ハイスループットマイクロ流体装置を用いた動的環境条件の生成

要約

1500の培養ユニット、強化された蠕動ポンプの配列、オンサイトミキシングモジュラスから構成される複雑な寿命機械の高スループット研究のためのマイクロ流体システムを発表します。マイクロ流体チップは、生体内の非常に複雑で動的な微小環境条件の解析を可能にします。

要約

生体内の環境条件を模倣することは、複雑な生命機械に関するインビトロ研究にとって極めて重要である。しかし、生きた細胞や臓器を標的とする現在の技術は、ロボット工学のような非常に高価であるか、液体操作においてナノリットル体積とミリ秒の時間精度を欠いている。ここでは、1,500の培養ユニット、強化された蠕動ポンプの配列、およびオンサイト混合弾性率から構成されるマイクロ流体システムの設計と製造を提示する。マイクロ流体デバイスの容量を実証するために、神経幹細胞(NSC)球体は提案されたシステムで維持される。我々は、NSC球体が1日目にCXCLに曝露され、2日目にEGFにさらされると、丸型の立体構造が良好に維持されることを観察した。6つの薬剤の入力順序の変動は、NSC球体およびNSCステムの発現レベル代表マーカー(すなわち、Hes5およびDcx)に形態学的変化を引き起こす。これらの結果は、動的で複雑な環境条件がNSC分化および自己再生に大きな影響を及ぼすことを示しており、提案されたマイクロ流体デバイスは、複雑な生命機械のハイスループット研究に適したプラットフォームである。

概要

高スループット技術は、生物医学および臨床研究にとって極めて重要です。何百万もの化学的、遺伝的、または生細胞およびオルガノイドの検査を並行して行うことで、研究者は生体分子経路を調節する遺伝子を迅速に同定し、特定のニーズに合わせて連続的な薬物入力をカスタマイズすることができます。ロボット¹とマイクロ流体チップをデバイス制御プログラムと組み合わせて、細胞/組織操作、液体処理、イメージング、およびデータ処理/制御^2,3をカバーする複雑な実験手順を自動化することができます。したがって、所望のスループット^4,5に従って、1つのチップ上で数百、数千の実験条件を維持することができる。

このプロトコルでは、1500の培養ユニット、強化された蠕動ポンプおよびオンサイト混合弾性率から構成されるマイクロ流体装置の設計および製造手順について説明した。2レベルの細胞培養チャンバーは、培地交換時に不要なせん断を防ぎ、長期の生細胞イメージングのための乱れない培養環境を保証します。この研究は、提案されたマイクロ流体装置が複雑な生命機械のハイスループット研究に適したプラットフォームであることを示している。さらに、マイクロ流体チップの高度な機能により、常に変化するサイトカインおよびリガンド組成物^6、7のような非常に複雑で動的な微小環境条件の自動再構成が可能となり、96ウェルプレートのような従来のプラットフォームでは数ヶ月かかる。

プロトコル

1. マイクロ流体チップ設計

1. 18個の入口からなるマイクロ流体マルチプレクサを設計し、各々は個々のバルブと蠕動ポンプによって制御されます。ポンプサイクルごとに駆動される液体体積を増加させるために、蠕動ポンプを3つの制御チャネルで構成し、意図的に200μmに拡大し、10本の接続流線を有する。
2. せん断のない文化室を設計します。2レベル培養ユニットの複製は、低い細胞培養チャンバー(400 μm x 400 μm x 150 μm)とより高いバッファ層(400 μm x 400 μm x 75 μm)によって構成され、培地交換時の細胞に対する不要なせん断応力を防ぎます(図1)。
3. ハイスループット機能を設計します。培養単位を複製して30 x 50の行列レイアウトを形成し、約7cm×5cmの面積を占める。

