い経道ニューロンのトランスフェクション効率を生成するユニークな圧力サイクリングステップを使用するエレクトロポレーション法を開発し、ソマトスタチン発現阻害性インターニューロンを含む阻害ニューロンインターニューロンの遺伝子を初めてトランスフェクトすることを可能に^した。しかしながら、異なる阻害性インターニューロン型および神経細胞発生段階におけるこのエレクトロポレーション法の信頼性は取り上げられていない。ここでは、このエレクトロポレーション技術が、興奮性ニューロンおよび異なるクラスのインターニューロンの両方に遺伝子をトランスフェクトできることを実証した。重要なことに、試験したインビトロ(DIV)スライス培養年齢に関係なく、トランスフェクション効率が高かった。この確立されたユーザーフレンドリーな技術は、インビトロマウス脳組織の文脈で異なる細胞タイプの単細胞エレクトロポレーションを使用することに興味のある研究者に強くお勧めします。

プロトコル

すべての動物の議定書は、マサチューセッツ大学医学部の施設動物管理および使用委員会(IACUC)によって見直され、承認されました。スライス培養製剤、プラスミド調製、およびエレクトロポレーションも以前に公開された方法で詳述されており、追加情報¹⁰について参照することができる。

1. スライス文化の準備

1. 前に説明したようにマウスのorganotypic海馬スライス培養を準備します^11,いずれかの性別の出生後6〜7日齢のマウスを使用して.
   1. (mM)からなるorganotypicスライス培養のための解剖培地を準備する:238スクロース、2.5 KCl、1 CaCl_2、4MgCl_2、26NaHCO_3、1NaH₂PO_4、および11グルコースを脱イオン水で、5%CO2 /95%O2でガス7.4のpHにする。
   2. 78.8%(v/v)最小必須培地イーグル、20%(v/v)馬血清、17.9 mM NaHCO 3、26.6 mMグルコース、2 M CaCl_2、2M MgSO_4、30mM HEPES、インスリン(1μg/mL)、および0.06mMからなるorganotipicスライス培地を調製します。オスマメーターを使用して310-330オスモルにオスモルを調整します。
   3. 2つのスパチュラを使用して脳全体からカバピを解剖し、組織チョッパーを使用してスライス(400 μm)します。2つの鉗子を使用してスライスを分離し、挿入物の下に培養培地(950 μL)で満たされた6ウェルプレートの30mm細胞培養インサートに移す。
2. 組織培養インキュベーター(35°C、5%CO2)にオルガノミクススライス培養物を保存し、2日ごとにスライス培養培地を交換します。

2. プラスミド製剤

1. 目的の遺伝子のプラスミドを準備します。
   1. 亜クローンは、pCAGベクターに緑色蛍光タンパク質(EGFP)遺伝子を増強した。
   2. pCAG-EGFPプラスミドを内毒素を含まない精製キットで精製し、140 mM Kメタンスルホン酸、0.2 mM EGTA、2 mM_MgCl2、および10 mM HEPESを含むジエチルパイロカーボネート処理水で構成される内部溶液に溶解し、PH 7.3に調整してKOH(プラミド濃度:0μG)を使用してpH 7.3に調整します。

3. ガラスピペットの準備

1. マイクロピペットの引き手にホウケイ酸ガラスピペット(4.5~8 MΩ)を引き出す(図1A)。
   メモ:全セルパッチクランプ記録に使用されるガラスピペットは、エレクトロポレーションに最適です。
2. ガラスピペットを200°Cで一晩焼いて殺菌します。
3. 解剖顕微鏡の下でピペットチップのサイズを確認し、電気抵抗を近似します。
   1. オプション:ピペットをエレクトロポレーション電極に取り付けてピペットの抵抗を確認し、マイクロマニピュレータを使用してピペットチップをフィルター滅菌人工脳脊髄液(aCSF)に操縦します(mM単位):119 NaCl、 2.5 KCl, 0.5 CaCl_2,5 MgCl_2,26 NaHCO_3,1 NaH₂PO₄ および 11 脱イオン水中の 11 グルコース, 5% CO₂/95% O₂ をガス化し、 7.4.エレクトロポレーターの読み出しを使用して実際の抵抗を確認します。
      メモ:ピペットチップが鋭くないほど、電気抵抗が大きくなります。ピペットの抵抗は10 MΩ以下でなければなりません。ピペット抵抗の高いガラスピペット(図1B)は、エレクトロポレーションを繰り返す際に先端に詰まることがよくあります。

4. エレクトロポレーションリグのセットアップ

1. エレクトロポレーターを標準的な全細胞電気生理学リグに取り付け、マイクロマニピュレーターと蠕動ポンプを備えたシフトテーブルに取り付けられた直立した顕微鏡を装備します。
2. エレクトロポレーターのヘッドステージをマイクロマニピュレーターに取り付け、一対のスピーカーをエレクトロポレーターに接続します。エレクトロポレーターをフットペダルに接続し、準備ができたらパルスを送ることができます。
   メモ:スピーカーは電源を入れるとトーンを発しますが、これは電極の電気抵抗の指標です。これにより、手順から注意を引くことなく、抵抗の相対的な変化を決定することが可能になります。

