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この記事について

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要約

組織のクリアの精製方法が開発され、成体マウスの心臓に適用された。この方法は、遺伝的レポーター戦略に起因する標識された線維芽細胞蛍光を維持しながら、緻密な自己蛍光心臓組織をクリアするように設計された。

要約

心血管疾患は、世界中で最も一般的な死亡率の原因であり、しばしば心臓機能の変化と心室の剛性の増加につながる可能性がある高められた心臓線維症によってマークされています。心室線維症のこの増加は、常駐線維芽細胞の活性化によるもので、これらの細胞が3次元(3-D)心臓内でどのように動作するかは、ベースラインまたは活性化後に、よく理解されていない。線維芽細胞が3D心臓における心臓病とそのダイナミクスにどのように寄与するかを調べるために、マウス心臓全体の蛍光標識心臓線維芽細胞を示す洗練されたCLARITYベースの組織クリアリングおよびイメージング法が開発されました。組織常駐線維芽細胞は、Tcf21-MerCreMerノックインラインを発現する心臓線維芽細胞と交差するRosa26-loxP-eGFPフローレストレポーターマウスを使用して遺伝的に標識した。この技術は、健康なマウスおよび心臓病の線維化マウスモデルにおける成人左心室全体にわたる線維芽細胞局在化ダイナミクスを観察するために使用された。興味深いことに、1つの傷害モデルでは、収縮方向に包まれた繊維のバンドに続く損傷したマウス心臓で心臓線維芽細胞のユニークなパターンが観察された。虚血性傷害モデルでは、線維芽細胞死が起こり、続いて梗塞境界領域からの再集団化が起こった。総称して、この精製された心臓組織の明確化技術およびデジタル化された画像化システムは、抗体の侵入の失敗または組織処理による失われた蛍光を取り巻く以前の問題の制限なしに心臓の心臓線維芽細胞を3D視覚化することを可能にする。

概要

心筋細胞は心臓の最大の体積分率を含むが、心臓線維芽細胞はより豊富であり、この器官のベースライン構造および修復特徴の調節に重大に関与する。心臓線維芽細胞は、移動性が高く、機械的に応答性が高く、その活性化の程度に応じて典型的に範囲が広がっています。心臓線維芽細胞は、細胞外マトリックス(ECM)の正常なレベルを維持するために必要であり、これらの細胞によるあまりにも少ないまたは多すぎるECM産生は、疾患1、2、3につながる可能性がある。心臓病における彼らの重要性を考えると、心臓線維芽細胞は、特に過剰な線維症4、5、6、7を制限しようとする新しい治療戦略を特定するための調査のますます重要なトピックとなっている。傷害時に、線維芽細胞は活性化し、筋線維芽細胞として知られているより合成細胞タイプに分化し、増殖し、豊富なECMを分泌し、心室を改造するのに役立つ収縮活性を有する。

心臓線維芽細胞は、2次元培養6、8、9、10においてその特性について広範囲に評価されてきたが、ベースラインまたは疾患刺激で、3次元の生きている心臓におけるその特性およびダイナミクスについてはるかに少なく理解されている。ここで、細胞の線維芽細胞の蛍光を維持しつつ、成人マウス心臓を組織クリアする精製方法が記載されている。心臓の中で、Tcf21は静止線維芽細胞4の比較的特異的なマーカーである。タモキシフェンが誘導可能なMerCreMerタンパク質を活性化するために与えられた後、本質的にすべての静止線維芽細胞は永久に生体内での追跡を可能にするRosa26遺伝子座から強化された緑色蛍光タンパク質(eGFP)を発現するであろう。

多数の確立された組織クリアプロトコルが存在し、そのうちのいくつかは心臓11、12、13、14、15、16、17に適用されている。しかし、異なる組織クリアプロトコルで使用される試薬の多くは、内因性蛍光信号18をクエンチすることが発見されている。さらに、成人心臓は、自己蛍光19を生成する豊富なヘム群含有タンパク質のためにクリアすることが困難である。したがって、このプロトコルの目標は、ビボ12、13、14、16、17、20における最適な3D可視化のために、負傷した成人心臓におけるヘム自己蛍光の同時阻害と共に線維芽細胞マーカー蛍光を維持することであった。

