液体クロマトグラフィー質量分析とバイオインフォマティクスによるペプチドグリカンの半定量分析

要約

このプロトコルは、液体クロマトグラフィー質量分析と高度な特徴抽出およびバイオインフォマティクス分析ソフトウェアを組み合わせたペプチドグリカン組成の詳細な分析をカバーしています。

要約

ペプチドグリカンは、細菌の細胞壁の重要な成分であり、抗菌剤の一般的な細胞標的です。ペプチドグリカン構造の側面はすべての細菌でかなり保存されていますが、グラム陽性/陰性の間および種間でもかなりのばらつきがあります。さらに、成長段階および/または環境刺激に応答して細菌種内で起こり得るペプチドグリカンに対する多数の既知のバリエーション、修飾、または適応がある。これらの変異は、成長/分裂、抗生物質耐性、宿主防御回避など、多くの細胞機能に関与することが知られている非常に動的な構造を生成します。ペプチドグリカン内の変動を理解するには、全体的な構造をその構成部分(ムロペプチドとして知られる)に分解し、全体的な細胞組成を評価する必要があります。ペプチドグリコミクスは、高度な質量分析と強力なバイオインフォマティクスデータ分析を組み合わせて、ペプチドグリカンの組成を詳細に調べます。以下のプロトコルでは、細菌培養物からのペプチドグリカンの精製、液体クロマトグラフ質量分析計によるムロペプチド強度データの取得、およびバイオインフォマティクスを使用したペプチドグリカン組成の鑑別分析について説明します。

概要

ペプチドグリカン(PG)は、タンパク質やその他の細胞成分の構造的サポートを提供しながら、細胞の形態を維持するのに役立つ細菌の決定的な特徴です^1,2。PGの骨格は、β-1,4結合N-アセチルムラミン酸(MurNAc)とN-アセチルグルコサミン(GlcNAc)が交互に結合しています^1,2。各MurNAcは、隣接する二糖結合ペプチドに架橋することができるᴅ-ラクチル残基に結合した短いペプチドを持っています(図1A、B)。この架橋により、細胞全体を囲む網目状の構造が生成され、しばしば嚢と呼ばれます(図1C)。PG合成中、前駆体は細胞質内で生成され、フリッパーゼによって細胞質膜を横切って輸送される。前駆体は、続いてトランスグリコシラーゼおよびトランスペプチダーゼ酵素によって成熟PGに組み込まれ、それぞれグリコシド結合およびペプチド結合を生成する³。しかし、一旦組み立てられると、PGを修飾および/または分解して成長および分裂を含む多くの細胞プロセスを実行する細菌によって産生され....

プロトコル

1.ペプチドグリカンサンプル調製

1. 細菌培養物の増殖
   注:細菌培養物の増殖は、細菌種および検査対象の増殖条件によって異なります。テストする実験パラメータは、成長条件を定義します。
   1. 細菌株と実験計画に必要な増殖条件下で細菌培養物を増殖させる。細菌を三重培養物(生物学的複製)、すなわち株または増殖条件ごとに3つの別々のコロニーとして増殖させる。
      注:成長条件および成長段階は、PG^{組成1、2、10}に有意な影響を与えることが知られている。培養と反復の間の一貫性を維持するために細心の注意を払う必要があり、組成の変化は実験誤差ではなく実験パラメータによるものであることを確認する必要があります。
   2. 培養液を4°Cまで急冷し、遠心分離(11,000 x g、10分、4°C)により回収し、細胞ペレットを-20°Cで凍結した。 凍結前にセルペレットを予冷した4°C、pH 6.5の20mMリン酸ナトリウムで洗浄する。凍結細胞ペレットの製造は、収集プロセス中にPGを変更および/または分解する可能性のある酵素の活性を制限するために、サンプル間で可能な限り迅速かつ一貫して行う必要があります。サンプルは、凍結することなく抽出プロセス(セクション1.2)で直接処理....

