マウスの後肢におけるレーザードップラー灌流イメージング

要約

ここでは、マウス後肢の血流を測定するためのレーザードップラー灌流イメージングの技術と必要な制御を実証するプロトコルを提示する。

要約

血流回復は、実験的な後肢虚血または虚血再灌流後の重要な結果測定である。レーザードップラー灌流イメージング(LDPI)は、血流回復を評価するための一般的な、非侵襲的で反復可能な方法です。この技術は、レーザーが赤血球を動かすときに引き起こされる周波数のドップラーシフトからサンプリングされた組織の全体的な血流を計算する。測定は任意の灌流単位で表現されるため、脚に対して非介入された対側は、通常、測定を制御するために使用されます。測定深さは0.3-1 mmの範囲にある。後肢虚血に対して、これは真皮灌流が評価されることを意味する。皮膚灌流は、いくつかの要因に依存します - 最も重要な皮膚温度と麻酔薬は、信頼性の高い測定値を得るために慎重に制御する必要があります。さらに、毛髪や皮膚の色素沈着は、真皮に到達するか浸透するレーザーの能力を変更することができます。この資料では、マウスの後肢における LDPI の手法について説明します。

概要

不十分な創傷治癒を伴う皮膚潰瘍は、ヒト患者¹における切断の主な原因である。十分な創傷治癒は、末梢動脈疾患^2、3、4の患者において損なわれる無傷の皮膚を維持するために必要とされるより高いレベルの動脈灌流を必要^とする。他のいくつかのリウマチの状態と糖尿病はまた、傷^5、6を癒すために皮膚の微小循環を妨げ、不十分に導く可能性がある。多くの糖尿病患者は、付随する末梢動脈疾患を有し、切断のリスクが特に高い。レーザードップラー灌流イメージング(LDPI)は、臨床的な状況で皮膚の微小循環を評価するために用いられ、また、実験的後肢虚血、虚血再灌流、及び微小外科的フラップ⁷後の血流および血流回復を評価する研究状況において用いられる。

LDPIシステムは、関心のある領域の上を移動するためにスキャンミラーによって偏向される低電力レーザービームを投影します。これは、レーザドップラーフローメトリーとは異なり、フローメトリープローブ⁸と直接接触する組織の小領域に対する灌流測定を提供する。レーザービームがマイクロバスキュアチュア内の移動血液と相互作用すると、ドップラー周波数シフトが発生し、スキャナによって光検出され、任意の灌流ユニットに変換されます。LDPIは光ベースの技術であるため、浸透深度の点で0.3〜1mmに制限され、大部分の真皮灌流は⁷と評価される。皮膚の温度や交感神経系によって皮膚の血流が変化し、これは様々な麻酔薬⁹によって影響を受ける可能性がある。光学レーザーからの測定はまた、周囲の照明条件、皮膚色素沈着の影響を受け、毛皮または毛髪⁷を上に横にすることによってブロックすることができる。

LDPIは、非侵襲的であり、コントラスト投与を必要とせず、複数の動物のデータ収集を可能にする迅速なスキャン時間を有するため、虚血後の灌流回復を監視するための最も一般的に使用される研究技術である。これは、治療の動脈新生や血管新生を目的とした治療法が小さな動物モデルに有効であるかどうかを判断するのに理想的です。LDPIによって測定された後の後肢虚血後の血流回復は、マイクロフィル鋳造またはマイクロ^CT10、11などの他の手段によって評価された場合の副動脈の発達とよく相関する。このプロトコルの目的は、LDPIを用いた後肢灌流の評価を実証することです。

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プロトコル

動物実験は、ワシントン大学の制度的動物ケアおよび使用委員会によって承認されたプロトコルに従って行われました。

1. スキャナーの準備

1. スキャン対象までの距離が約 30 cm になるように、スキャナーの高さを調整します。
2. イメージャーの電源を入れ、関連するソフトウェアを起動します。
3. 測定プログラムを開きます。ソフトウェアがスキャナと正しく通信している場合は、赤外線レーザーの電源がオンの警告が表示されます。
4. メーカーが提供する標準で機械を較正します(ビデオには表示されず、使用されているマシンの特定のモデルに依存します)。
5. 室内の背景素材と照明設定に適したスキャナー設定を調整します。
   1. 製造元の指示に従ってゲインレベル DC FLUX と CONCを設定します(ビデオには表示されません)。
   2. 黒の背景素材にレーザー光を向けて背景のしきい値を設定し 、Auto BK Setを押します。

