マウスの洞房結節と房室結節のホールマウント免疫蛍光染色、共焦点イメージング、3D再構成

要約

マウス心臓の洞房結節(SAN)と房室結節(AVN)のホールマウント免疫蛍光染色のための段階的なプロトコルを提供します。

要約

洞房結節(SAN)のペースメーカー細胞によって生理学的に生成された電気信号は、房室結節(AVN)を含む伝導系を介して伝導され、心臓全体の興奮と収縮を可能にします。SANまたはAVNのいずれかの機能不全は不整脈を引き起こし、電気生理学および不整脈形成におけるそれらの基本的な役割を示しています。マウスモデルは不整脈の研究に広く使用されていますが、SANとAVNの具体的な調査は依然として困難です。

SANはクリスタターミナルと上大静脈の接合部に位置し、AVNは冠状静脈洞の開口部、三尖弁輪、およびトダロの腱によって形成されるコッホの三角形の頂点に位置する。しかし、サイズが小さいため、従来の組織学による可視化は依然として困難であり、3D環境内でのSANおよびAVNの研究はできません。

ここでは、標識マウスSANおよびAVNの局所可視化を可能にするホールマウント免疫蛍光法について説明します。 ホールマウント免疫蛍光染色は、手動切片を必要とせずに、組織のより小さな切片を対象としています。この目的のために、マウスの心臓を解剖し、不要な組織を取り除き、続いて固定、透過処理および遮断する。次に、SANおよびAVN内の伝導系の細胞を抗HCN4抗体で染色します。共焦点レーザー走査型顕微鏡と画像処理により、リンパ節細胞と作動心筋細胞を区別し、SANとAVNを明確に局在化することができます。さらに、追加の抗体を組み合わせて、神経線維などの他の細胞型も標識することができます。

従来の免疫組織学と比較して、ホールマウント免疫蛍光染色は心臓伝導系の解剖学的完全性を維持し、AVNの調査を可能にします。特に、それらの解剖学的構造および周囲の作業心筋および非筋細胞との相互作用にそうである。

概要

不整脈は何百万人もの人々に影響を与える一般的な病気であり、世界中で重大な罹患率と死亡率の原因となっています。心臓ペースメーカーの開発など、治療と予防の大幅な進歩にもかかわらず、主に基礎疾患メカニズムに関する知識が非常に限られているため、不整脈の治療は依然として困難です^1,2,3。不整脈の正常な電気生理学と病態生理学の両方をよりよく理解することは、将来の新規で革新的で因果関係のある治療戦略の開発に役立つ可能性があります。また、不整脈形成を包括的に研究するためには、マウスが電気生理学研究で広く用いられているため、マウスなどの動物モデルにおいて特異的な心臓伝導系を局在化・可視化することが重要です。

心臓伝導系の主要部分は、特殊なペースメーカー細胞で電気インパルスが発生する洞房結節(SAN)と、心房と心室の間の唯一の電気的接続である房室結節(AVN)です⁴。SANとAVNの電気生理学的特性が変化するたびに、洞不全症候群や房室ブロックなどの不整脈が発生し、血行力学的悪化、失神、さらには死に至る可能性があり、電気生理学と不整脈形成におけるSANとAVNの両方の本質的な役割を強調しています⁵。

SANまたはAVNに関する包括的な研究では、理想的には生理学的環境内で、両方の構造の正確な位置特定と視覚化が必要です。しかし、作業心筋内のサイズと位置が小さいため、肉眼的にはっきりと見える構造を確立することなく、SANとAVNの解剖学と電気生理学を研究することは困難です。解剖学的ランドマークを使用して、SAN および AVN⁶、^7、8 を含むリージョンを大まかに識別できます。簡単に言えば、SANは筋クリスタターミナル(CT)に隣接する右心房の騎骨間領域に位置し、AVNは三尖弁、冠状静脈洞の口、およびトダロの腱によって確立されたコッホの三角形内に位置する。これまで、これらの解剖学的ランドマークは、主にSANとAVNを個々の構造として(従来の組織学などによって)局在化、除去、および研究するために使用されていました。しかし、SANとAVNの複雑な電気生理学(例えば、作動心筋の隣接細胞の調節効果)をよりよく理解するためには、生理学的3D環境内の伝導系を研究する必要があります。

ホールマウント免疫蛍光染色は、周囲の組織の完全性を維持しながら、 その場で 解剖学的構造を研究するために使用される方法です⁹。共焦点顕微鏡と画像解析ソフトウェアを利用して、SANおよびAVNは、これらの領域に特異的に発現するイオンチャネルを標的とする蛍光標識抗体で視覚化できます。