インビボで心臓線維芽細胞を調べようとする以前の研究は、これらの細胞を標識するために浸透抗体を採用したが、そのような研究は抗体の浸透および心血管構造14、16、17、20によって制限された。サラモンらは、新生児心臓における局所神経蛍光の維持と組織のクリアを示しているが、Nehrhoffらは骨髄細胞をマーキングする蛍光の維持を示しているが、心室壁全体を通る内因性蛍光の維持は、ベースラインまたは傷害後の成人心臓線維芽細胞の視覚化を含めて、まだ実証されていない。この組織クリアリングプロトコルは、CLARITY法(透明脂質交換アクリルアミドハイブリダイドリジジッドイメージング/イムノステイン/イン・シチュハイブリダイゼーション適合組織ヒドロゲル)およびPEGASOS(ポリエチレングリコール(PEG)関連溶媒システム)に基づいて、以前のプロトコルの混合物を精製します。この洗練されたプロトコルは、ベースラインでマウス心臓の心臓線維芽細胞のより堅牢な検査を可能にし、それらが異なるタイプの傷害にどのように反応するかの。プロトコルは簡単で再現可能であり、生体内の心臓線維芽細胞の挙動を特徴付けるのに役立ちます。

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プロトコル

マウスを含むすべての実験は、シンシナティ小児病院医療センターの施設動物ケアと使用委員会(IACUC)によって承認されました。機関はまた、AAALAC (米国ラボラトリーアニマルケア認定協会) 認定されています.マウスは頸部脱臼を介して安楽死させ、生存手術を受けているマウスには痛みの軽減が与えられた(下記参照)。疼痛管理および安楽死のために使用されるすべての方法は、米国獣医医師会の安楽死に関するパネルの勧告に基づいています。すべてのマウスは、常に利用可能な水と食べ物とトウモロコシのコブ寝具ユニットに収容されました。マウスは、同性を有するケージに4を収容した。手術や怪我をしていない組織のクリアのために、6-8週齢の雄と雌のマウスの同数が使用されました。

注:無菌手術の状態は、すべての手術で維持されました。外科医は清潔なスクラブと無菌のガウンに着替え、靴カバーとヘアネットを寄付しました。外科医はその後、クロルヘキシジンで手をこすり、無菌外科用手袋を寄贈した。外科医は、切開部位をそれぞれ3回鎮静、剃剃、スクラブした技術者によって支援され、2%クロロエクキシジングルコン酸塩と70%イソプロパノールの間で交互に行われた。その後、マウスを外科医に持ち込み、手術を行った。動物間、器具はビード滅菌器で滅菌した。

1. 遺伝子組換え

  1. クロスローザ26-ロックスP-eGFPマウス(Rosa26-nLacZ [FVB.Cg-Gt(ROSA)26Sortm1(CAG-lacZ,-EGFP)Glh/J])とTcf21-MerCreMerマウス(図1A)6,21.
  2. この十字架の子孫が6週齢に達すると、トウモロコシ油に溶解した75mg/kgのタモキシフェンの腹腔内注射を投与する。22このタモキシフェンを2回、48時間離して投与する(図1B)。
  3. タモキシフェン注射後、1週間タモキシフェン食品(約0.4g/kgタモキシフェンクエン酸塩)の食事にマウスを入れます。タモキシフェンチャウの1週間後、手術を行う前に1週間、マウスを通常のオートクレーブチャウ食に戻す(図1B)。適切な数のマウス(外科的状態あたり3匹)を、怪我をしていないコントロールに指定する。これらのマウスを犠牲にして、通常のチャウダイエットの1週間後に以下に記載したクリアリングプロセスに進む。
  4. タモキシフェンレジメンおよび組換えに続いて、手術を行う。

