JoVE Logo
著者
お問い合わせ

サインイン

このコンテンツを視聴するには、JoVE 購読が必要です。 サインイン又は無料トライアルを申し込む。

この記事について

  • 要約
  • 要約
  • 概要
  • プロトコル
  • 結果
  • ディスカッション
  • 開示事項
  • 謝辞
  • 資料
  • 参考文献
  • 転載および許可

要約

遺伝的に難解な線虫カ エノハブディティスエレガンス は、創薬のためのシンプルで安価なモデルとして使用することができます。ここで説明するプロトコルは、RASおよびEGFRタンパク質の下流シグナル伝達を阻害する抗癌治療を同定するプロトコルである。

要約

表皮成長因子受容体(EGFR)とその下流のエフェクターRASの細胞膜局在の変化は、癌を含むいくつかの疾患に関与している。自由に生きている線虫 C.エレガンス は、外陰部の発達の中心である進化的かつ機能的に保存されたEGFR-RAS-ERK MAPシグナルカスケードを有する。RASホモログLET-60およびEGFRホモログLET-23における機能変異の利益は、これらのワームの腹側体壁に沿って目に見える非機能的な子宮外性偽陰骨の生成を誘導する。これまで、これらのワームにおける多対体(Muv)表現型は、小さな化学分子によって阻害されることが示されていた。ここでは、EGFRおよびRASタンパク質の活性を廃止する阻害剤を同定するために、液体ベースのアッセイでワームを使用するためのプロトコルについて説明する。このアッセイを用いて、K-RASの間接的阻害剤であるR-フェンジリンが 、let-60(n1046) および let-23(sa62) 変異型ワームで発現するMuv表現型を抑制する。このアッセイは、簡単で安価で、セットアップに時間を要せず、抗がん治療薬の発見のための初期プラットフォームとして使用することができます。

概要

生物内の発生事象を調節する細胞経路は、すべてのメタゾアンの間で高度に保存されています。そのような経路の1つは、細胞増殖、分化、遊動および生存を支配する重要な経路であるEGFR-RAS-ERK活性化プロテインキナーゼ(MAPK)シグナル伝達カスケードである1,2である。このシグナル伝達経路の欠陥は、癌などの病理学的または疾患状態につながる可能性がある。表皮成長因子受容体(EGFR)は、口腔扁平上皮癌の50%を含むヒト腫瘍において高発現することが示されており、悪性腫瘍3、4、5の発症に寄与している。一方、3つのRASアイソフォームH-,K-およびN-RASの突然変異は、複数のヒト癌における悪性転換の主要な原動力である。これら3つのRASアイソフォームの中で、K-RASの発癌性変異は6、7、8で最も普及している。EGFRとRASが機能するためには、それらは、形質膜(PM)に局地化する必要があります。PMにこれらの分子の局在化を防ぐことは、このシグナル経路9,10の生物学的活性を完全に妨げることができる。したがって、PMへのこれらのタンパク質の局在化の阻害は、下流シグナル伝達および結果として生じる有害な結果を遮断する治療戦略である。高含有スクリーニングアッセイを用いて、フェンジリン、L型カルシウムチャネル遮断薬を、K-RAS活性11の阻害剤として同定した。PMの内側のリーフレットへのK-RASのナノクラスタリングはフェンジリンの存在下で有意に減少する。さらに、K-RASは、小形質膜から小胞体(ER)に再分配され、ゴルジ装置、エンドソーム、および細胞質ゾルが挙げられる。さらに重要なことは、膵臓、結腸、肺、およびK-RASに癌細胞株の増殖がフェンジリン11による下流シグナル伝達の阻害によって遮断される。これらのデータは、PMへのRASタンパク質の誤局在化を引き起こす特定のK-RAS抗癌治療としてフェンジリン機能を示唆している。