2. チップの製造と操作

1. UVリソグラフィによるレプリカ成形の製作
   注:レプリカ成形は、標準的なフォトリソグラフィプロトコル⁸に従ってシリコンウエハで製造されました。
   1. チャネル構造の製造
      1. 回転フォトレジスト:SU-8 3025のマイナスフォトレジストのスピンコート5mLをシリコンウエハー上で500rpmで10s、3000rpmで30s。
      2. ソフトベーク:ウエハーを65°Cのホットプレートに2分間置き、95°Cで10分間置き、室温まで冷やします。
      3. アライメントと硬化:アライザのホルダーにウエハーとマスクを固定し、18 sの光源をオンにして、露出したフォトレジストを硬化します。
      4. プレポスト露光ベーク:室温から110°C/hで95°Cにウエハーをランプアップし、取り外すまで少なくとも40分を保ちます。
      5. 開発:ウエハーを開発ソリューション(SU-8開発者)に浸し、2.5分間攪拌して冗長フォトレジストを洗い流し、高さ25μmのチャネル構造を得ます。
      6. ハードベーク:ウエハースをガラスペトリ皿で覆い、65°Cで2分間焼き、120°C/hで160°Cまでランプアップし、3時間保ちます。
   2. バッファー層を用いて細胞培養チャンバーを製造する
      1. ステップ2.1.1.1のパラメータを使用して、上記のウエハー上のSU-8 3075陰性フォトレジストの7mLをスピンコートします。
      2. 柔らかいベーク(ステップ2.1.1.2で説明)ウエハと、ウエハ上のマーカーとよく合うようにマスクを変更します。その後、24 sの光源をオンにして、露出したフォトレジストを硬化します。
      3. ウエハーを開発ソリューション(SU-8開発者)に浸し、4分40秒間攪拌して冗長フォトレジストを洗い流し、以前に作り上げた高さ25μmの高い層構造を75μmの高層構造にします。ハードベーク(ステップ2.1.1.6で説明)は、複雑な構造を強くするためにウエハを焼く。
      4. ステップ 2.1.2.1-2.1.2.3 を繰り返して、層構造に積み重ねる高さ75 μm のチャンバー構造を作製します。
   3. バルブ構造の作製
      1. ステップ2.1.1.1のパラメータを用いて、上記ウエハ上のAZ50x陽性フォトレジストの5mLをスピンコートした。
      2. 柔らかいベイク(ステップ2.1.1.2で説明)ウエハを、マスクをウエハのマーカーとうまく整列させ、それから20 sのために、そして30 sのためにすぐに消灯する。5つの円でライトオン/オフ手順を繰り返して、露出したフォトレジストを治します。
      3. ウエハーを一致させた開発者に浸し、約8分間攪拌して冗長なフォトレジストを洗い流し、制御チャネルと重なる丸い形のバルブを取得して良好な接続を確保します。ハードベーク(ステップ2.1.1.6で説明)全体のモデルを強くするためにパターン化されたウエハー。
2. ソフトリソグラフィによるマイクロ流体チップ製造
   1. パターン化されたブランクシリコンウエハースをリメチルクロロシランで15分間処理します。
   2. 50gの流れ層、20gの制御層2、および20gの膜に対応するPDMSゲル(10:1のモノマー/触媒比)の3部をそれぞれ調製する。
   3. パターン化されたシリコンウエハに50gのPDMSゲルをキャストし、真空チャンバーで-0.85 MPaで1〜2時間脱ガスしてフロー層をコピーします。
   4. PDMSの20gの2部を脱気し、2000-2800rpmでパターン化されたウエハとブランクシリコンウエハ上で30sで回転させ、制御層および膜層を作製する。
   5. PDMSで覆われたウエハースを80°Cで60分間換気オーブンに入れてインキュベーションします。
   6. カスタマイズされた光学デバイス(100xズーム)とプラズマエッチング機を介して、異なる層を一緒に整列させ、接着します。その後、80°Cで2時間換気オーブンに保管し、チップの接着を強化します。
   7. チップに入口穴を開け、PDMSコーティングされたカバースリップに接着し、使用前に80°Cで少なくとも12時間硬化します。
3. チップ操作
   1. 小型空気圧ソレノイドバルブをチップの制御層に接続し、カスタマイズされたMATLABグラフィカルユーザインターフェース⁸ を開いてスイッチをリンクおよび制御します。
   2. プッシュアップPDMS膜バルブの閉圧を25 psiに設定します。
   3. 動的に変化するコンビナトリアル/シーケンシャル入力を、バルブのタイムリーなオンオフによって、指定されたチャンバー(図2d)に提供します。

