次世代シーケンシングを用いたT細胞受容体免疫レパートリー解析

要約

現在のプロトコルは、血液サンプルおよび腸内生検からのDNA分離、次世代シーケンシングのためのTCRβおよびIGH PCRライブラリの生成、NGSランの性能および基本的なデータ分析のための方法を記述する。

要約

免疫学的記憶は、適応免疫の特徴であり、Tリンパ球およびBリンパ球によって調整される。循環や異なる器官では、何十億ものユニークなT細胞クローンとB細胞クローンがあり、それぞれが特定の抗原に結合し、増殖、分化および/またはサイトカイン分泌につながる。T細胞とB細胞の広大な異種性は、異なる遺伝的セグメントのランダムな組み換えによって生成される。過去10年間に開発された次世代シーケンシング(NGS)技術は、TおよびB細胞受容体免疫レパートリーの前例のない詳細なビューを可能にします。様々な炎症性疾患、免疫不全、感染症および悪性腫瘍の研究は、クローン性、遺伝子使用法、および免疫レパートリーの生物物理学的特性の顕著な変化を示し、異なる疾患における適応免疫応答の役割に関する重要な洞察を提供した。

ここでは、血液および組織からのTおよびB細胞の免疫レパートリーのNGSに対する詳細なプロトコルを提供する。DNAの単離から図書館の準備、NGSシーケンサーのシーケンシング、基本的な分析で終わるパイプラインを提示します。この方法は、ヌクレオチドまたはアミノ酸レベルでの特定のTおよびB細胞の探索を可能にし、したがって、異なる疾患におけるリンパ球集団および多様性パラメータの動的変化を同定することができる。この技術はゆっくりと臨床現場に入っており、新しいバイオマーカー、リスク階層化、精密医療の同定の可能性を秘めています。

概要

Tリンパ球とBリンパ球で構成される適応免疫系は、免疫学的記憶を利用して、以前に遭遇した抗原を認識し、迅速な応答を開始する。リンパ球は骨髄で発生し、胸腺(T細胞)または骨髄(B細胞)で成熟する。T細胞受容体(TCR)とB細胞受容体(BCR)の両方が、特異的抗原の認識を可能にする独自の構成を示す。ホメオスタシスでは、T細胞とB細胞は常に循環し、抗原提示細胞に提示される異なるペプチドの兆を調査する。高い親和性を有する特定の抗原のTCRまたはBCRライゲーションは、適切な共刺激と共に、細胞活性化をもたらし、サイトカイン分泌、クローン拡張および抗体の生成をもたらし、B細胞の場合に。

異なるTまたはB細胞の巨大な配列は、総称して免疫レパートリーと呼ばれます, 異なるエピトープの無数の認識を可能にします.このような広大なレパートリーを生成するために、異なる遺伝子セグメントのランダム集合の複雑なプロセスが起こり、ユニークな抗原¹に結合することができる受容体のほぼ無限の組み合わせを作成する。このプロセスは、V(D)Jの組み換えと呼ばれ、異なる変数(V)、多様性(D)および結合(J)遺伝子の再配列を含み、結合^部2におけるヌクレオチドのランダムな欠失および挿入を伴う。

適応免疫システムのアーキテクチャは、何十年もの間、異なる分野の科学者に興味を持っています。以前は、サンガーシーケンシング、相補決定領域3(CDR3)スペクトルタイピング、およびフローサイトメトリーを使用して免疫レパートリーを特徴付け、低分解能を提供した。過去10年間で、次世代シーケンシング(NGS)法の進歩により、個人のTCRおよびBCRレパートリー^3,4の特性と組成に関する詳細な洞察が可能になった。これらのハイスループットシステム(HTS)配列と処理は、同時に並べ替えられたTCRまたはBCR製品の数百万を、ヌクレオチドまたはアミノ酸レベルで特定のTおよびB細胞の高解像度分析を可能にします。NGSは、健康と病気の両方の免疫レパートリーを研究するための新しい戦略を提供します。HTSを利用した研究は、自己免疫疾患におけるTCRおよびBCRレパートリーの改変を実証した^5、原発性免疫不全^6、7、および急性骨髄性白血病における悪性腫瘍⁸などである。NGSを用いて、我々および他の人々は、炎症性腸疾患(IBD)を有する患者において、潰瘍性大腸炎およびクローン病^{9、10、11、12、13、14}のオリゴクローナル拡張を示している。全体として、異なる分野からの研究は、レパートリーの変化が免疫媒介性疾患の病因において重要な役割を果たしていることを示唆している。