線虫 カエノハブディティスエレガンス は、開発の文脈で広く研究されています。ワームの発達を支配するシグナル経路の多くは、進化的で機能的に保存されています。例えば、EGFR媒介RASの活性化とERK MAPK信号カスケードのその後の活性化は、ワーム12中で保存される。カスケードは、以下のタンパク質によって表されます: LET-23 > LET-60 > LIN-45 > MEK-2 > MPK-1.LET-60はRASに相同で、LET-23はEGFRと同種です。ワームでは、この経路は外陰部13の発達を調節する。外陰部は、受精卵を産み付けることを可能にするワームの腹側体壁上の上皮開口である。ワームにおける外陰部の形成は、EGFR-RAS-MAPKシグナルカスケードの活性化の勾配への外陰前駆細胞(VPC)の曝露に依存する。正常な発達の間、近位VPCは、生殖腺アンカー細胞から強いシグナルを受け取り、1°および2°の細胞運命に分化し、機能的外陰部12を生じる。一方、遠位VPCは、皮下シンクティウムに融合し、シグナル伝達が枯渇したために外陰部を形成しない3°細胞運命に分化する。シグナルがない場合、すべてのVPCは3°細胞の運命に分化し、外陰部の形成を生じさせない。しかし、構成シグナル伝達は、1°および2°細胞運命を仮定するすべての VPC の誘導による1つ以上の非機能的外陰部の形成をもたらす。

この経路を表すタンパク質をコードする遺伝子の多くについて、欠陥または過剰な加硫誘導を引き起こす突然変異が同定されている。外陰性(Vul)表現型の外反誘発は、外陰性(Vul)表現型で結果、過剰な外陰誘発は、腹側の体壁全体に多数の非機能的な外向性偽陰部の発達によって表される多外陰性表現型をもたらす。let-60(n1046)株によって発現されるMuv表現型はRASの機能変異の利得によるもので、一方、let-23(sa62)株ではEGFR14,15の活性化変異によるものである。これらの変異株における強いMuv表現型は、MEK-1阻害剤U012616,17によるlet-60(n1046)ワームの治療によって示されるように薬理学的介入によって摂動することが示されている。興味深いことに、スフィンゴミエリン代謝に影響を与えるR-フェンジリンおよび阻害剤がワーム18におけるMuv表現型を抑制することを示した。RASのレベルでこれらの阻害剤ブロックlet-60シグナリングを実証するために、lin-1ヌル株は17を利用している。Lin-1は、外陰部19の開発におけるリプレッサーとして機能するEts様の阻害性転写因子である。let-60(n1046)ワームにおける Muv 表現型の強い復帰とlin-1ヌルワームへの影響は、RAS のレベルで発生する阻害を示唆しています。

本プロトコルでは、RASおよびEGFRタンパク質の阻害剤を同定するモデルとしての C.エレガンス の使用を実証する。液体ベースのアッセイを用いて、 液性60(n1046) および let-23(sa62) 変異株の C.エレガンスのMuv表現型を抑制することにより、Rフェンジリンの阻害効果を実証する。このアッセイは、抗がん治療薬の創薬初期段階におけるツールとしての C.エレガンス の使用を検証する。

プロトコル

1. 線虫増殖培地(NGM)プレート調製

  1. 2.5gのペプトンとNaClの3gを、2Lのエルレンマイヤーフラスコに含まれる970mLの脱イオン水に加えます。磁気攪拌棒を使用して内容物を攪拌します。その後、フラスコに寒天20gを加える。フラスコの内容物を121°Cでオートクレーブし、30分間15ポンド/in2 の圧力を切り取ります。殺菌後、フラスコを攪拌板に置き、温度が50°Cになるまで培地を冷却します。
  2. 冷却された培地に以下の試薬を添加して下るNGMプレートを調製するには:1Mリン酸カリウム緩衝液25mL(pH=6.0)、1MLのMgSO 4、1mLの1MLの1ML2、1mLの(95%エタノール中5mg/mL)コレステロール、 1 mL (エタノールで 10% v/w) ニスタチン, 1 mL 25 mg/mL ストレプトマイシン.
  3. 層流の下で、冷却された媒体を60 mm x 15 mmの滅菌ペトリ皿に注ぎます。プレートを2時間固めましょう。これらのプレートは、4°Cで1ヶ月間保管することができます。