2. 外科モデル

  1. 虚血/再灌流(I/R)23,24
    1. 換気箱の室内空気の中に1.5%のイソフルランガスを用いてマウスを麻酔する;電気バリカンで胸と首を剃り、2%クロルヘキシジングルコン酸浸した綿棒で剃った領域をこすります。
    2. 人工涙軟膏を使用して、鎮静したマウスの目に軟膏を置くことによって手術中の乾燥を防ぎます。
    3. 手術用ハサミを使用して中首カットを行い、気管を視覚化します。20Gカテーテルを用いてチューブを気管に入れ、中頸部切開を通して気管カテーテルを可視化します。イソフルランガスで鎮静しながら人工呼吸器にマウスを置く(1.5%)室内の空気の中で。
    4. 手術用ハサミで左前肢の下に切開し、肋骨3と4の間の肋間筋を切断する。リトラクタを使用してリブを開きます。
    5. 肺と心臓の間の生理的なスポンジに浸した小さなスポンジを置き、肺の損傷を防ぎます。
    6. フィッシュフック針(6.5mm、3/8c)を使用して、左冠動脈を8-0で剥離可能なスリップノットで結びます。プロレン。
    7. 鉗子を使用してスポンジを取り外します。
    8. 4-0編組シルクと連続縫合糸を使用して閉じた肋間筋を縫合し、8-0の終わりを外装プロレンスリップノット。
    9. 閉塞したスリップ結び目の突出の端を有する局所組織接着剤を使用して皮膚切開を閉じる。
    10. 1時間の閉塞の後、スリップ結び目の外側端を引っ張って冠状動脈閉塞を内部に放出し、虚血を緩和し、再灌流を引き起こす。
    11. 1mg/mL拡張放出ブプレノルフィンの0.02mLを下皮注射(72時間放出)を鎮痛剤として投与し、他の動物とは別の37°Cの酸素化インキュベーションチャンバーにマウスを入れる。麻酔から回復し、胸骨または座っている位置を維持できるようになるまで、少なくとも15分ごとにマウスを監視します。マウスを通常のハウジングに戻します。
    12. 手術後48時間の痛みや苦痛を動物に評価し、完全に治癒するまで切開部位を毎日監視する。
    13. 犠牲になるまで、水分補給、栄養、および全体的な幸福のためにマウスを観察し、手術後に。
  2. 心筋梗塞(MI)25,26,27
    1. ステップ 2.1.1 ~ 2.1.7 を実行します。
    2. 4-0編組シルクを使用して肋間筋肉を閉じるには、連続縫合糸を使用します。
    3. 局所組織接着剤を使用して皮膚切開を閉じます。
    4. ステップ 2.1.11 ~ 2.1.13 を実行します。
  3. アンギオテンシンII/フェニレフリンマイクロ浸透圧ポンプ