現在のプロトコルは、腸内生検および血液からのDNAの分離、NGS用のTCRβおよびIGH PCRライブラリの生成、およびシーケンシング実行の性能を記述する。免疫レパートリーデータ解析の基本ステップも提供しています。このプロトコルは、TCRα、TCRγ、およびIGLライブラリの生成にも適用できます。この方法は、組織特異的な消化プロトコルが使用されている限り、他の器官(例えば、リンパ節、腫瘍、滑液、脂肪組織など)と互換性がある。

プロトコル

この研究は、シェバ医療センターの機関審査委員会によって承認され、すべての参加対象からインフォームド・コンセントが得られました。

1. DNAの分離と定量

1. 腸内生検の消化と細胞のリシス
   1. 腸内生検を取り出し、採取したばかりか、-20°Cまたは-80°Cで保存したものを回収する。 凍結生検を使用する場合は、氷の上で解凍します。
   2. 氷の上で冷やされた無菌1.7 mLマイクロ遠心分離チューブに600 μLの核溶解溶液を加えます。
   3. リシス溶液を用いたマイクロ遠心チューブに生検を入れ、65°Cで15〜30分間インキュベートします。
   4. 17.5 μLの20 mg/mLプロテイナーゼKを加え、穏やかな揺れで55°Cで一晩インキュベートします。
   5. サンプルを室温まで5分間冷却してから、ステップ1.3に進みます。
2. 全血の細胞リシス
   1. EDTA-、ヘパリン、またはクエン酸含有チューブで全血の3 mLを得る。
   2. チューブを十分に混合するまで軽く揺れ、9 mLの細胞溶解液を含む無菌15 mL遠心分離管に血液を移す。室温で10分のインキュベーション期間中に数回反転します。
   3. 室温で10分間2,000 x gで遠心分離機を使用し、可視の白いペレットを邪魔することなく、できるだけ多くの上清を捨てます。残りの液体の約50〜100 μLが残ります。
   4. 渦管は完全に再懸濁されるまで15 sのために精力的に。3 mLの核溶解溶液とピペットを数回加えます。解決策は粘性になるはずです。
3. タンパク質沈殿
   1. 組織に200μLのタンパク質沈殿バッファーを加えるか、血液に1 mLを加えます。20sのために激しく渦を、5分間氷の上でインキュベート。小さなタンパク質塊は、渦の後に見ることができる。
   2. 遠心分離機 16,000 x g で 4 分間沈殿タンパク質を含むタイトなペレットが形成されるはずです。
   3. 慎重にペレットを乱すことなく、上清を新しい1.7 mLチューブに移します。
      注:ペレットがタイトでない場合は、4分間16,000 x g で別の遠心分離機を検討してください。
4. DNA沈殿と水分補給
   1. 上清を含むチューブに2-プロパノール1mLを加え、反転させて軽く混ぜます。DNAは白い浮遊物質として見えるようになるはずです。
   2. 16,000 x g で遠心分離機 1分間ピペットを使用して上清を完全に取り除く。
   3. 1 mLの新しく調製した70%エタノールを加え、チューブを数回反転させます。室温で1分1分の16,000 x g で遠心分離機。上清を慎重に捨てなさい。
   4. ステップ 1.4.3 を繰り返します。
   5. 開いたチューブをクリーンな吸収性紙に10〜15分間反転します。チューブを再反転し、完全な水分補給を確認します。必要に応じて、さらに10〜15分間空気乾燥してください。
      注:ペレットを完全に乾燥させることは非常に重要です。
   6. 50 μLの超純水(UPW)を加えます。必要に応じて、DNAは定量後により希釈することができる。
   7. 65°Cのヒートブロックで1時間インキュベートし、DNAリハイドレーションを行います。
5. DNA定量
   注:DNAは、材料表に指定されたフルオロメーターと指定試薬を使用して定量化しました。
   1. 標準を室温に持ち込み、0.5 mL指定チューブを含むキットを準備します。
   2. サンプル数に応じて、バッファーと色分けを15 mLチューブで調製します。サンプルあたり200μLのバッファーと1μLの染料を加えます。標準用のサンプルを2つ含めます。バッファーが十分でないことを避けるために、追加サンプルを計算することをお勧めします。
      1. 2つの標準では、上記の調製済みミックスの190 μLを0.5 mLチューブに入れてください。標準の10 μLを追加します。
      2. 各サンプルに対して、上記の調製済みミックスの199 μLを0.5 mLチューブに入れてください。DNAを1μL加えます。
   3. サンプルを読んでください。結果は、サンプルのDNA濃度を示す。
   4. サンプルが限界を超えている場合は、DNA 1:10をUPWで希釈し、読み取りを繰り返します。

