タンパク質とマイクロRNA変調がアディポサイト機能に及ぼす影響を研究するアディポサイト細胞培養モデル

要約

ここでは、小干渉RNA(siRNA)、マイクロRNA模倣体(miRs)、抗マイクロRNA(抗miR)などのオリゴヌクレオチドを成熟したアディポサイトに送達し、タンパク質およびマイクロRNA発現を調節するプロトコルを紹介します。

要約

アディポサイト機能の変化は、2型糖尿病およびインスリン抵抗性を含む代謝性疾患の病因に寄与する。これは、肥満関連疾患に対する新しい治療法を開発するために、アディポサイト機能不全に関与する分子メカニズムをよりよく理解する必要性を強調している。アディポサイトにおけるタンパク質および マイクロRNAの 発現を調節することは、依然として非常に困難である。本論文では、マウス線維芽細胞を成熟したアディポ細胞に分化し、小干渉RNA(siRNA)およびマイクロRNA模倣(miR模倣)オリゴヌクレオチドを用いた逆トランスフェクションを通じて成熟したアディポ細胞におけるタンパク質およびマイクロRNAの発現を調節するプロトコルについて述べている。この逆トランスフェクションプロトコルは、トランスフェクション試薬とオリゴヌクレオチドのインキュベーションを含み、成熟したアディポサイトが添加される細胞培養プレートに複合体を形成する。次に、このアディポサイトは、オリゴヌクレオチド/トランスフェクション試薬複合体の存在下で、接着板表面に再び付着させられます。インスリンシグナル伝達、グルコース取り込み、脂肪生成、脂肪分解の研究などの機能解析を、トランスフェクトした3T3-L1成熟脂肪細胞に対して行い、脂肪細胞機能に対するタンパク質またはマイクロRNA操作の影響を研究することができます。

概要

肥満は、インスリン抵抗性(IR)、2型糖尿病(T2D)、および心血管疾患¹を含む多数の代謝性疾患の主要な危険因子と考えられている。現在の治療法は、これらの疾患の絶えず増加する有病率を止めることができず、肥満および糖尿病患者のIRの管理は依然として重要な臨床的問題である。脂肪組織は、エネルギー恒常性の制御に重要な役割を果たし、肥満時のその病理学的拡張は、IRおよびT2D2、3の発達に寄与する。これは、肥満関連疾患に対する新しい治療法を開発するために、アディポサイト機能不全に関与する分子メカニズムをよりよく理解する必要性を強調している。多くの研究は、アディポサイト生理学におけるタンパク質コードRNAの役割と肥満との関連を調査してきました。

最近では、非コードRNA(ncRNA)、特にマイクロRNA(miRs)の発見は、遺伝子発現プログラムの調節機構に関連する新しい概念を偽造している。研究は、ncRNAが、有数細胞細胞機能の重要な調節因子であり、その調節不調が代謝性疾患において重要な役割を果たしていることを示している^。したがって、アディポサイトにおけるタンパク質およびncRNAの操作は、アディポサイト機能におけるそれらの役割とT2Dなどの病理への影響を解読するために重要である。しかし、生体内および一次アディポサイトにおけるタンパク質およびncRNAの発現を操作することは依然として非常に困難であり、体外の椎骨細胞モデルの使用を支持する。

Mtune 3T3-L1線維芽細胞は、脂肪細胞機能(例えば、インスリンシグナル伝達、グルコース取り込み、脂肪分解および脂肪分泌)5、6、7、8、9、10を研究するために使用される十分に特徴付けられる細胞株である成熟した、機能的、およびインスリン応答性脂肪細胞に容易に分化する。これらの特性は、3T3-L1アディポサイトを、タンパク質コードおよびnc-RNAの発現を調節し、有分細胞機能におけるその役割と肥満関連疾患における潜在的な役割を解読する魅力的なモデルにする。残念ながら、3T3-L1線維芽細胞は市販の試薬を使用してトランスフェクトしやすいのに対し、分化された3T3-L1アディポサイトはトランスフェクトするのが最も困難な細胞株の1つである。このため、3T3-L1細胞における遺伝子発現を操作する数多くの研究が、アディポサイト機能ではなく、アディポサイト分化に焦点を当てています。

長い間、アディポ細胞をトランスフェクトする唯一の効率的な技術はエレクトロポレーション⁵であり、これは退屈で高価であり、細胞損傷を引き起こす可能性があります。本論文では、トランスフェクションの実用時間を短縮する一般的なトランスフェクション試薬を用いた逆トランスフェクション技術を報告し、細胞の生存率に影響を及ぼさないため、エレクトロポレーションよりもはるかに安価である。このプロトコルは、マイクロRNA模倣(miR模倣)および抗miRsのようなsiRNAおよび他のオリゴヌクレオチドのトランスフェクションに完全に適している。逆トランスフェクションプロトコルの原理は、トランスフェクション試薬とオリゴヌクレオチドをインキュベートして細胞培養プレートに複合体を形成し、成熟したアディポサイトをウェルに播種する。次いで、このアディポサイトは、オリゴヌクレオチド/トランスフェクション試薬複合体の存在下で接着板表面に再び付着する。このシンプルで効率的で安価な方法論は、有数体細胞機能におけるタンパク質コードRNAおよびmiRの役割と肥満関連疾患におけるその潜在的な役割の研究を可能にする。

