次世代シーケンシングを用いたT細胞受容体免疫レパートリー解析

要約

現在のプロトコルは、血液サンプルおよび腸内生検からのDNA分離、次世代シーケンシングのためのTCRβおよびIGH PCRライブラリの生成、NGSランの性能および基本的なデータ分析のための方法を記述する。

要約

免疫学的記憶は、適応免疫の特徴であり、Tリンパ球およびBリンパ球によって調整される。循環や異なる器官では、何十億ものユニークなT細胞クローンとB細胞クローンがあり、それぞれが特定の抗原に結合し、増殖、分化および/またはサイトカイン分泌につながる。T細胞とB細胞の広大な異種性は、異なる遺伝的セグメントのランダムな組み換えによって生成される。過去10年間に開発された次世代シーケンシング(NGS)技術は、TおよびB細胞受容体免疫レパートリーの前例のない詳細なビューを可能にします。様々な炎症性疾患、免疫不全、感染症および悪性腫瘍の研究は、クローン性、遺伝子使用法、および免疫レパートリーの生物物理学的特性の顕著な変化を示し、異なる疾患における適応免疫応答の役割に関する重要な洞察を提供した。

ここでは、血液および組織からのTおよびB細胞の免疫レパートリーのNGSに対する詳細なプロトコルを提供する。DNAの単離から図書館の準備、NGSシーケンサーのシーケンシング、基本的な分析で終わるパイプラインを提示します。この方法は、ヌクレオチドまたはアミノ酸レベルでの特定のTおよびB細胞の探索を可能にし、したがって、異なる疾患におけるリンパ球集団および多様性パラメータの動的変化を同定することができる。この技術はゆっくりと臨床現場に入っており、新しいバイオマーカー、リスク階層化、精密医療の同定の可能性を秘めています。

概要

Tリンパ球とBリンパ球で構成される適応免疫系は、免疫学的記憶を利用して、以前に遭遇した抗原を認識し、迅速な応答を開始する。リンパ球は骨髄で発生し、胸腺(T細胞)または骨髄(B細胞)で成熟する。T細胞受容体(TCR)とB細胞受容体(BCR)の両方が、特異的抗原の認識を可能にする独自の構成を示す。ホメオスタシスでは、T細胞とB細胞は常に循環し、抗原提示細胞に提示される異なるペプチドの兆を調査する。高い親和性を有する特定の抗原のTCRまたはBCRライゲーションは、適切な共刺激と共に、細胞活性化をもたらし、サイトカイン分泌、クローン拡張および抗体の生成をもたらし、B細胞の場合に。

異なるTまたはB細胞の巨大な配列は、総称して免疫レパートリーと呼ばれます, 異なるエピトープの無数の認識を可能にします.このような広大なレパートリーを生成するために、異なる遺伝子セグメントのランダム集合の複雑なプロセスが起こり、ユニークな抗原¹に結合することができる受容体のほぼ無限の組み合わせを作成する。このプロセスは、V(D)Jの組み換えと呼ばれ、異なる変数(V)、多様性(D)および結合(J)遺伝子の再配列を含み、結合^部2におけるヌクレオチドのランダムな欠失および挿入を伴う。

適応免疫システムのアーキテクチャは、何十年もの間、異なる分野の科学者に興味を持っ....

プロトコル

この研究は、シェバ医療センターの機関審査委員会によって承認され、すべての参加対象からインフォームド・コンセントが得られました。

1. DNAの分離と定量

1. 腸内生検の消化と細胞のリシス
   1. 腸内生検を取り出し、採取したばかりか、-20°Cまたは-80°Cで保存したものを回収する。 凍結生検を使用する場合は、氷の上で解凍します。
   2. 氷の上で冷やされた無菌1.7 mLマイクロ遠心分離チューブに600 μLの核溶解溶液を加えます。
   3. リシス溶液を用いたマイクロ遠心チューブに生検を入れ、65°Cで15〜30分間インキュベートします。
   4. 17.5 μLの20 mg/mLプロテイナーゼKを加え、穏やかな揺れで55°Cで一晩インキュベートします。
   5. サンプルを室温まで5分間冷却してから、ステップ1.3に進みます。
2. 全血の細胞リシス
   1. EDTA-、ヘパリン、またはクエン酸含有チューブで全血の3 mLを得る。
   2. チューブを十分に混合するまで軽く揺れ、9 mLの細胞溶解液を含む無菌15 mL遠心分離管に血液を移す。室温で10分のインキュベーション期間中に数回反転します。
   3. 室温で10分間2,000 x gで遠心分離機を使用し、可視の白いペレットを邪魔することなく、できるだけ多くの上清を捨て....

結果

ここでは、腸組織および血液からのDNA分離方法、NGS用ライブラリの調製、免疫レパートリーシーケンシングのためのシーケンシングランの基本的なステップについて述べうる。実行は、国際ImMunoGenetics(IMGT)/HighV-QUESTプラットフォームで使用するために、さらにfastaファイルに変換することができ、fastqファイルを生成します。このHTSは、ヌクレオチドレベル¹⁵で、何万もの再?.......

ディスカッション

Bリンパ球およびTリンパ球の存在量および機能の変化は、しばしば異なる悪性腫瘍¹⁸において遭遇するが、慢性炎症性疾患(例えば、潰瘍性大腸炎および関節リウマチ^)10、19、および種々の免疫不全^17、20において。現在の方法では、NGSを利用してTCRおよびBCRレパートリーの詳細なビューを?.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-propanol	Sigma	I9516-500ML
1.7 mL micro-centrifuge tubes	Axygen	8187631104051
15 mL centrifuge tubes	Greiner	188261
Absolute ethanol	Merck	1.08543.0250
Amplitaq Gold	Thermo Fisher	N8080241
AMPure XP Beads	Beckman Coulter	A63881
Heat block	Bioer	Not applicable
High Sensitivity D1000 Sample Buffer	Agilent	5067-5603	For Tapestation
High Sensitivity D1000 ScreenTape	Agilent	5067-5584	For Tapestation. Tubes sold seperately
Lymphotrack Assay kit	Invivoscribe	TRB: 70-91210039 IGH: 70-92250019	Each includes 24 indexes
MiSeq Reagent Kit v2 (500 cycle)	Illumina	MS-102-2003	Includes standard flow cell type and all reagents required
MiSeq Sequencer	Illumina	SY-410-1003
PCR strips	4titude	4ti-0792
Proteinase K	Invitrogen	EO0491
Qubit 4 Fluorometer	Thermo Fisher	Q33226
Qubit dsDNA HS Assay Kit	Thermo Fisher	Q32854	Includes buffer, dye, standards, and specialized tubes
Shaker	Biosan	Not applicable
Tapestation 2100 Bioanalyzer	Agilent	G2940CA
ultra pure water	Bio-lab	7501
Wizard DNA isolation kit	Promega	A1120	Includes cell lysis solution, nuclei lysis solution, and protein precipitation buffer