2. 図書館の準備

注:現在のプロトコルは、NGSシーケンサーと互換性のあるマルチプレックスPCRベースのアッセイキットを使用しています。このキットには、V βおよびJ β領域内の各ターゲットの保存領域に24の異なるインデックスが含まれています。これにより、異なるサンプルのワンステップPCR反応とプールが可能になります。詳細については、資料一覧を参照してください。

1. DNAサンプルを準備します。150 ngのDNAを得て、合計5 μLのUPWを加えます。
   注:最低濃度10 ng/μLで、ライブラリー調製には150ng未満のDNAを使用することが可能です。
2. 残留DNAを分解するために15分間UVライトでフードにピペットとチップを入れます。一方、異なるインデックスチューブ(ライブラリ調製用)とDNAポリメラーゼが氷の上で解凍することを可能にする。
3. 生物学的フードでは、異なるインデックスチューブから45 μLをPCRチューブに追加します。その後、ステップ2.1で作製したDNAポリメラーゼを0.2μL、5μLのDNAをPCRチューブに加えます。
4. メーカーの指示に従って、事前設定プログラムを使用してPCR反応を実行します。

3. アンプリコンの精製と定量

1. 過剰なプライマー、ヌクレオチド、酵素の除去には、磁気ビーズを使用してください。
   1. ビーズを室温まで30分以上温めます。サンプルあたり400 μLに対して、80%のエタノールを十分に準備します。
   2. 各PCRチューブに50μL(IGH)または35μL(TCRβ)を加え、10回ピペットで混合します。室温で10分インキュベートします。
   3. 混合サンプルを磁気スタンドに5分間置きます。
   4. 透明液の95μL(IGH)または80μL(TCRβ)を吸引し、廃棄する。10 μL の先端を使用して残りの液体を吸引します。
   5. 各サンプルに200μLの80%エタノールを加えます。インキュベート 30 s.195 μLのエタノールを吸引し廃棄する。10 μL の先端を使用して残りの液体を吸引します。
   6. ステップ 3.1.5 を繰り返します。チューブのキャップを開け、空気を5分間乾燥させます。
   7. 5分後、磁気スタンドから取り出し、溶出バッファー(10 mM Tris-HCl、pH 8.0)を25 μL加えます。均質になるまでピペットで混ぜます。室温で2分間インキュベートします。
   8. チューブを磁気スタンドに5分間置きます。22 μL を新しい PCR チューブに移します。DNA濃度を測定する(ステップ1.5)。
2. アンプリコン定量
   注: 現在のプロトコルでは、DNAの濃度、サイズ、および完全性の品質管理に自動化された電気泳動機を使用しています。詳細については、資料一覧を参照してください。
   1. 試薬とスクリーンテープを室温で30分以上置きます。
   2. 新しい1.7 mLマイクロ遠心分離チューブで、ステップ3.1.8で定量したDNAサンプルを、少なくとも3μLの総体積でUPWで定量化します。
   3. 使用前に渦を希釈したDNA。2 μL のバッファーを、事前にラベル付けされた特殊 PCR ストリップ (キットに用意) に希釈した DNA の 2 μL と共に置き、キャップを置きます。シェーカーに1分間置き、続いてPCRストリップのスピンダウンを行います。
      メモ:バッファーの粘性のため、サンプルチューブに移る前に余分なバッファをチップから取り除くことを確認してください。
   4. キャップなしで機械、スクリーンテープ、PCRストリップに置きます。機械の中の先端箱のふたを開けろ。適切なラベルを使用して位置を割り当てます。マシンを起動します。
      注: 出力ヒストグラムは、アンプリコンの目的のサイズで単一のピークにする必要があります(図1A)。品質の悪いサンプルでは、追加のピークが観察されます (図 1B),悪いビーズのクリーンアップまたはプライマーダイマーの形成を示します.