2. マウスの事前スキャン準備

1. 廃棄物ガスの適切な清掃でイソフルラン誘導室を設置します。
   注:誘導室を加温パッドに置くと、麻酔誘導時のマウス温度低下を防ぐことができます。
2. 非反射面の下のスキャン領域に置かれたホーム温気ブランケット(この場合は黒いネオプレン生地)をオンにします。37 °Cの体温を維持するために、家庭の吸熱毛布をセットします。
3. 家庭用の毛布と潤滑剤の温度プローブを、挿入の準備ができているように置きます。
4. 麻酔マスクと清掃システムをスキャンエリアに設置します。
5. イオブルラン気化器でマウスを麻酔します。酸素率を1 L/minの流量に設定し、麻酔誘導のためにイオブルランを4%に調整します。麻酔誘導室への流れをオンにすると、マウスの呼吸速度が遅くなります。マウスが右反射を失うと、適切な麻酔が得られます。
6. マウスを取り付けた廃ガススカベンジャーを使用して麻酔マスク/ノーズコーンに移し、イソフルランを1.5%に調整します。
   注:この麻酔レベルは、一般的にスキャン中にマウスを比較的静かに保つために十分ですが、麻酔の外科的レベルを提供することを意図していませんので、麻酔の深さはチェックされません。イソフルランレベルを変更すると、心拍、呼吸、真皮灌流の変化が生じ、時間経過実験全体およびすべての実験対象に対して一貫した割合を使用する必要があります。ケタミンキシラジンのIP注入などの代替麻酔技術も使用できますが、異なる麻酔薬が異なる皮膚灌流に影響を与えるのと同じ麻酔技術をコース研究を通して使用する必要があります。
7. (スキャンエリアによりオプション)スキャン対象とする計画領域が毛皮で覆われている場合は、小さな電気トリマーまたは脱毛クリームを使用して、対象領域から髪を取り除きます。
   注:脱毛クリームは完全に除去し、マウスの皮膚はスキャン前に乾燥する必要があります。
8. ホーム温帯ブランケットを覆う黒色の非反射面にマウスを適切なスキャン位置に置き、両方の後肢が平衡およびスキャンを通じて熱源に残っていることを確認する(図1)。
   注:温度の地域的な変動を防ぐために、家庭の吸熱毛布の上に両足を維持することが重要です。
9. ホームソアミックブランケットに関連付けられた潤滑直腸温度プローブを挿入します。
10. マウス温度を所望の走査温度(37°C)に平衡化します。約5〜10分。
11. 上部メニューまたは スキャナ設定アイコンからアクセスできる [スキャナのセットアップ] を選択します。対象領域に合わせて X-Y 座標を変更して、スキャン領域を調整します。スキャン速度は、スキャンの解像度に依存します。解像度が高いほど、スキャン時間が長くなります。解剖灌流に焦点を当てた高解像度とは対照的に、グローバル灌流に焦点を当てた反復スキャンでは、4 ms/pixelのスキャン速度が十分です。
    注:研究者が開発中の副循環(皮膚に近い腹側の大腿とふくらはぎで最もよく画像化されている)を直接研究しようとしている場合は、より高い解像度と単一スキャンを考慮する必要があります。マウスフットパッドのエンドオルガンへのグローバルな灌流を評価する場合、低解像度/速度(例えば4 ms/pixel)での反復スキャンは十分です。ビデオに示されているソフトウェアは、再起動時にスキャン領域、速度、解像度のために以前に使用したテンプレートを自動的にロードするか、さまざまな対象領域がさまざまな実験に使用されている場合は保存されたファイルから取得することができます。
12. 繰り返しスキャンを実行する場合は、[ 繰り返しおよびライン スキャン ] タブを選択します。スキャンの数は、繰り返し間隔と同様に変更することができます(この場合は3スキャン)。繰り返し間隔の最小時間は、スキャン領域とスキャン解像度によって決定されるボックスの右側のグレー表示領域に表示される、推定スキャン時間になります。数秒を追加すると、ユーザーはスキャンの間に必要に応じてマウスを一時停止し、マウスの位置を変更できます。