5. エレクトロポレーションの準備

1. 6ウェルプレートから3cmのペトリ皿にスライス培養インサートを移し、900 μLの培養培地を積み込み、エレクトロポレーションを行う準備ができるまでテーブルトップ_CO2 インキュベーターに保管します。
   1. 3.5cmのペトリ皿中にスライス培養培地(1mL)を入れたフレッシュカルチャーインサートをエレクトロポレーション後の培養スライスに30分以上入れます。
2. 電気ポレーションのためにリグをきれいにして準備します。
   1. 1日の実験を開始する前にチューブとチャンバーを殺菌するために5分間10%の漂白剤でラインを浸透させます。
   2. 少なくとも30分間、脱イオン化されたオートクレーブ水でラインを浸透させ、完全にすすい水を洗い流します。
   3. 0.001 mMテトロドトキシン(TTX)を含むフィルター滅菌aCSFでラインを浸透します。
      注:TTXは、インターニューロン¹⁰の過剰励起による細胞毒性および死を最小限に抑える。
3. エレクトロポレーターのパルスパラメータを設定:–5 Vの振幅、四角パルス、500ミリ秒の列車、50Hzの周波数、および500 μsのパルス幅。
4. プラスミド含有内部溶液を5 μL充填します。
   1. ピペットチップから閉じ込められた気泡をフリックして、先端を何度も軽くタップして取り除きます。
   2. 解剖顕微鏡の下で視覚化するか、ステップ3.3.1を繰り返してピペットの抵抗を確認して、チップの損傷を確認します。
      注:先端が破損している場合、ガラスピペットを廃棄する必要があり、このステップは、手順3で以前に準備した新しいガラスピペットで繰り返す必要があります。
5. ピペットチップを電極にしっかりと取り付け、スピーカーの電源を入れます。先端がaCSF媒体と接触した時にエレクトロポレーターの読み出し(ピペットの抵抗)を記録します。
6. 鋭い刃を使用して培養インサート膜を切断し、1つのスライス培養を分離する。鋭角鉗子を使用して慎重にスライス培養液をエレクトロポレーションチャンバーに移し、スライスアンカーで位置を固定します。
   1. 神経の健康や機能¹²の変化などの副作用を防ぐために、一度に30分以上、培養器の外側にスライス培養を保管しないでください。

6. 目的のセルを電気ポレート

1. 口でピペットに正圧を加える、またはチューブに取り付けられた1 mLシリンジ(0.2-0.5 mL圧)を使用して下さい。
2. マイクロマニピュレーターの3次元ノブコントロールを使用して、スライス培養の表面付近でピペットチップを操作します。
3. ターゲットセルを選択して近づき、顕微鏡で見える細胞表面にディンプルが形成されるまで正の圧力を加えます。
4. 圧力サイクルを実行します。
   1. 口で軽度の陰圧を速やかに加えて、ピペット先端と血漿膜の間に緩いシールが形成されるように、膜がピペット先端に幾分上がって視覚的に示される。スピーカーからの音の増加を聞いてピペット抵抗の増加(約2.5倍の初期抵抗)を観察してください。ディンプルが再形成されるように、すぐに正の圧力を再適用します。
   2. 一時停止せずに少なくとも2回以上の圧力サイクルをすぐに完了し、1sの負圧を保持します。
      注:サイクル間の一時停止、圧力の適用が多すぎる、または負圧を長く保持すると、細胞の損傷が大きく、エレクトロポレーション中に細胞が死ぬ可能性があります。
5. スピーカーからの音がピッチの安定した頂点に達したときに、フットペダルを使用してエレクトロポレーターを一度素早くパルスし、電気抵抗のピークを示します。パルスを送信する前に、1s以上のピーク抵抗で待たないでください。
   注: このプロトコル¹⁰を使用する場合、オフターゲットエレクトロポレーションは見当違いです。圧力サイクル中にガラスピペットと接触した細胞のみがトランスフェクションされた。他のニューロンの近くにピペットを配置しても遺伝子トランスフェクションは起こらない。
6. 圧力をかけることなく、約100μmのピペットをセルから緩やかに引き込みます。
7. 正圧を再適用し、抵抗がステップ5.5で記録された読み出しと類似していることを確認し、次のセルに近づく。
   1. ポテンシャルな下駄を除去し、視覚的に示されたか、またはエレクトロポレーション後にピペット抵抗を有意に増加させた(>15%高く)、正の圧力を加えることによって除去する。
      注:目に見える詰まりがなく、抵抗がまだかなり高い場合は、ピペットを捨てて新しいものを使用してください。平均して、ユーザーが注意して¹⁰を使用している場合、ピペットは最大20のエレクトロポレーションイベントに使用できます。
8. エレクトロポレーション後、スライス培養液を新鮮な培養インサートに移し、35°Cで最大3日間インキュベーターでインキュベートします。