このプロトコルでは、SANおよびAVN顕微鏡の局在化と可視化のために確立されたホールマウント染色法を実行するために必要な手順について説明します。具体的には、このプロトコルは、(1)解剖学的ランドマークによってSANおよびAVNを局在化して、染色および顕微鏡分析のためにこれらのサンプルを準備する方法(2)参照マーカーHCN4およびCx43のホールマウント免疫蛍光染色を実行する方法(3)共焦点顕微鏡用のSANおよびAVNサンプルを調製する方法(4)SANおよびAVNの共焦点イメージングを実行する方法を説明する。また、このプロトコルを変更して、周囲の働く心筋または自律神経線維などの非筋細胞の追加染色を含めて、心臓内の心臓伝導系の徹底的な調査を可能にする方法についても説明します。

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プロトコル

動物の世話とすべての実験手順は、ミュンヘン大学の動物管理および倫理委員会のガイドラインに従って実施され、マウスで行われたすべての手順は、ドイツのミュンヘンのバイエルン州政府によって承認されました(ROB-55.2-2532.Vet_02-16-106、ROB-55.2-2532.Vet_02-19-86)。C57BL6/Jマウスはジャクソン研究所から購入した。

注: 図1 は、実験に必要な機器を示しています。 図2 は、肉眼的心臓解剖学的構造の図を示す。 図3 は、成体マウスの心臓におけるSANとAVNの位置を示しています。 図4 は、共焦点顕微鏡にロードされた準備されたサンプルを示しています。

1. 事前準備

1. 10 mLの16%ホルムアルデヒド溶液を30 mLのPBSで希釈することにより、4%ホルムアルデヒド溶液(4%PFA)を調製します。
2. 15gおよび30gのショ糖粉末をそれぞれ100mLのPBSに溶解することにより、15%スクロース溶液および30%スクロース溶液を調製する。ショ糖粉末が完全に溶解した後、4°Cで保存する前に0.2μmシリンジフィルターを使用して溶液をろ過します。
3. 3%〜4%のアガロースゲルを準備し、3 gまたは4 gのアガロース粉末と100 mLの1x TAE(50x TAEストック溶液から希釈)をビーカーに加えます。ビーカーをマグネチックスターラーに置き、アガロースが完全に溶解するまで煮ます。
4. 直径100 mmのペトリ皿に30 mLのアガロースゲル(3%-4%)を静かに注いで解剖皿を準備します。ペトリ皿を室温でベンチに置いて冷まして固めます。
5. 表1に示すレシピに従ってブロッキング液及び洗浄液を調製する。使用日に調製したすべての溶液を調製する。長期保管はお勧めしません。
6. 抗体溶液を冷(4°C)1x PBSで希釈して調製し、希釈液を光から保護し(アルミホイルを巻き付けるなど)、希釈液を使用するまで氷上に保ちます。インキュベーションの直前に抗体を希釈する。希釈した抗体を室温で放置することは避けてください。
   注:適切な抗体希釈は、従来の免疫蛍光染色を実行して、同等の組織サンプルでテストする必要があります。ここでは、厚さ10 μmで切断した凍結切片を染色して抗体を試験した。