2. C.エレガンスの伝播

  1. 一晩成長した 大腸菌 OP50の100 μLを各NGMプレートの中央にスポットし、プレートを薄層フードで24時間乾燥させます。続いて、プレートはポリスチレン容器に収納することができる。
    注: 大腸菌 OP50培養は、プレートの播種前に37°C培地でルリア-ベルタニ (LB)培地で栽培されています。培養は4°Cで1~2ヶ月間保存し、プレートの定期的な播種に使用できます。
  2. 滅菌ワームピックを使用して、解剖顕微鏡の下で以前に成長したプレートから10〜12グレイド成虫を集める。これらのワームを 大腸菌 OP50を播種した新鮮なNGMプレートに移し、20°Cで24時間インキュベートします。
  3. 24時間後、滅菌ワームピックを使用して、プレートから成虫ワームを除去する。プレートを~3日間20°Cでインキュベートします。胚は、グラビッド成虫に発展します。

3. 同期 C.エレガンス文化の 準備

  1. M9Wで2~4プレートを洗浄して、15 mL円錐管に成虫のワームを集めよ。
    1. M9Wの調製:NaClの5g、Na2HPO4の6g、およびKH2PO4の3gを脱イオン水で1 L.1 L.の最終体積に溶解し、121°Cで溶液を15ポンド/2で30分間溶解します。冷却液に1MMgSO4の1mLを加えます。
  2. 1分間450xgでチューブを遠心分離してワームをペレット化する。虫ペレットを乱さずに上清をデカントする。
  3. 8.25%次亜塩素酸ナトリウム(家庭用漂白剤)と5 N NaOHの100 μLを組み合わせて、ワーム溶解液を調製します。この溶液をワームペレットに加え、チューブをフリックしてチューブの内容物を混ぜます。解剖顕微鏡下でワームのリシスを観察することによって、チューブ内の胚の過剰な漂白を防ぎます。
  4. 成虫の70%が融和した場合に、円錐管にM9Wの10 mLを加えて、リシスミックスを希釈します。
  5. チューブを450 x g で1分間遠心します。上清をM9Wの10 mLに交換してください。
  6. ステップ 3.5 を 2 回繰り返します。
  7. 洗浄手順を完了したら、M9Wの3〜5 mLを加えて卵ペレットを再中断します。室温(RT)でチューブローテーターで18rpmの速度でチューブを一晩回転させます。
  8. 一晩インキュベーションした後、ローテーターからチューブを取り出し、1分間450xgでチューブを遠心してL1幼虫をペレットにする。 250 μLまでM9Wを吸引し、チューブに残します。
  9. チューブを振って幼虫を再中断します。幼虫を含む3つの5μL滴をペトリ皿の蓋に加えます。解剖顕微鏡を使用すると、各ドロップ内のワームの数をカウントし、1 μLのワームの数を決定します。

4. 薬物アッセイの調製

注: このアッセイの手順を図 1に示します。

  1. 大 腸菌 OP50の30mLを、150rpmの軌道シェーカーで一晩37°Cで50 mLの円錐管で成長させます。
  2. 細胞をペレットに10分間4,000 x gで一晩成長させた大腸菌OP50培養を回す。上清を取り除き、M9Wの3mLでペレットを再懸濁し、培養を濃縮する。
  3. 薬物アッセイ用の作業溶液を調製する前に、0.1 mL(95%エタノールで5 mg/mL)コレステロールをM9Wの100 mLに加えます。
  4. 各薬剤と車両(ジメチルスルホキシド)を希釈することにより、各実験薬の作業溶液を準備します。DMSO)は、適切な濃度を得るためにコレステロールを補充して4.8 mL M9Wで。DmSOをM9Wの4.8 mLに溶かし、コレステロールを補い、車両制御を準備します。
  5. 200 μL の濃縮 大腸菌 OP50 培養液を、車両制御または薬物と渦管を含む各チューブに加え、混合を確認します。
  6. 実験を行うために、各作業薬物溶液または車両制御の2mLを12ウェル組織培養プレートの各ウェルに加える。各薬剤濃度と車両制御を重複してテストします。
  7. 滅菌マイクロピペットを使用して、ウェルあたり〜100 L1幼虫(同期 C.エレガンス 培養ステップを参照)を加える。ワームのボリュームを 10 μL に制限します。
  8. プレートを20°Cでインキュベートする。
  9. 必要に応じて、アッセイ3日目に10倍濃縮大 腸菌 OP50の50 μLのウェルを補います。