    1. 準備 無菌条件下でのアンジオテンシンIIおよび500 μg/μL作動溶液の10 μg/μLの作業溶液を調製する(すなわち、 ラミナルフローフード)では、1mgのアンジオテンシンIIを100μLの無菌リン酸緩衝生理食塩水(PBS)と250mgのフェニレフリン塩酸塩を500μLのPBSに加えた。
    2. 各作業溶液の希釈と最終的な体積を計算し、マウスの重量に基づいてマイクロ浸透圧ポンプに分配します。
      注:例えば、20 gマウスは20g x 14日x 1.5 μg/日=420μgのアンジオテンシン、または42μLの作動溶液、ならびに20g x 14日x 50μg/日= 1400μgのフェニレフリン水塩水塩化物、または28μLの働く溶液を必要とする。
    3. 各マウスの重量については、滅菌PBSで薬剤の作業ストックを希釈し、27G針と1mLシリンジを使用してマイクロ浸透圧ポンプ(0.25 μL/h、14日、約100μL)を充填します。
      注:これは、アンジオテンシンIIの1日-1の流量を生成し、50 μg∙g-1日のフェニレフリン塩酸塩の1日-1をマウスに配置します。
    4. 室内の空気を含む換気チャンバーで1.5%のイオブルラン吸入(効果を得る)でマウスを麻酔する。
    5. 麻酔したマウスをオピン位置の無菌手術台に置き、イソフルランガス吸入で麻酔を維持する(1.5%)ノーズコーンを通して。
    6. 手術中の乾燥を防ぐために、動物の目に人工涙軟膏を使用してください。
    7. 電気毛バリクで埋め込み領域の上に毛皮を剃り、エタノールと滅菌綿棒を使用して切断する領域を殺菌します。背中の右側の肩甲骨の下にあるマウス皮膚の表皮層に外科用ハサミを入れた小さな切開(約1cm)を作ります。手術用ハサミの鈍い側面を使用して、移植の領域とその周辺の皮膚を優しく伸ばしてミニポンプを挿入します。
    8. マイクロ浸透圧ポンプを切開内に置き、皮膚の下で手動でポンプをマッサージしてマウスの下の内側の内側に物理的に操縦します。
    9. テーパーポイント針で4-0シルクを使用して連続縫合を介して切開を閉じます。
    10. ポンプ注入後、鎮痛薬の皮下注射(72-時間の遅い放出)を介して0.1mg /kg体重の用量で遅い放出ブプレノルフィンを投与する。他の動物とは別の37°Cの酸素化インキュベーションチャンバーにマウスを入れます。麻酔から回復し、胸骨または座っている位置を維持できるまで、少なくとも15分ごとにマウスを監視します。
    11. 37°Cの温室で麻酔から回復すると、マウスを標準のハウジングユニットに戻します。
    12. 手術後48時間の痛みや苦痛をマウスで監視し、完全に治癒するまで切開部位を毎日監視する。
    13. 犠牲になるまで、水分補給、栄養、および全体的な幸福のためにマウスを観察し、手術後に。