2.臓器摘出と組織の準備

1. マウスをイソフルラン気化器に接続されたインキュベーションチャンバーに入れて麻酔します。気化器を4〜5%のイソフルラン(それぞれ96〜95%の酸素)を供給するように設定します。
   注:完全な麻酔は、マウスが背中に置かれるまでチャンバーを静かに転がすことによる姿勢反応の喪失と反射の修正によって確認されます。
2. マウスを手術台の上で仰臥位にします。マウスの鼻を、イソフルラン気化器に接続されたインナーチューブを備えた修正ベイン回路に接続された麻酔マスクに入れます。麻酔を維持するには、酸素中に1〜2%のイソフルランを1 L / minの流量で使用します。.マスクの外管を介してマウスから余分な麻酔蒸気を取り除き、余分な麻酔ガスを吸収する活性炭のキャニスターを通して吸い込みます。
3. 完全麻酔が達成されたら、鎮痛のためにフェンタニルを注射します(0.1 μg / 25 g体重i.p.)。
4. つま先のつまみ反射が検出されない場合は、虹彩はさみを使用してジュグルムから結合まで明確に切り込み、毛皮と皮膚を取り除きます。虹彩ハサミを使用して肋骨の下を左から右に切り、腹部を慎重に開きます。
5. 湾曲した鉗子を使用して剣状骨を少し生き、臓器を傷つけることなく横隔膜を左から右に切断できるようにします。虹彩ハサミを使用して両側の内側腋窩線で胸郭を切り、頭蓋骨をひっくり返し、心臓にアクセスできるようにします。
6. 虹彩ハサミを使用して横隔膜のレベルで下大静脈と下行胸部大動脈を切断します。頂点の領域に27 Gの針で心臓を穿刺し、針を左心室(LV)に慎重に押し込みます。5〜10 mLの氷冷PBSをLVに静かに注入して、心臓に灌流します。
   注意: 心臓の色が赤から灰色に変わり、PBSとの灌流が成功したことを示します。
7. ピンセットを使用して心臓の頂点を慎重に持ち上げ、大きな血管を切断して心臓を取り外すことができます。
8. 上大静脈(SVC)への損傷を避けるために、心臓からできるだけ離れた大きな動脈と静脈を切断して心臓を切除します。SVCは後の処理時に重要なランドマークとして機能するため、保存してください。
9. 心臓除去後、イソフルラン気化器をオフにします。
10. 解剖顕微鏡下で氷冷PBSで満たされた解剖皿に心臓を入れます。心臓の左右と前後を決定したら、心臓の前を皿の底にして心臓を回します(後方にある大きな血管を露出させるため)。
11. 解剖皿の下部にあるアガロースに、頂点と左心房付属器(LAA)に小さなピンを入れて、心臓を固定します(図2A)。細いピンセットとはさみを使用して、SVCと下大静脈(IVC)の周囲の非心臓組織(肺、脂肪、心膜など)を注意深く取り除き、空洞間領域を露出させます(図3A)。
12. マイクロハサミで心室と心房の間の溝を平行に切断することにより、心室の大部分を取り除きます。プレキシグラスリングへの後の負荷のために心室組織のごく一部を保存します。
13. 固定および脱水のために、サンプル(心房、SVC、IVCを含む)を4%PFAに4°Cで一晩入れます。
14. 翌日、心臓を15%スクロース溶液に移し、4°Cで24時間反応させる。
15. 翌日、心臓を30%ショ糖溶液に移し、4°Cで24時間反応させた。
    注:ステップ2.13、2.14、および2.15の固定と脱水では、サンプルをさらに攪拌または揺さぶることなく4°Cに放置します。

3. ホールマウント免疫蛍光染色

1. PBSで希釈した1%Triton X-100で心臓を洗浄し、ブロッキング溶液(表1)で4°Cで一晩ブロックして透過処理します。
2. 心臓を1.5 mLチューブに入れ、ブロッキング溶液で希釈したウサギ抗マウスコネキシン-43(希釈率1:200)およびラット抗マウスHCN4(希釈率1:200)抗体とともに4°Cで7日間インキュベートします。
   注:データシートをオリエンテーションとして使用する前に、一次抗体の最適濃度をテストする必要があります。一次抗原の宿主種が他の抗原と異なる限り、このステップで目的の他の抗原も染色することができます。Triton X-100の濃度が高いほど、¹⁰の前に実証されたように、より効率的な抗体染色を得るのに役立つ可能性がありますが、濃度は個別に決定される場合があります。
3. 7日後、ピペットを使用して一次抗体を含む溶液を取り除き、1%Triton X-100溶液で心臓を3回洗浄します(オービタルシェーカーで室温で1時間ずつ)。
4. 洗浄後、心臓=Alexa Fluor 488ヤギ抗ラットIgG(希釈1:200)およびAlexa Fluor 647ヤギ抗ウサギIgG(希釈1:200)で4°Cで7日間インキュベートします。
5. 7日後、ピペットを使用して二次抗体を含むすべての溶液を除去します。次いで、洗浄液(表1)を用いて心臓を3回洗浄する(オービタルシェーカー上で室温で1時間ずつ)。
6. 核を染色するには、心臓をDAPI溶液(10 μg/mL)で4°Cで一晩インキュベートします。
7. 翌日、洗浄液で心臓を3回洗浄します(オービタルシェーカーで室温で1時間ずつ)。
   注:ステップ3.1、3.2、3.4、および3.6でのブロッキング、透過処理、抗体インキュベーション、およびDAPI染色では、サンプルを4°Cの定常状態のままにし、攪拌は必要ありません。染色された組織は、4°Cの洗浄液で完全に覆われ、共焦点顕微鏡でイメージングされるまで数日間光から保護することができました。