5. 顕微鏡用アガロースパッド調製

  1. 5 mLの脱イオン水に0.1 gのアガロースを溶解してアガロースの2%w/v溶液を調製する。中含量をマイクロ波で加熱し、アガロースを溶解します。20枚のスライドはアガロース溶液の5 mLから調製することができる。
  2. 2枚のガラススライドに沿ってラボテープのストリップを置きます。テープはアガロースパッドの厚さを制限するスペーサーとして機能します。その後、テーピングされたスライドの間に3番目のきれいなガラススライドを置きます。
  3. アガロースパッドを作るために、きれいなスライドの中心に溶融アガロースの100 μLを見つける。アガロースの上に別のきれいなガラススライドを置き、軽く押してパッドを形成します。パッドが固まったら、上のスライドを取り外します。

6.let-60、let-23およびlin-1株におけるMuv表現型の観察

注 :let-23 および let-60 株中のMuv表現型を抑制する候補薬物のみが lin-1 株を使用してアッセイされ、RASまたはEGFRのレベルで阻害が起こるかどうかを判断します。

  1. ライフサイクルの適切な段階に達すると (let-60 および let-23 株の場合は3日間 、lin-1 株では5日間)、プレートをインキュベーターから取り出します。ピペットを使用して15 mLの円錐管でワームを収集します。
  2. 450 x g でチューブを 1 分間遠心分離します。
  3. ステップ 6.2 を 2 回繰り返します。
  4. ワームペレットを邪魔することなく、吸引によって残りすべてのM9Wを除去する。その後、500 μLの2 mMナトリウムアジ化ナトリウムまたは2 mMテトラミゾール塩酸塩を加えます。チューブをRTで15分間2 mMのアジドナトリウムまたは2 mMテトラミソール塩酸塩でインキュベートさせて、イメージング用のワームを麻酔します。
    注意:アジドナトリウムを扱う際は、必ず個人用保護具(PPE)を着用してください。溶液は化学フードの下で準備されなければならない。
  5. 麻酔付きワーム懸濁液を10μLをアガロースパッドの中央に加えます。ワームサスペンションの上に#1.5カバースリップをそっと置きます。必要に応じて、カバースリップをマニキュアで固定して乾燥を防ぎます。
  6. DIC顕微鏡を使用して 、let-60(n1046) 、let-23(sa62) および lin-1(sy254)株 を観察します。10倍と20倍の倍率でワームを画像化します。
  7. let-60(n1046)とlet-23 (sa62)の場合は、Muv 表現型の有無に基づいて成虫のワームをスコア付けします。lin-1株の場合、L4幼虫の腹側に1°または2°の細胞運命を採用した数のVPCを、高解像度DIC顕微鏡で数数とします。
  8. 各株および薬物治療の顕微鏡写真を採点した後、Studentの t-検定を行い、治療間の統計的な違いを決定する。

結果

まず、R-フェンジリンがDMSO処理されたワームと比較して、let-60(n1046)変異株中のMuv表現型を抑制できることを実証する。我々のデータは、R-フェンジリンが用量依存的な方法でlet-60(n1046)のMuv表現型をブロックできることを示している(図2A,B)。しかし、R-フェンジリンの濃度の上昇に応答して、Muv表現型の非反転がlin-1ヌル突然変異株で観察...

ディスカッション

このワームを用いて説明するアッセイは、EGFRおよびRAS機能の阻害剤を同定するために、簡単かつ安価である。 C.エレガンス は、短いライフサイクル(20°Cで3日間)と多数の幼虫を生成する能力のために実験室で成長しやすいので、創薬のための魅力的なモデルです。さらに重要なことに、EGFR-RAS-ERK MAPK経路は、EGFRおよびRAS阻害剤の効果を分析する遺伝的に難解なシステムを提供する哺乳...

