ミツバチの経口感染のためのウイルス富化接種剤の調製(Apis mellifera)

要約

ここでは、ミツバチの蛹を除去する方法を含む大量のミツバチ非エンベロープウイルス粒子を伝播、抽出、精製、定量すること、および2番目の2つのプロトコルについて説明します。

要約

ミツバチは世界中で生態学的および農業的に非常に重要ですが、ウイルス病原体への曝露を含むミツバチの健康に悪影響を及ぼすさまざまな圧力にもさらされています。このようなウイルスは、多種多様な壊滅的な影響を引き起こす可能性があり、実験的治療の効果を既存の背景感染から分離することを困難にする複数の要因のために、研究が困難な場合が多い。ここでは、大量のウイルス粒子を大量生産する方法と、ウイルス感染と効果をテストするためのハイスループットバイオアッセイを紹介します。連続したウイルスのないミツバチ細胞株の現在の欠如によって必要とされる、ウイルス粒子は、最小限のストレスの方法論を用いて巣箱から大量に抽出されるミツバチの蛹を用いて 生体内で 増幅される。これらのウイルス粒子は、その後、ミツバチケージバイオアッセイで、接種剤の生存率、ならびに栄養、農薬、および他の病原体との相互作用を含む様々な他のウイルス感染動態を試験することができる。このような粒子を使用する主な利点は、感染したミツバチの血リンパ液やホモジネートを介した感染などの現在の代替手段と比較して、その後の実験で未知の変数を導入する可能性を大幅に減らすことですが、バックグラウンドウイルス汚染を最小限に抑えるために、ミツバチを調達する際には注意が必要です。ケージアッセイは、コロニーレベルでウイルス感染効果をテストする大規模でフィールド現実的な実験に代わるものではなく、代わりに、半純粋なウイルス粒子と組み合わせて、ミツバチとウイルスの生理学的相互作用の様々な次元を調べるための重要なツールとして役立つベースラインウイルス応答を確立する方法として機能する。

概要

ミツバチ(Apis mellifera)は、現代の世界の農業景観において重要な役割を果たしていますが、現在、農薬曝露、飼料不足、寄生虫、病原体など、生物的および非生物的ストレッサーの組み合わせに苦しんでいます^1,2。懸念される最も重要な病原体の1つはウイルスであり、その多くは別の主要なミツバチストレッサーである寄生性Varroaダニ(Varroa destructor)によってベクター化されています。これらのウイルスは、繁殖期の生存率の低下、発達上の欠陥、および越冬期間の前後に完全な巣箱の崩壊につながる可能性のある麻痺を含む、ミツバチに一連の悪影響を引き起こす可能性があります^3,4,5。ウイルス感染^と戦うために使用される技術の開発には有望な進歩がありましたが、^6,7,8,9、多くのウイルスがミツバチやコロニー内で伝播、拡散、相互作用するダイナミクスはまだよく理解さ....

プロトコル

1.ミツバチの大量抽出オプション1:幼虫の自己除去

1. ミツバチの女王を空っぽのラングストロスのフレームに檻に入れ、コロニーに戻す。女王がこのフレームに24時間卵を産むのを許してください。
   1. 24時間後にフレームをチェックして、ほとんどの櫛細胞に新しく産まれた卵が含まれていることを確認してください。女王とコロニーによっては、卵は最初の24時間であまりうまく産まれないことがあります。このような場合は、さらに 24 時間待ってから、必要に応じて時間を調整します。
2. 24時間の産卵期間の後、女王を解放します。フレームにはっきりとマークを付け、コロニーに戻します。
3. 女王をケージに入れてから正確に192時間(8日)後(最初の24時間以内に通常の産卵を仮定し、8日が蛹化の直前のポイントをマークします)、コロニーからマークされたフレームを削除します。すべての成虫ミツバチをはがし、ハイブの内部条件(34°C、相対湿度50%(RH))に合ったインキュベーターにフレームを移します。
   1. フレームの大部分が5^番目の 齢幼虫で満たされていることを確認し、櫛細胞の下端にしっかりと押し付けられた大きな白いc字型の体によって認識することができます。また、特にフレームの中央付近に、ワックスキャッピングで既に覆われているセルがいくつかある可能性があります。
4. 幼虫充填フレームの高さと幅に合った容器を....

結果

蛹注射とウイルス抽出のプロトコル(図1)に首尾よく従うと、大量のウイルス粒子が生成されます。しかし、さまざまなコロニーから供給された蛹を複数の時点でサンプリングして注入することで、汚染の少ない標的ウイルスを獲得する可能性が最大化されます。ミツバチの中でウイルスが複製し、互いに相互作用するダイナミクスはよく理解されていません。既存の感染の可能?.......

ディスカッション

ここでは、幼虫の収集、ウイルスの繁殖、抽出、濃縮、ならびにケージ給餌実験の形でのウイルス処理を含む、ウイルス増幅および接種剤ストック調製プロセスのすべてのステップを詳述する方法を概説した。これらの方法は、半純粋なウイルス粒子の生成を可能にし(図4)、その有効性は、成人にとって致死的であるウイルスの用量反応死亡率試験によって一貫して定?.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
10% bleach solution
24:1 chloroform:isoamyl alcohol	SigmaAldrich	C0549
70% ethanol solution
Cages for bioassay			Dependent on experimental setup
Combitips Advanced 0.1 mL	Eppendorf	30089405	Optional (if no injector appartus is available)
Containers for larval self-removal			Should measure roughly 19" x 9-1/8" (Langstroth deep frame dimensions)
Forceps			Blunt, soft forceps for larval separationl; blunt, hard forceps for pupal excision
Fume hood
Incubator			Capable of maintaining 34 ºC and 50% relative humidity
Kimwipes	Fisher Scientific	06-666	Any absorbent wipe will work
Medium-sized weight boats			Serve as inoculum trays
Microcon-100kDa with Biomax membrane	MilliporeSigma	MPE100025
NaCl
Nitrile gloves
Phosphate buffered saline (PBS)	SigmaAldrich	P5119
Polyethylene glycol 8000 (PEG)	SigmaAldrich	1546605
Refrigerated benchtop centrifuge			Capable of 15,000 x g
Refrigerated centrifuge			Capable of 21,000 x g
Repeater M4 Multipipette	Eppendorf	4982000322	Optional (if no injector appartus is available)
RNAse Away	ThermoFisher	7000TS1
RNAse-free water	SigmaAldrich	W4502
Sucrose
TES	SigmaAldrich	T1375