4. 共焦点顕微鏡

1. プレキシグラスリングを準備し、プラスチシンで満たします(図1)。プラスチシンの中央には、心臓に負荷をかけるための小さな溝が中央に形成されています。平らなイメージング面を取得しやすく、ステップ4.4でサンプルとカバーガラスの間のスペースを調整して気泡を避けるために、浅い溝を作ります。
2. SANとAVNの両方のイメージングに同じ心臓サンプルを順番に使用します。SANイメージングの場合は心臓に直接負荷をかけますが、AVNイメージングの場合は前にマイクロダイセクションを実行します。
   1. SANイメージング
      1. 解剖学的ランドマークによってSANを識別します:それは雌洞間領域(上大静脈と下大静脈の間の領域)内の心臓の背側に位置しています。クリスタ終末(CT)は、SANとRAAの間の筋です。
      2. 心臓の後ろを上に向けて、心臓を粘土の溝に入れます。心臓にPBSを追加して、心臓がPBSで完全に覆われるまで、空洞内のすべての空気を置換します(通常、数滴のPBSで十分です)。
      3. 解剖顕微鏡下で、RAA、LAA、および左心室の残りの部分を粘土にそっと押し込み、心臓を固定します。騎兵隊間領域全体とクリスタターミナルがはっきりと見えることを確認してください(粘土で覆われていない)。撮像される領域を 図3Aに示します。
   2. AVNイメージング
      1. SANのイメージングが終了したら、同じサンプルを再回収し、その後AVNイメージングに使用します。AVNマイクロダイセクションの場合は、心臓=を解剖顕微鏡下の解剖皿に置きます。
      2. 右側を上に向けて心臓を向けます(右心室の残りの部分を含む)。LV自由壁の残りの部分(現在は下部にあります)にピンを通して、組織を固定します(図2B)。
      3. 残りのRVフリーウォールを三尖弁と上大静脈を通して上向きに切り取ります。次に、RVとRAを裏返して、心室中隔と心房中隔を露出させます。(図3B)
         注:冠状静脈洞(CS)は、AVNを局在化できるコッホの三角形を見つけることが重要な解剖学的ランドマークであるため、損傷しないように注意してください。CSは心臓の後側の左房室溝を横方向に走り、CS開口部は心房中隔の下部分のIVCと三尖弁の間にあります(図3A およびB)。
      4. 右心房の心内膜表面に見られ、三尖弁(TV)の中隔リーフレットのヒンジラインで前方に縁取られ、後方にトダロの腱で囲まれているコッホの三角形を特定します。基部は冠状静脈洞の開口部によって形成される(図3B)。これはAVNイメージングのターゲット領域であるため、はっきりと見える必要があります。
      5. コッホの三角形がはっきりと露出している(つまり、粘土で覆われていない)状態で、プレキシグラスリング内の粘土の溝に心臓を移します。コッホ三角形の周りの組織を粘土にそっと押し込み、サンプルを固定します。心臓にPBSを追加して、心臓がPBSで完全に覆われるまで、空洞内のすべての空気を置換します(通常、数滴のPBSで十分です)。
3. プレキシグラスリングの端にシリコンを塗布して、粘土で満たされたプレキシグラスリング内にロードされたハートをカバースリップで覆うことができるようにします。
4. プラスチシンの裏側をそっと押してPBSの一部を絞り出し、イメージング領域内の気泡を避けながら心臓をカバーガラスに取り付けます。
   注意: 粘土の裏側を押すときに、関心のある領域が折りたたまれて覆われていないことを確認してください。サンプルの過圧縮のない平坦なイメージング面は、解剖学的構造を保存し、サンプルの適切な共焦点イメージングに必要です。SANの場合、騎兵隊間領域が明確に露出していることを確認することが重要です。AVNの場合、コッホの三角形は完全に露出している必要があります。
5. ホールマウント染色サンプルを逆さまにして共焦点顕微鏡のプラットフォームに置きます。カバースリップに取り付けられた露出したSAN/AVNは、顕微鏡プラットフォームの底面にあります(図4)。
   注意: 画像を撮影するには、Airyscanユニットを搭載したカールツァイスLSM800とソフトウェアZEN 2.3 SP1ブラックを使用します。
6. プレート「BP420-480 + LP605」を選択して、Alexa Fluor 647結合抗HCN4の励起を行います。マスターゲインを650〜750の範囲で変化させます。
7. タイルスキャン機能を使用して、SANおよびAVNリージョン全体のオーバービューイメージを取得します。次に、HCN4陽性領域をクリックして、スキャンする対象領域の周囲を概観画像に正方形を追加して選択します。
8. 共焦点顕微鏡の残りのチャンネル(Alexa Fluor 488とDAPI)のプレートやマスターゲインなどのパラメーターを確認し、手順4.6の説明に従って設定します。
9. サンプルの上から下にフォーカスをゆっくりと調整して、サンプル全体をプレビューし、Zスタック範囲の 最初 と 最後 を設定します。光学サンプルの厚さに基づいてZスタックの最適な間隔を設定します。20倍の対物レンズを使用し、Zスタックの間隔として0.8〜1μmを使用します。
10. すべてのパラメータが適切に設定されたら、SANとAVNの領域全体をスキャンします。
11. ソフトウェア(Imarisバージョン8.4.2など)を使用して画像の3D再構築を実行します。
    1. 画像処理の選択 |バックグラウンドの汚れを除去するためのベースライン減算。
    2. 選択したチャネルと処理対象領域の設定でサーフェスの作成を選択します。