開示事項

著者らは、競合する財政的利益を宣言しない。

謝辞

私たちは 、let-60(n1046)を提供してくれたスワティ・アルール博士(MDアンダーソンがんセンター)に感謝します。また 、lin-1 株に対するデビッド・ライナー博士(ヒューストンのテキサスA&Mヘルスサイエンスセンターバイオサイエンス&テクノロジー研究所)にも感謝します。最後に、試薬の一部を提供してくれたダニエル・ガーシン博士と彼女の研究室(テキサス大学、マクガヴァン医科大学)に感謝します。いくつかのワーム株は、研究インフラプログラムのNIHオフィス(P40 OD010440)によって資金提供されているCGCによって提供されました。この研究は、テキサス州癌予防研究所(CPRIT)がJFハンコックにRP200047を付与することによって支援されました。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
Media and chemicals
Agarose Millipore Sigma A9539-50G
Bacto Peptone Fisher ScientificDF0118-17-0
BD Difco Agar Fisher ScientificDF0145-17-0
BD Difco LB BrothFisher ScientificDF0446-17-3
Calcium ChlorideFisher ScientificBP510-500
CholesterolFisher ScientificICN10138201
Magnesium SulfateFisher ScientificBP213-1
NystatinAcros organicsAC455500050
Potassium Phosphate DibasicFisher ScientificBP363-500
Potassium pPhosphate MonobasicFisher ScientificBP362-500
R-FendilineCommercially Synthesized (Pharmaceutical grade)
Sodium AzideMillipore Sigma S2002-25G
Sodium chloride Fisher ScientificBP358-1
Sodium HydroxideFisher ScientificSS266-1
8.25% Sodium Hypochlorite Bleach
Sodium Phosphate Dibasic Fisher ScientificBP332-500
Streptomycin Sulfate Fisher ScientificBP910-50
(−)-Tetramisole HydrochlorideMillipore Sigma L9756
UO126 (MEK inhibitor)Millipore Sigma 19-147
Consumables 
15mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes Fisher Scientific12-565-269
50mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge TubesFisher Scientific12-565-271
Disposable Polystyrene Serological Pipettes 10mLFisher Scientific07-200-574
Disposable Polystyrene Serological Pipettes 25mLFisher Scientific07-200-575
No. 1.5  18 mm X 18 mm Cover SlipsFisher Scientific12-541A
Petri Dish with Clear Lid (60 x 15 mm)Fisher ScientificFB0875713A
Petri Dishes with Clear Lid (100X15mm)Fisher ScientificFB0875712
Plain Glass Microscope Slides (75 x 25 mm)Fisher Scientific12-544-4
12- Well Tissue Culture PlatesFisher Scientific50-197-4804
Software 
PrismGraphpad
Bacterial Strains
E. coli OP50
Worm Strains
StrainGenotypeTransgeneSource
MT2124  let-60(n1046) IV.CGC
MT7567lin-1(sy254) IV.CGC
PS1839let-23(sa62) II.CGC