プロトコル

注: 滅菌技術を使用して、層流細胞培養フード内のプロトコルのすべてのステップを実行します。すべての試薬および装置の詳細については、 資料表 を参照してください。

1. 腺3T3-L1線維芽細胞のアディポ細胞への分化

1. 3T3-L1線維芽細胞を、ピルビン酸を含まない培地DMEM、25mMグルコース、10%新生児の子牛血清、および1%ペニシリンおよびストレプトマイシンを含む培地中のDMEMで3T3-L1の繊維芽細胞を成長させる(図1A)。培養インキュベーター(7%CO2および37°C)に皿を入れる。
2. 合流から2日後、 培地を変更し、ピルビン酸なしDMEM、25mMグルコース、10%の胎児血清(FCS)、および1%ペニシリンおよびストレプトマイシンに0.25 mM 3-イソブチル-1-メチルキサンチン(IBMX)、0.25 μMデキサメタゾン、5 μg/mL、インスリンスキタゾン、インスリンスライト10を補充した。
   注:細胞が100 mm皿あたり30万個の細胞で播種されると、合流するまでに5日かかります。
3. 2日後、培養液をピルビン酸、25 mMグルコース、10%FCS、ペニシリンおよびストレプトマイシン1%に5μg/mLインスリンと10μMロシグリタゾンとインキュベートを2日間補充してDMEMに置き換えます。次いで、2日毎にピルビン酸、25 mMグルコース、10%FCS、および1%ペニシリンおよびストレプトマイシン(図1B)で細胞を供給する。
4. 分化プロトコルの開始から7-8日後に3T3-L1のアディポサイトをトランスフェクトする。
   注:トランスフェクション後に残りの線維芽細胞の増殖を避けるために、トランスフェクションの前に高いレベルの分化(>80%)に到達することが重要であり、結果に偏る可能性のある細胞の混合集団につながる可能性があります。

2. プレコートプレートの準備

1. トランスフェクションの前日または数時間前に、1mg/mLのストック溶液から30%エタノールで100μg/mLのコラーゲンタイプIの溶液を調製します。12ウェルプレートのウェルあたり250μL、24ウェルプレートのウェルあたり125 μLを加え、ウェルの表面に溶液を広げます。
2. コラーゲンが乾くまで、培養フードの下に蓋をせずにプレートを放置します。ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩分(D-PBS)で2回洗浄します。
   注:プレコーティングされたプレートは購入可能です。

3. トランスフェクションミックスの調製

注: siRNA の最終的な濃度は 1 ~ 100 nM (12 ウェル プレートのウェルあたり 1 ~ 100 pmol siRNA) です。miRの模倣の最終的な集中は10 nM(10 pmol/well)である。実験を開始する前に、各siRNA、miR模倣、または他のオリゴヌクレオチドの最適な濃度を決定し、オフターゲット効果を回避します。結果の統計分析を容易にするために三重でトランスフェクション実験を行います。ピペット処理中の通常の損失を考慮して、過剰に全ての試薬を準備してください。

1. 改善された最小必須培地(表1)とsiRNA(または他のオリゴヌクレオチド)をピペッティング(体積/体積)で混合する。室温で5分間インキュベートします。
2. トランスフェクション試薬と改良された最小必須培地をsiRNAに加え、ミキシングするピペットを加える(表1)。室温で20分間インキュベートします(この間、セクション4に進みます)。コラーゲンコーティングされたプレートの各ウェルにトランスフェクションミックスを追加します。