3. 変更されたアクティブなCLARITYプロトコルを使用して大人のマウスの心臓をクリア

  1. 手術表面と70%エタノールですべての手術ツールを殺菌することによって、きれいな外科区域を準備しなさい。PBS(100mL)で冷たい1x PBSおよび4%パラホルムアルデヒド(PFA)の溶液を調製する。手袋、ラボコート、フェイスマスク、目の保護を着用してください。
  2. 10単位のヘパリンを0.9%w/v塩化ナトリウム溶液に希釈してヘパリンバッファーを調製します。1 mLシリンジと27G針を用いて、各マウスを60μLのヘパリン-NaClで腹腔内に注入します。
  3. ヘパリン-NaCl溶液の注入の5分後、室温の空気を含む換気された部屋の1.5%イオブルラン吸入(効果に)を使用してマウスを麻酔する。
  4. 頸部脱臼によりマウスを安楽死させ、頭部の後部は平らで閉じた鉗子で保持され、脊柱は尾部を引っ張って脱臼する。
  5. 綿棒に70%エタノールでマウスの腹側表面をきれいにします。外科用はさみを使用してxiphoidプロセスの約3cm下に3cmの横切り切開を行います。
  6. 腹筋をxiphoidプロセスまでデググラビングして下層腹壁組織から皮膚を分離します(尾に最も近い皮膚を保持し、胸部に向かって頭に最も近い皮膚を引っ張ります)。外科用はさみを使用して、xiphoidプロセスの下3cm下の皮下腹壁組織に2cmの横切り切開を行う。この横切り切りから垂直に切り取り、正中線を上にして胸部を通して作ります。胸部を後ろに固定し、心臓を露出します。
  7. 27G針と10 mLの注射器を使用して、優れた静脈と大オルタに冷たいPBSを注入してください(心臓の任意の位置操作は、穿刺を避けるために鈍い鉗子で慎重に行う必要があります)心臓から血液をクリアします。
    注:十分な灌流は、尾のけいれんおよび肺の変色によって注意することができる。
  8. 27G針と10 mLの注射器を使用して、上の静脈と大オルタに冷たい4%PFAを注入し、固定プロセスを開始します。
  9. 心を物品物化する。心房、右心室、中隔、左心室は、まっすぐな刃のメスを使用して分離する必要があります。このティッシュを冷たい4%PFAで満たされた15 mL遠心分離管に入れ、一晩4°Cでヌテーターに置きます。
  10. 余分なPFAを除去するために冷たい1x PBSでそれぞれ1時間心臓を3回洗浄します。
  11. 15 mL遠心分離管に以下の化学物質を混合してヒドロゲル(A4P0と呼ぶ相対的アクリルアミド組成物のA4P0と呼ぶ)を調製します:40%アクリルアミドの10%、10%1x PBS、80%蒸留水。
  12. ヒドロゲルに心臓を浸す直前に、光導入剤(2,2-Azobis[2-2-イミダゾリン-2イル)プロパン)二塩酸塩)の0.25%溶液をヒドロゲル溶液に加えます。
  13. ハイドロゲルを含む円錐形のチューブに心臓を置きます。円錐形のチューブをホイルで包み、物理的な乱れなしに4°Cで一晩インキュベートします。
  14. 4°Cで約14時間後、心臓を含む円錐管を37°Cビーズ浴に移動します。
  15. ビーズバスで2.5時間後、鉗子で慎重にヒドロゲルから心臓を取り出します。
  16. 1x PBSを含む15 mLの円錐管に、37°Cのヌテターでそれぞれ1時間3回、心を洗浄します。
  17. 鉗子を使用してアクティブな電気泳動機のバスケットに心臓を置き、ふたをバスケットに置きます。蓋がしっかりと取り付けられるようにします。
  18. 溶液をチャンバに注ぎ込んで、活性電気泳動チャンバーの貯蔵所に電気泳動クリア液を充填します。
  19. チャンバーが電気泳動クリア液でいっぱいになると、心臓を含むバスケットを沈めることができます。電気泳動機にキャップをしっかりと置きます。
  20. 電気泳動機を1.5 A、37°Cで1.5時間実行します。
  21. 1.5時間の電気泳動の後、不透明な組織が残らないように心を視覚的にチェックしてください。組織の領域がまだ不透明である場合は、電気泳動室の電気泳動溶液中の心臓を再び沈下し、一度に0.5時間の電気泳動を継続する。
    注:電気泳動は、組織損傷(組織のほつれなど)の最初の兆候で中止する必要があります。
  22. 1x PBSを含む15 mLの円錐管で1時間、3回、37°Cでヌテタで洗浄します。
  23. ヘム自家蛍光を低減する脱色剤であるN,N,N',N'-テトラキス(2-ヒドロキシプロピル)エチレンジアミンを含む15mL円錐管に心臓を沈める。
    注:このソリューションは、心臓が完全にクリアされるまで24時間ごとに変更する必要があります(約2日)。
  24. 15 mLの円錐管で1x PBSを3回1時間洗浄し、過剰な脱色剤を除去します。
  25. 0.02 Mリン酸バッファーの30 mL、5-(N-2、3-ジヒドロキシプロフィラセタミド)-2の40 gを組み合わせることにより屈折率一致溶液(RIMS)を準備し、 4,6-トリイオド-N,N'-ビス(2,3ジヒドロキシプロピル)イソフタルアミド(完全に溶解しなければならない-これは1時間までかかる必要がある)、アジドナトリウム5mg、Tween20の50 μL、1,4-ジアザビシクロラ[2.2.2]オクタンの1g、およびpHに調整する。
  26. 撮像前に48時間、RIMSの心臓を平衡化します。