参考文献

  1. Marshall, M. Interactions between Ras and Raf: key regulatory proteins in cellular transformation. Molecular Reproduction and Development. 42 (4), 493-499 (1995).
  2. Whelan, J. T., Hollis, S. E., Cha, D. S., Asch, A. S., Lee, M. H. Post-transcriptional regulation of the Ras-ERK/MAPK signaling pathway. Journal of Cellular Physiology. 227 (3), 1235-1241 (2012).
  3. Grandis, J. R., Tweardy, D. J. Elevated levels of transforming growth factor alpha and epidermal growth factor receptor messenger RNA are early markers of carcinogenesis in head and neck cancer. Cancer Research. 53 (15), 3579-3584 (1993).
  4. Sasahira, T., Kirita, T., Kuniyasu, H. Update of molecular pathobiology in oral cancer: a review. International Journal of Clinical Oncology. 19 (3), 431-436 (2014).
  5. Stransky, N., et al. The mutational landscape of head and neck squamous cell carcinoma. Science. 333 (6046), 1157-1160 (2011).
  6. Bos, J. L. ras oncogenes in human cancer: a review. Cancer Research. 49 (17), 4682-4689 (1989).
  7. Downward, J. Targeting RAS signalling pathways in cancer therapy. Nature Reviews Cancer. 3 (1), 11-22 (2003).
  8. Prior, I. A., Lewis, P. D., Mattos, C. A comprehensive survey of Ras mutations in cancer. Cancer Research. 72 (10), 2457-2467 (2012).
  9. Hancock, J. F. Ras proteins: different signals from different locations. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 4 (5), 373-384 (2003).
  10. Hancock, J. F., Parton, R. G. Ras plasma membrane signalling platforms. Biochemical Journal. 389, 1-11 (2005).
  11. van der Hoeven, D., et al. Fendiline inhibits K-Ras plasma membrane localization and blocks K-Ras signal transmission. Molecular and Cellular Biology. 33 (2), 237-251 (2013).
  12. Moghal, N., Sternberg, P. W. The epidermal growth factor system in Caenorhabditis elegans. Experimental Cell Research. 284 (1), 150-159 (2003).
  13. Sundaram, M. V. RTK/Ras/MAPK signaling. WormBook. , 1-19 (2006).
  14. Ferguson, E. L., Horvitz, H. R. Identification and characterization of 22 genes that affect the vulval cell lineages of the nematode Caenorhabditis elegans. Genetics. 110 (1), 17-72 (1985).
  15. Katz, W. S., et al. A point mutation in the extracellular domain activates LET-23, the Caenorhabditis elegans epidermal growth factor receptor homolog. Molecular and Cellular Biology. 16 (2), 529-537 (1996).
  16. Hara, M., Han, M. Ras farnesyltransferase inhibitors suppress the phenotype resulting from an activated ras mutation in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (8), 3333-3337 (1995).
  17. Reiner, D. J., Gonzalez-Perez, V., Der, C. J., Cox, A. D. Use of Caenorhabditis elegans to evaluate inhibitors of Ras function in vivo. Methods in Enzymology. 439, 425-449 (2008).
  18. van der Hoeven, D., et al. Sphingomyelin Metabolism Is a Regulator of K-Ras Function. Molecular and Cellular Biology. 38 (3), (2018).
  19. Beitel, G. J., Tuck, S., Greenwald, I., Horvitz, H. R. The Caenorhabditis elegans gene lin-1 encodes an ETS-domain protein and defines a branch of the vulval induction pathway. Genes & Development. 9 (24), 3149-3162 (1995).
  20. Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Ceron, J. Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation. Journal Visualized Experiments. (64), e4019 (2012).
  21. Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , 1-11 (2006).
  22. Revtovich, A. V., Lee, R., Kirienko, N. V. Interplay between mitochondria and diet mediates pathogen and stress resistance in Caenorhabditis elegans. PLoS Genetics. 15 (3), 1008011 (2019).
  23. Zimmermann, M., Zimmermann-Kogadeeva, M., Wegmann, R., Goodman, A. L. Mapping human microbiome drug metabolism by gut bacteria and their genes. Nature. 570 (7762), 462-467 (2019).
  24. Moghal, N., Garcia, L. R., Khan, L. A., Iwasaki, K., Sternberg, P. W. Modulation of EGF receptor-mediated vulva development by the heterotrimeric G-protein G-alpha q and excitable cells in C. elegans. Development. 130 (19), 4553-4566 (2003).

転載および許可

このJoVE論文のテキスト又は図を再利用するための許可を申請します

許可を申請

さらに記事を探す

164 LET 60 LET 23 K RAS EGFR GFP

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

個人情報保護方針

利用規約

一般データ保護規則

お問い合わせ

図書館への推薦

JoVE ニュースレター

研究

教育

著者

図書館員

JoVEについて

Copyright © 2023 MyJoVE Corporation. All rights reserved