3. 細胞マイクロ環境における動的入力の生成

1. チップ処理と細胞ローディング
   1. 顕微鏡の標準的な培養条件(37°C、5%CO2)を5時間以上維持してください。
   2. チップにコーティング媒体(すなわち、NOTEに記載されている)を充填し、標準培養条件(ステップ3.1.1に記載)で少なくとも1時間インキュベートする。
   3. チップをリン酸緩衝生理食塩水(PBS)または細胞培養培地(Dulbeccoの修飾イーグル培地DMEM)で洗い流し、健康的な培養環境を構築します。
   4. 80%合流で細胞を収穫し、培養培地(DMEM)を用いて細胞を~106/mLの密度で再懸濁した。次に、細胞含有溶液を加圧して細胞をチップにロードする。
      注:チップ上の異なる細胞株を培養するには、細胞培養チャンバーを処理するために対応するコーティング媒体が必要です。典型的には、培養チャンバを制御する全ての弁を開いた3T3線維芽細胞およびヘンの付着培養物の実験のために、細胞は同じカラム内のすべての培養チャンバーに流入する。
2. 高スループットライブセルイメージングのセットアップ
   注:画像取得には、自動翻訳ステージとデジタル相補金属酸化物半導体(CMOS)カメラを備えた反転顕微鏡を使用しました。ステージと画像の取得は、カスタマイズされたソフトウェアを介して制御されました。
   1. 明視野の10x対物レンズを使用して培養チャンバーのマトリックスを可視化し、30 x 50室マトリックスの各チャンバの位置座標を肯定し、定義します。
   2. 対物レンズを20xまたは40倍に変換し、希望するチャンバの位置座標を選択し、確認後に翻訳段階が割り当てられた位置に移動します。最適なイメージを得るために、x、y、z の焦点面を微調整します。
   3. 最適な光強度、露光時間、および他の画像化されたパラメータは、各チャネル(すなわち、明視野および蛍光イメージング)ごとに個別に決定された。
   4. イメージングサイクルの間隔と持続時間を設定し、パスを保存してからイメージングを開始します。

結果

従来のオンチップペリスタチックポンプは、2000年にスティーブン・クエイクによって最初に記述され、そのパターン101、100、100、110、010、011、001、0018、10によって蠕動を作動させた。 0 と 1 の数値は、3 本の水平制御線の「開く」と「閉じる」を示します。3つ以上のバルブ(例えば、5つ)を用いた研究も^11.3つの制御ラインと3つの?...

ディスカッション

多重化および複雑な実験17、18、19、20を実行するために様々なマイクロ流体装置が開発されている。例えば、トポロジカルな凹部の配列からなるマイクロウェルは、外力を使用せずに個々の細胞をトラップすることができ、小さなサンプルサイズ、並列化、低材料コスト、より速い応答、高感度

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
2713 Loker Avenue West	Torrey pines scientific
AZ-50X	AZ Electronic Materials, Luxembourg
Chlorotrimethylsilane(TMCS) 92360-25mL	Sigma
CO2 Incubator HP151	Heal Force
Desktop Hole Puncher for PDMS chips WH-CF-14	Suzhou Wenhao Microfluidic Technology Co., Ltd.
DMEM(L-glutamine, High Glucose, henol Red)	Invitrogen
Electronic Balance UTP-313 Max:600g, e:0.1g, d:0.01g	Shanghai Hochoice Apparatus Manufacturer Co.,LTD.
FBS	Sigma
Fibronection 0.25 mg/mL	Millipore, Austria
Glutamax 100x	Gibco
Heating Incubator BGG-9240A	Shanghai bluepard instruments Co.,Ltd.
Nikon Model Eclipse Ti2-E	Nikon
Pen/Strep 10 Units/mL Penicillin 10 ug/mL Streptomycin	Invitrogen
Plasma cleaner PDC-002	Harrick Plasma
polydimethylsiloxane(PDMS)	Momentive
polylysine 0.01%	Sigma
Spin coater ARE-310	Awatori Rentaro
Spin coater TDZ5-WS	Cence
Spin coater WH-SC-01	Suzhou Wenhao Microfluidic Technology Co., Ltd.
SU-8 3025	MicroChem, Westborough, MA, USA
SU-8 3075	MicroChem, Westborough, MA, USA