4.画像化は直立単一光子顕微鏡を使用して心臓をクリア

注:イメージング装置は、10 cmガラスペトリ皿の下半分、3Dプリントされた底部のリザーバ、丸いガラスカバースリップ、および3Dプリントされた上部の貯水池(図1C-E)で構成されています。3Dプリント材料は、シンシナティ小児病院臨床工学部によって社内で作られました。

  1. 真空グリースを使用して、3Dプリントされた底部のリザーバをガラスペトリ皿に密封し、3Dプリントされた部分の底部に真空グリースの薄い層を置きます(図1C)。
    注:リザーバは、画像化されるサンプルと同じ高さでなければなりません(つまり、サンプルは、その上に置かれたガラスカバースリップによって圧縮されるべきではなく、サンプルも浮遊して貯水池内で移動することはできません)。
  2. 貯留層にRIMSを充填し、パイプチップですべての気泡を取り除きます。左心室壁を上に向けてRIMSに心を入れ、溶液に泡が入らないようにします。
  3. 真空グリースを使用して、3Dプリントされたトップリザーバーピースの底面にガラスカバースリップを付着させます(再び真空グリースの薄い層を3Dプリントされた部分に置き、カバースリップに置きます)。
  4. ガラスカバースリップと上部のリザーバを下に置き、下部のリザーバー(補足図1B)に、気泡を導入せずに置きます。RIMS とカバースリップの間の接着は、上部と下部のリザーバピースの間にシールを提供します (図 1E)。
  5. 10xグリセロール浸漬目的で使用するためにグリセロールで上部の貯蔵所を充填します。
  6. クリアされた心臓を画像化するために、多光子共焦点スキャンヘッドを装備した単一の光子顕微鏡を使用してください。
  7. 単一光子顕微鏡の段を下げ、サンプルを含むペトリ皿をステージの中央に置きます。サンプル装置の上部貯留部のグリセロールに10xグリセロール浸漬目的を下げてステージを上げる。接眼レンズを使用してサンプルの端を見て、サンプルが焦点を合っていることを確認します。
  8. ライブボタンをクリックして、コンピュータ上の接眼レフからカメラビューに切り替えます。
    1. 最初にペトリ皿の底にあるはずの組織サンプルの最も広い部分を見つけることによって 、X および Yパラメータ を設定します。
    2. ND取得とカスタムマルチポイントをクリックします。ジョイスティックを使用して左から右、上から下にスイープすることで、最初に組織サンプルの中央を見つけることでマルチポイントを作成します。
    3. 次に、組織のサイズに基づいて、必要なタイリングサイズを決定します(通常、6-8週齢のマウス心臓の場合は6 x 5)。XおよびYパラメータ(ND取得タブの下のzをオフにして)をキャプチャして、組織の全長と幅がキャプチャされたかどうかを確認するだけで、テストイメージングを実行します。
  9. zパラメータを設定するには、XYZ ナビゲーションを開き、上向きと下向きのアイコンをクリックして、サンプルの上部と下部を見つけるまでクリックします。
    1. Z強度補正パネルを開き、各Zポイントでレーザーパワーを増減させることで組織密度を補正するために、組織の上部、中央、底部の蛍光を調整します。Z強度補正パネルの右側にある設定矢印をクリックして設定します。
    2. ND取得パネルのZステップサイズを5μmに設定します。
  10. 心臓のX、Y、Zパラメータを線引きし、Z強度補正が設定された後、共振スキャナとガリウムヒ素ホスホニド感光増倍管(GaAsP PMT)を用いた10xグリセロール浸漬目的を有する自動直立顕微鏡を使用して、クリアされた心臓を画像化する。ND取得でXYおよびZ タブがチェックされていることを確認し、Z 補正を実行を押します。
  11. 処理ソフトウェアで マルチポイント画像 を開き、 ステッチ ボタンをクリックして、得られた画像をステッチ、アンミックス、ノイズ除去します。[ イメージ] で、[ ブラインド アンミックス]、[ 2 チャンネル] をクリックし、 を 見つけます。をクリックし、[ イメージ] で [denoise.ai]をクリックし、選択した蛍光チャネル (GFPなど) をクリックします。
    注:このプロセスは、左心室全体でGFP陽性線維芽細胞の3D画像になります。
  12. 二次解析ソフトウェアを使用して、心臓線維芽細胞の分散のパターンと傾向をさらに特定します。 スポット ウィザード プログラムを実行して 、スポット 関数を使用します。