3. スキャン

1. [イメージ スキャン] タブを選択し、[マーク] ボタンを選択します。レーザーはスキャン領域の輪郭に移動します。スキャン対象のターゲットがマークされた領域内になるように、マウスの位置を調整します。
   注: フットパッドまたはフットパッドおよびふくらはぎのスキャンでは、後肢を拡張して位置を決めやすい場合は、supine の位置よりも一貫した関心領域を提供します。大腿動脈と伏在動脈および副巻は、大腿部とふくらはぎの腹側表面に非常に近いので、これらの対象領域を使用する場合は、スピーヌ位置が好ましい。
2. 繰り返しスキャンアイコンを選択して測定を繰り返し開始し、再生ボタンを押してスキャンを開始します。
3. ポップアップ ウィンドウでスキャン距離を確認し、[OK] をクリックしてスキャンを開始します。
4. マウスの動きのスキャン中にマウスを監視します。スキャンの途中で、マウスが十分に移動して、スキャン領域にヒンドポーが存在しない場合は、スキャンを再開します。マウスのヒンドポー位置の小さな変化は、解析ソフトウェアに対応することができます。
5. ホーム温気ブランケットを使用しても変動する可能性があるため、スキャンプロセス中にマウス温度を監視します。マウス温度にばらつきが多すぎる場合、スキャンの間に大きな変動が生じる可能性があります。一般的に、36.8~37.2 °Cの温度範囲は許容可能なデータとなります。
6. キャプチャしたスキャンを [名前を付けて保存] ウィンドウの下に、マウス ID とタイムポイントを含むファイル名を付けて保存し、データ分析を容易にします。必要に応じて、マウスとタイムポイントの詳細を[件名の詳細]ウィンドウに入力します。
7. イオフイオフ、直腸温度プローブを取り外します。
8. 直腸温度プローブを70%エタノールで消毒して、次のマウスで使用できます。
9. マウスが麻酔から右反射を表示する時点まで回復できるように、ケージに戻す前に、直面する位置に、直面する可能性のある位置に反転させます。
   注:回復は非常に迅速であるか、ケタミン/キシラジンのための暖かい回復ケージで、イゾフルランのための温暖化毛布のいずれかで行うことができます。

4. LDPI データのキャプチャ (図 3)

1. イメージングレビューソフトウェアプログラムを開きます。
2. ファイル メニューに移動し、開いて保存したファイルを見つけます。
3. ツールバーから ROI アイコンを選択します。
4. [ ポリゴンの追加] ボタンを選択します。
5. マウスを使用して、コントロールの後肢の対象領域 (ROI) をトレースします。ポリゴン トレースは、計算された平均に灰色の背景が含まれないため、正確である必要はありません。
6. 手術後肢についてステップ4.3~4.5を繰り返します。
7. [統計情報] アイコンを選択して、[イメージ ROI 統計結果 (PU)]ウィンドウを開きます。
8. ポリゴン 1 (後肢コントロール) とポリゴン 2 (外科的後肢) の結果をコピー/貼り付けを使用してデータ収集ワークシートにエクスポートします。

5. 分析

1. 各スキャンの外科/制御比率としてデータをキャプチャします。
2. その時点での特定のマウスのデータポイントの 3 つのスキャンすべてに平均された外科/制御を使用します。後肢虚血に対する応答の生物学的変動のために、一般に8〜10匹のマウスが〜10%標準誤差で再現可能な結果を達成するために、時間的に必要とされる。
   注:マウスが麻酔から回復できるようにする前に、繰り返しスキャンの迅速な分析を実行して、データが可変すぎるかどうかを確認する価値があります(例えば、スキャン1-3の間で100〜150以上の灌流ユニットが異なります)。繰り返しスキャンの間に大きな変動は、マウスがスキャン中に完全に平衡化されないことを示唆しています (図 2)、データポイントを失うことなく繰り返しスキャンを実行できます。表示されるフラックス値のダイナミックレンジを最適化するためにカラーパレットを変更する方が、表示スキャンのバリエーションを改善するために必要な場合があります(図2)。

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結果

成功したLDPIは、3つのスキャン間で100〜150個以下の灌流ユニット変動(マウスフットパッドの通常の平均灌流の約10%に相当する)を持つ、一貫した反復測定スキャンをもたらすはずです(図2)。図2に示すように、反復スキャンは、マウスが適切に平衡化されていることを判断し、虚血/制御比が温度変動によって引き起こされる真皮灌流の変動とは対照?...

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ディスカッション

LDPI を使用して信頼できる結果を得るには、一貫した手法が不可欠です。同じ麻酔薬、温度設定、マウス位置、関心領域は、全期間を通して使用する必要があります。異なる麻酔薬は、より高いまたは低い灌流値^{9をもたらす}。イオブルラン麻酔は、その急速な発症と出現だけでなく、全体的な安全性のために便利です。イソフルランの一貫した割合は、この血管拡張剤が皮?...

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資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Black nonreflective material			Fabric store, black neoprene recommended by company
F/air cannister	A.M. Bickford Inc	80120
Homeothermic blanket with rigid metal probe	Harvard Apparatus		Also comes with flexible probe, but this is less durable
Isoflurane Anesthesia machine	Drager		Multiple manufacturers
Isoflurane induction chamber	VetEquip	941444	2 L chamber
Moor laser Doppler perfusion imager	Moor Instruments	MoorLDI2-IR	Higher resolution imager (MoorLDI2-HIR)
Mouse Anesthesia nose cone			Multiple manufacturers
Nair	Nair
Oxygen tank			Multiple manufacturers
Surgilube	Multiple distributors