4. 次世代シーケンシング

1. ライブラリの定量化とプール
   1. nMの最終DNA濃度を算出し、ステップ3.1.8からのDNA値を用いて、製品のピークの塩基対(bp)のサイズと、電気泳動機の結果から得た( 図1参照)。
   2. 各サンプルについて、最終濃度4 nMの最終濃度を10~20 μLの溶出バッファーで測定するDNA容積を計算します。
   3. 各サンプルに新しい希釈ミックスを準備し、それから2μLを新しいプールミックスに取り込みます。
      注: 4 nM 未満のサンプルの場合は、可能な限りサンプルの量を追加します。
2. 図書館のNGSラン
   注: 現在のプロトコルでは、ベンチトップ シーケンサー プラットフォームを使用します。詳細については、資料一覧を参照してください。
   1. 0.2 N NaOHの新鮮な溶液を準備します。ステップ 4.1.3 で作成した希釈ライブラリに 0.2 N NaOH の 10 μL を追加します。チューブと渦に5%のPhiXを短時間追加します。チューブをスピンダウンして、すべての溶液がチューブの底に落ち着くようにします。
   2. 二重鎖DNAを変性させるために室温で5分間インキュベートする。キットから980 μLのプレチルドバッファーを、DNAと渦を含むチューブに短時間追加します。
   3. 希釈したライブラリーを氷の上に置き、次のようにライブラリを準備します。17 pMの混合の場合、ステップ 4.2.2 および 575 μL のバッファーから 425 μL の DNA を追加します。ライブラリを数回反転し、スピンダウンします。最終ライブラリの600μLを指定カートリッジに積み込み、サンプルを機械に入れます。
   4. ソフトウェアの指示に従って実行を開始します。

5. シーケンシング解析

1. シーケンシング・メトリックをシーケンサーからダウンロードし、シーケンシング・データが次の範囲 (現行プロトコルで使用されているキットに固有) 内であることを確認します。これらの条件を満たさないサンプルは、繰り返し実行される可能性があります。
   クラスター密度(密度(K/mm2)):945K - 1800K
   フィルターを通過する読み取りの割合 (クラスター PF (%)): >90%
   品質スコア(%>=Q30):>85%
   PhiXアライメント(アラインメント%):1.5%-10%
   PhiXエラー率(%):<1.0%

結果

ここでは、腸組織および血液からのDNA分離方法、NGS用ライブラリの調製、免疫レパートリーシーケンシングのためのシーケンシングランの基本的なステップについて述べうる。実行は、国際ImMunoGenetics(IMGT)/HighV-QUESTプラットフォームで使用するために、さらにfastaファイルに変換することができ、fastqファイルを生成します。このHTSは、ヌクレオチドレベル¹⁵で、何万もの再?...

ディスカッション

Bリンパ球およびTリンパ球の存在量および機能の変化は、しばしば異なる悪性腫瘍¹⁸において遭遇するが、慢性炎症性疾患(例えば、潰瘍性大腸炎および関節リウマチ^)10、19、および種々の免疫不全^17、20において。現在の方法では、NGSを利用してTCRおよびBCRレパートリーの詳細なビューを?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-propanol	Sigma	I9516-500ML
1.7 mL micro-centrifuge tubes	Axygen	8187631104051
15 mL centrifuge tubes	Greiner	188261
Absolute ethanol	Merck	1.08543.0250
Amplitaq Gold	Thermo Fisher	N8080241
AMPure XP Beads	Beckman Coulter	A63881
Heat block	Bioer	Not applicable
High Sensitivity D1000 Sample Buffer	Agilent	5067-5603	For Tapestation
High Sensitivity D1000 ScreenTape	Agilent	5067-5584	For Tapestation. Tubes sold seperately
Lymphotrack Assay kit	Invivoscribe	TRB: 70-91210039 IGH: 70-92250019	Each includes 24 indexes
MiSeq Reagent Kit v2 (500 cycle)	Illumina	MS-102-2003	Includes standard flow cell type and all reagents required
MiSeq Sequencer	Illumina	SY-410-1003
PCR strips	4titude	4ti-0792
Proteinase K	Invitrogen	EO0491
Qubit 4 Fluorometer	Thermo Fisher	Q33226
Qubit dsDNA HS Assay Kit	Thermo Fisher	Q32854	Includes buffer, dye, standards, and specialized tubes
Shaker	Biosan	Not applicable
Tapestation 2100 Bioanalyzer	Agilent	G2940CA
ultra pure water	Bio-lab	7501
Wizard DNA isolation kit	Promega	A1120	Includes cell lysis solution, nuclei lysis solution, and protein precipitation buffer