4. 3T3-L1のアディポサイトの調製

1. 100mmペトリ皿の細胞をD-PBSで2回洗います。5倍のトリプシンを細胞に加え(100mm皿あたり1mL)、すべての表面をトリプシンで覆うことを確認します。30 s を待ち、慎重にトリプシンを取り外します。
2. ペトリ皿をインキュベーターで37°Cで5〜10分間インキュベートします。100mm皿をタップしてセルを取り外します。
3. ピルビン酸なしのDMEM10ml、25mMグルコース、10%FCS、ペニシリンとストレプトマイシン1%を加えてトリプシンを中和します。慎重に上下に培地をパイプし、細胞を取り外し、細胞懸濁液を均質化します。
4. マラッセス計房または自動セルカウンターを使用して細胞を数え、培地の6.25 x 10⁵ 細胞/mLに細胞の濃度を調整します。12ウェルプレート(5 x¹⁰⁵ 細胞)またはトランスフェクションミックスを含む24ウェルプレート(2.5 x¹⁰⁵ 細胞)の細胞懸濁液/ウェルの800μLの種子。
   注:アディポサイトの100ミリメートルペトリ皿は、12ウェルプレートまたは1つの24ウェルプレートの調製を可能にします。100 mm皿は通常6-7 x 10⁶ のアディポサイトを含み、12ウェルプレートのウェルあたり5 x 10⁵ のアディポサイトに相当する。
5. プレートを細胞培養インキュベーター(7%CO2および37°C)にインキュベートし、24時間細胞を乱さない。翌日は、上清をピルビン酸、25 mMグルコース、10%FCS、ペニシリンおよびストレプトマイシンを使用せずに、新鮮なDMEMに慎重に交換してください。
   注:また、コラーゲンプレコーティング48-および96ウェルプレートに細胞を播種することも可能ですが、アディサイトの剥離を避けるためにメディアを交換する際に、より多くの予防措置を取ります。

5. トランスフェクト3T3-L1の異胞細胞の機能解析

1. mRNAおよびタンパク質に対するsiRNAまたはmiR模倣送達後の24-48時間および48-96時間の標的ノックダウンをそれぞれ研究した。
2. トランスフェクトされた脂肪細胞の機能解析を行い、インスリンシグナル伝達、グルコース取り込み、アディポカイン分泌、脂肪分解、およびリポジェネシスを研究する。

結果

3T3-L1アディポサイトにおけるタンパク質またはマイクロRNAの発現を調節するためにここで説明する逆トランスフェクションの手順を用いて、このアディポサイトはトランスフェクション後にそれらの形態を維持することが示されている(図1B、C)。実際、トランスフェクションの2日後、脂肪細胞は、プレートに良好に広がり、結合し?...

ディスカッション

本論文では、成熟したアディポサイトの分化とトランスフェクションに関する詳細なプロトコルを紹介する。この逆トランスフェクション法は、トランスフェクトが最も困難な細胞株の1つである3T3-L1アディポサイトにsiRNA、マイクロRNA模倣、および抗マイクロRNAのようなオリゴヌクレオチドをトランスフェクトする簡便で経済的で効率の高い方法である。この方法には、考慮する必要がある?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
12 well Tissue Culture Plate	Dutscher	353043
2.5% Trypsin (10x)	Gibco	15090-046	diluted to 5x with D-PBS
2-Propanol	Sigma	I9516
3-Isobutyl-1-methylxanthine	Sigma-Aldrich	D5879
Accell Non-targeting Pool	Horizon Discovery	D-001910-10-05
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma	A7030
Collagen type I from calf skin	Sigma-Aldrich	C8919
Dexamethasone	Sigma-Aldrich	D1756
D-PBS	Gibco	14190144
Dulbecco's  Modified Eagles's Medium (DMEM)	Gibco	41965062	4.5 g/L D-Glucose; L-Glutamine; no Pyruvate
Ethanol	Sigma	51976
FAM-labeled Negative Control si-RNA	Invitrogen	AM4620
Fetal Bovine Serum	Gibco	10270-106
Free Glycerol Reagent	Sigma-Aldrich	F6428
Glycerol Standard Solution	Sigma-Aldrich	G7793
HSP90 antibody	Santa Cruz	sc-131119	Dilution : 0.5 µg/mL
Improved Minimal Essential Medium (Opti-MEM)	Gibco	31985-047
Insulin, Human Recombinant	Gibco	12585-014
miRIDIAN micro-RNA mimics	Horizon Discovery
miRNeasy Mini Kit	Qiagen	217004
miScript II RT Kit	Qiagen	218161
miScript Primer Assays Hs_RNU6-2_11	Qiagen	MS00033740
miScript Primer Assays Mm_miR-34a_1	Qiagen	MS00001428
miScript SYBR Green PCR Kit	Qiagen	219073
Newborn Calf Serum	Gibco	16010-159
Oil Red O	Sigma	O0625
ON-TARGETplus Mouse Plin1 si-RNA SMARTpool	Horizon Discovery	L-056623-01-0005
Penicillin and Streptomycin	Gibco	15140-122
Perilipin-1 antibody	Cell Signaling	3470	Dilution : 1/1000
Petri dish 100 mm x 20 mm	Dutscher	353003
PKB antibody	Cell Signaling	9272	Dilution : 1/1000
PKB Phospho Thr308 antibody	Cell Signaling	9275	Dilution : 1/1000
Rosiglitazone	Sigma-Aldrich	R2408
Transfection reagent (INTERFERin)	Polyplus	409-10
α-tubulin antibody	Sigma aldrich	T6199	Dilution : 0.5 µg/mL
Vamp2 antibody	R&D Systems	MAB5136	Dilution : 0.1 µg/mL