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結果

上記で概説したプロトコルを使用することにより、SANとAVNの両方の共焦点顕微鏡イメージングを確実に実行できます。HCN4を標的とする蛍光抗体を用いた伝導系の特異的染色、およびCx43を標的とする蛍光抗体を用いた作動心筋の染色により、無傷の解剖学的構造内のSAN(図5、ビデオ1)およびAVN(図6、ビデオ2)を明?...

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ディスカッション

心臓の解剖学は伝統的に薄い組織学的切片を使用して研究されてきました¹¹。ただし、これらの方法は伝導システムの3次元構造を保持しないため、2D情報のみを提供します。ここで説明するホールマウント免疫蛍光染色プロトコルは、これらの制限を克服することを可能にし、SANおよびAVNイメージングに日常的に使用することができます。

パラフィン包...

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資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anesthesia
Isoflurane vaporizer system	Hugo Sachs Elektronik	34-0458, 34-1030, 73-4911, 34-0415, 73-4910	Includes an induction chamber, a gas evacuation unit and charcoal filters
Modified Bain circuit	Hugo Sachs Elektronik	73-4860	Includes an anesthesia mask for mice
Surgical Platform	Kent Scientific	SURGI-M
In vivo instrumentation
Fine forceps	Fine Science Tools	11295-51
Iris scissors	Fine Science Tools	14084-08
Spring scissors	Fine Science Tools	91500-09
Tissue forceps	Fine Science Tools	11051-10
Tissue pins	Fine Science Tools	26007-01	Could use 27G needles as a substitute
General lab instruments
Orbital shaker	Sunlab	D-8040
Magnetic stirrer	IKA	RH basic
Pipette,volume 10 µL, 100 µL, 1000 µL	Eppendorf	Z683884-1EA
Microscopes
Dissection stereo- zoom microscope	VWR	10836-004
Laser Scanning Confocal microscope	Zeiss	LSM 800
Software
Imaris 8.4.2	Oxford instruments
ZEN 2.3 SP1 black	Zeiss
General Lab Material
0.2 µm syringe filter	Sartorius	17597
100 mm petri dish	Falcon	351029
27G needle	BD Microlance 3	300635
50 ml Polypropylene conical Tube	Falcon	352070
5ml Syringe	Braun	4606108V
Cover slips	Thermo Scientific	7632160
Eppendorf Tubes	Eppendorf	30121872
Chemicals
0.5 M EDTA	Sigma	20-158	Components of TEA
16% Formaldehyde Solution	Thermo Scientific	28908	use as a 4% solution
Acetic acid	Merck	100063	Components of TEA
Agarose	Biozym	850070
Bovine Serum Albumin	Sigma	A2153-100G
DPBS (1X) Dulbecco's Phosphate Buffered Saline	Gibco	14190-094
Normal goat serum	Sigma	NS02L
Sucrose	Sigma	S1888-1kg
Tris-base	Roche	TRIS-RO	Components of TEA
Triton X-100	Sigma	T8787-250ml	Diluted to 1% in PBS
Tween 20	Sigma	P2287-500ml
Drugs
Fentanyl 0.5 mg/10 mL	Braun Melsungen
Isoflurane 1 mL/mL	Cp-pharma	31303
Oxygen 5 L	Linde	2020175	Includes a pressure regulator
Antibodies
Goat anti-Rabbit IgG Alexa Fluor 488	Cell Signaling Technology	#4412	diluted to 1:200
Goat anti-Rat IgG Alexa Fluor 647	Invitrogen	#A-21247	diluted to 1:200
Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate (DAPI)	Invitrogen	H3570	diluted to 1:1000
Rabbit Anti-Connexin-43	Sigma	C6219	diluted to 1:200
Rat anti-HCN4 (SHG 1E5)	Invitrogen	MA3-903	diluted to 1:200
Other
Plexiglass ring			Self-designed and 3D printed
Plasticine	Cernit	49655005
Silikonpasten, Baysilone	VWR	291-1220
Animals
Mouse, C57BL/6	The Jackson Laboratory