結果

強力なピーク認識ソフトウェアと相まって、MS機械の検出感度の向上により、複雑なサンプルの物質組成を非常に詳細に分離、監視、分析する能力が向上しました。これらの技術的進歩を利用して、ペプチドグリカン組成に関する最近の研究では、古いHPLC^{ベースの方法論}11,25,26,27,28,29,30,31よりも自動LC-MS特徴抽出技術12,13,.......

ディスカッション

このプロトコルは、細菌培養物からペプチドグリカンを精製する方法、LC-MS検出のプロセス、およびバイオインフォマティクス技術を使用した組成の分析について説明しています。ここではグラム陰性菌に着目し、グラム陽性菌の分析を可能にするには若干の修正が必要になります。

ムロペプチドの調製は、1960年代に最初に製造されて以来、実質的に同じままです9,11,15?.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
C18 reverse phase column - AdvanceBio Peptide column (100 mm x 2.1 mm 2.7 µm)	Agilent		LC-MS data acquisition
Heating mantle controller, Optichem	Fisher	50-401-788	for 4% SDS boil
Heating Mantle, 1000mL Hemispherical	Fisher	CG1000008	for 4% SDS boil
Incubator, 37°C			for sacculi purification and MS sample prep
Leibig condenser, 300MM 24/40,	Fisher	CG121805	for 4% SDS boil
Lyophilizer	Labconco		for lyophilization of sacculi
Magentic stirrer	Fisher	90-691-18	for 4% SDS boil
mass spectrometer Q-Tof model UHD 6530	Aglient		LC-MS data acquisition
microcentrifuge filters, Nanosep MF 0.2 µm	Fisher	50-197-9573	cleanup of sample before MS injection
Retort stand	Fisher	12-000-102	for 4% SDS boil
Retort clamp	Fisher	S02629	for 4% SDS boil
round bottom flask - 1 liter pyrex	Fisher	07-250-084	for 4% SDS boil
Sonicator model 120	Fisher	FB120	for sacculi purification
Sonicator - micro tip	Fisher	FB4422	for sacculi purification
Ultracentrifuge	Beckman		sacculi wash steps
Ultracentrifuge bottles, Ti45	Fisher	NC9691797	sacculi wash steps
Water supply	City		for water cooled condenser
Software
Chemdraw	Cambridgesoft		molecular editor for muropeptide fragmentation prediction
Excel	Microsoft		viewing lists of annotated muropeptides, abundance, isotopic patterns, etc.
MassHunter Acquisition	Aglient		running QTOF instrument
MassHunter Mass Profiler Professional	Aglient		bioinformatic differential analysis
MassHunter Personal Compound Database and Library Manager	Aglient		muropeptide m/z MS database
MassHunter Profinder	Aglient		recursive feature extraction
MassHunter Qualitative analysis	Aglient		viewing MS and MS/MS chromatograms
Prism	Graphpad		Graphing software
Perseus	Max Plank Institute of Biochemistry		1D annotation
Material
Acetonitrile	Fisher	A998-4
Ammonium acetate	Fisher	A637
Amylase	Sigma-Aldrich	A6380
Boric acid	Fisher	BP168-1
DNase	Fisher	EN0521
Formic acid	Sigma-Aldrich	27001-500ML-R
LC-MS tuning mix - HP0321	Agilent	G1969-85000
Magnesium chloride	Sigma-Aldrich	M8266
Magnesium sulfate	Sigma-Aldrich	M7506
Mutanolysin from Streptomyces globisporus ATCC 21553	Sigma-Aldrich	M9901
Nitrogen gas (>99% purity)	Praxair	NI 5.0UH-T
Phosphoric acid	Fisher	A242
Pronase E from Streptomyces griseus	Sigma-Aldrich	P5147
RNase	Fisher	EN0531
Sodium azide	Fisher	S0489
Sodium borohydride	Sigma-Aldrich	452890
Sodium dodecyl sulfate (SDS)	Fisher	BP166
Sodium hydroxide	Fisher	S318
Sodium Phosphate (dibasic)	Fisher	S373
Sodium Phosphate (monobasic)	Fisher	S369
Stains-all	Sigma-Aldrich	E9379