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結果

心臓線維芽細胞は、心臓のベースライン機能および心臓損傷への応答に不可欠です。これらの細胞の配置と形態を理解するための以前の試みは、主に2D設定で行われてきました。しかし、洗練された心臓組織クリアリング(図2)および3Dイメージング技術が発表されており、心臓線維芽細胞の高度で詳細な視覚化が可能です。このイメージング技術により、線維芽細胞は密...

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ディスカッション

この記事では、ベースラインと次の傷害の両方で生体内の心臓線維芽細胞を視覚化し、マウス心臓の線維芽細胞を特徴付け、よりよく理解することを可能にする組織クリアリングのための洗練された方法を提示する。この強化されたプロトコルは、成人または新生児心臓12、13、14、16、17、20の特定の細胞タイプを同定しよ?...

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開示事項

著者らは、この原稿の内容に関連する開示を持っていません。

謝辞

著者らは、CCHMC共焦点イメージングコアが、このモデルの開発における支援と指導を認め、臨床工学のマット・ベイティがすべての3Dプリント部品の設計を行うことを認めたいと考えています。デメトリア・フィシェッサーは国立衛生研究所(NHLBI、T32 HL125204)からの訓練助成金によって支えられ、ジェフリー・D・モルケンティンはハワード・ヒューズ医学研究所の支援を受けました。

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資料

NameCompanyCatalog NumberComments
4-0 braided silkEthiconK871H
8-0 proleneEthicon8730H
40% Acrylamide SolutionBio-Rad1610140
Angiotensin IISigmaA9525-50G
Artificial Tear OintmentCovetrus048272
DABCO (1,4-diazabicyclo[2.2. 2]octane)Millipore SigmaD27802-25G
GLUture topical tissue adhesiveWorld Precision Instruments503763
HeparinSigmaH0777
Imaris Start Analysis SoftwareOxford InstrumentsN/A
Micro-osmotic pumpsAlzetModel 1002
Nikon Elements Analysis SoftwareNikonN/A
Nikon A1R HD upright microscopeNikonN/A
Normal autoclaved chowLabdiet5010
Nycodenz, 5- (N-2, 3-dihydroxypropylacetamido)-2, 4, 6-tri-iodo-N,
N'-bis (2, 3 dihydroxypropyl) isophthalamide		CosmoBioAXS-1002424
ParaformaldehydeElectron Microscopy Sciences15710
Phenylephrine HydrochlorideSigmaP6126-10G
PhotoinitiatorWako ChemicalsVA-044
Rosa26-nLacZ [FVB.Cg-Gt(ROSA)26Sortm1 (CAG-lacZ,-EGFP)Glh/J]Jackson LaboratoriesJax Stock No:012429
Sodium AzideSigma AldrichS2002-5G
Sodium Chloride solutionHospira, Inc.NDC 0409-4888-10
TamoxifenSigma AldrichT5648
Tamoxifen foodEnvigoTD.130860
Tween-20Thermo Fisher ScientificBP337-500
Quadrol, N,N,N′,N′-Tetrakis(2-Hydroxypropyl)ethylenediamine, decolorizing agentMillipore Sigma122262-1L
X-Clarity electrophoretic clearing chamberLogos BiosystemsC30001
X-Clarity electrophoretic clearing solutionLogos BiosystemsC13001
X-Clarity electrophoresis tissue basketLogos BiosystemsC12001
X-Clarity electrophoresis tissue basket holderLogos BiosystemsC12002

参考文献

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