7. 組織の海馬スライス培養物の固定、染色、イメージング

1. エレクトロポレートされたオルガノミピックスライス培養2– トランスフェクション後2–3日、0.01 Mリン酸緩衝生理食塩水(1x PBS)で4%パラホルムアルデヒドと4%スクロースを室温で1.5時間修正します。
2. 固定液を取り除き、0.1 Mリン酸バッファー(1x PB)で30%スクロースでスライスを2時間インキュベートします。
3. スライドグラスの上にスライスを置き、砕いたドライアイスの上にスライドグラスを置くことによってそれらを凍結します。スライスを室温で解凍し、1x PBSで満たされた6ウェルプレートに移します。
4. GDBバッファー(0.1%ゼラチン、0.3%トリトンX-100、450 mM NaCl、および32%1x PB、pH 7.4)のマウス抗GFPおよびウサギ抗RFP抗体でスライスを室温で2時間染色します。
5. 1回のPBSでスライスを室温で3回洗浄し、各洗浄10分間おきます。
6. 抗マウスAlexa 488-コンジュゲート二次抗体と抗ウサギAlexa 594-共役二次抗体をGDBバッファー内で1時間室温でインキュベートスライス。DAPI(4 μg/mL)を1x PBSで室温で10分間インキュベートします。
7. 1回PBSでスライスを室温で3回洗浄し、各洗浄を3分間行います。
8. 取り付け媒体を使用してガラススライドにスライスを取り付け、蛍光イメージングを行います。

結果

当社の単細胞エレクトロポレーションは、視覚に同定された興奮性および抑制性ニューロンに遺伝子を正確に送達することができる。3つの異なる時間ポイントで3つの異なるニューロン細胞タイプを電気ポポレートしました。パーブアルブミン(Pv)またはベシキュラーグルタミン酸3型(VGT3)発現ニューロンを、それぞれPv/TdTomatoとVGT3/TdTomatoラインと呼ばれるTdTomato(赤蛍光タンパク質の変種)レポ?...

ディスカッション

ここでは、励起性ニューロンと阻害性ニューロンの両方を高効率かつ高精度にトランスフェクトするエレクトロポレーション法について説明する。当社の最適化エレクトロポレーションプロトコルは、高効率遺伝子トランスフェクションを実現するための3つの革新的なブレークスルーを有しています。私たちの最初の変更は、以前に公開されたプロトコル^3、5、6

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Plasmid preparation
Plasmid Purification Kit	Qiagen	12362
Organotypic slice culture preparation
6 Well Plates	GREINER BIO-ONE	657160
Dumont #5/45 Forceps	FST	#5/45	Angled dissection forceps for organotypic slice culture preparation
Flask Filter Unit	Millipore	SCHVU02RE	Filtration and storage of culture media
Incubator	Binder	BD C150-UL
McIlwain Tissue Chopper	TED PELLA, INC.	10180	Tissue chopper for organotypic slice culture preparation
Millicell Cell Culture Insert, 30 mm	Millipore	PIHP03050	Organotypic slice culture inserts
Osmometer	Precision Systems	OSMETTE II
PTFE coated spatulas	Cole-Parmer	SK-06369-11
Scissors	FST	14958-09
Stereo Microscope	Olympus	SZ61
Sterile Vacuum Filtration System	Millipore	SCGPT01RE	Filtration and storage of aCSF
Electrode preparation
Capillary Glasses	Warner Instruments	640796
Micropipetter Puller	Sutter Instrument	P-1000	Puller
Oven	Binder	BD (E2)
Puller Filament	Sutter Instrument	FB330B	Puller
Single-cell electroporation and fluorescence imaging #1
3.5 mm Falcon Petri Dishes	BD Falcon	353001
Airtable	TMC	63-7512E
CCD camera	Q Imaging	Retiga-2000DC	Camera
Electroporation System	Molecular Devices	Axoporator 800A	Electroporator
Fluorescence Illumination System	Prior	Lumen 200
Manipulator	Sutter Instrument	MPC-385	Manipulator
Metamorph software	Molecular Devices		Image acquisition
Peristaltic Pump	Rainin	Dynamax, RP-2	Perfusion pump
Shifting Table	Luigs & Neuman	240 XY
Speaker	Unknown		Speakers connected to the electroporator
Stereo Microscope	Olympus	SZ30
Table Top Incubator	Thermo Scientific	MIDI 40
Upright Microscope	Olympus	BX61WI
Fluorescence imaging #2
All-in-One Fluorescence Microscope	Keyence	BZ-X710