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要約

ここでは、in toto光投影断層撮影法、多光子顕微鏡を用いたライブイメージングおよびホールマウント免疫蛍光染色によって得られた、軸方向の伸長およびセグメンテーションの文脈におけるマウス胚の3次元および4次元画像データの視覚化および解析を可能にする計算ツールおよび方法について説明する。

要約

ソミトジェネシスは脊椎動物の胚発生の特徴である。長年にわたり、研究者は、エクスビボおよびインビトロアプローチを包含する幅広い技術を使用して、さまざまな生物におけるこのプロセスを研究してきました。しかし、ほとんどの研究は依然として2次元(2D)イメージングデータの解析に依存しているため、複雑な3D空間での非常に動的な相互作用を伴う軸の延長やソミトジェネシスなどの発生プロセスの適切な評価が制限されています。ここでは、マウスのライブイメージング取得、データセット処理、視覚化、および3Dおよび4Dでの解析を可能にし、これらの発生プロセスに関与する細胞(例えば、神経中胚葉前駆細胞)を研究することを可能にする技術について説明する。また、マウス胚における光投影断層撮影法およびホールマウント免疫蛍光顕微鏡(サンプル調製から画像取得まで)のためのステップバイステップのプロトコルを提供し、3D画像データを処理および視覚化するために開発したパイプラインを示します。これらの技術のいくつかの使用を拡張し、軸方向の拡張とソマイト形成(3D再構成など)の現在の理解を向上させるために使用できる、利用可能なさまざまなソフトウェア(フィジー/ ImageJ、Drishti、Amira、Imarisなど)の特定の機能を強調します。全体として、ここで説明する技術は、発生生物学における3Dデータの視覚化と分析の重要性を強調しており、他の研究者が脊椎動物の軸延長とセグメンテーションの文脈で3Dおよび4D画像データにうまく対処するのに役立ちます。最後に、この研究は脊椎動物の胚発生を教えることを容易にするための新しいツールも採用しています。

概要

脊椎動物の体軸形成は、胚発生中に起こる非常に複雑で動的なプロセスです。胃形成の終わりに[マウスでは、胚発生日(E)8.0頃]に、神経中胚葉前駆細胞(NMP)として知られるエピブラスト前駆細胞のグループが、頭から尾への配列における軸延長の重要な駆動因子となり、頸部、体幹および尾部形成中に神経管および近軸中胚葉系組織を生成する1、2、3、4.興味深いことに、これらのNMPが尾側エピブラストで占める位置は、中胚葉または神経外胚葉に分化する決定において重要な役割を果たしているようです5。現在、NMPの正確な分子指紋は得られていませんが、これらの細胞は一般にT(Brachyury)とSox2 5,6を共発現すると考えられています。NMPの運命決定を調節する正確なメカニズム(すなわち、それらが神経経路をとるか中胚葉経路をとるか)は、正確に定義され始めたばかりである。原始的な筋状領域におけるTbx6発現は、NMP運命決定の初期マーカーであり、この遺伝子は中胚葉6、7の誘導および仕様に関与している。興味深いことに、初期の中胚葉細胞は高レベルのEpha18を発現しているようであり、Wnt/β-カテニンシグナル伝達、ならびにMsgn1もまた、近軸中胚葉分化およびソマイト形成において重要な役割を果たすことが示された9,10。単一細胞レベルでのNMPの完全な空間時間解析は、中胚葉の仕様を制御する分子メカニズムを完全に理解するために確かに役立つでしょう。

ソマイト(椎骨前駆体)の形成は脊椎動物の重要な特徴である。軸方向の伸長の間、近軸中胚葉はソマイトとして知られる一連の両側反復単位でセグメント化される。ソマイトの数と新しいセグメントの形成に必要な時間は、種11、12によって異なります。ソミトジェネシスは、前嚢内胚葉(例えば、Lfng)におけるNotch、WntおよびFgfシグナル伝達経路のいくつかの遺伝子の周期的発現によって観察され得る周期的シグナル伝達振動(「セグメンテーションクロック」として知られている)11、12を含む。ソミトジェネシスの現在のモデルはまた、各新しいソマイトの後縁の位置を定義するFgf、Wntおよびレチノイン酸シグナル伝達を含む一連の複雑なシグナル伝達勾配である「成熟波面」の存在を仮定する。したがって、「セグメンテーションクロック」と「成熟波面」との間の協調的な相互作用は、これらの重要な形態形成過程における摂動が胚致死性または先天性奇形(例えば、脊柱側弯症)の形成をもたらす可能性があるため、これらの椎骨前駆体モジュールの生成にとって基本的である13,14,15。

画像化技術、バイオイメージ解析方法およびソフトウェアにおける最近の大幅な進歩にもかかわらず、軸方向の伸長およびソミトジェネシスのほとんどの研究は、依然として単一/単離された2次元画像データ(例えば、切片)に依存しており、完全な多次元組織可視化を可能とせず、病理学的奇形(すなわち、突然変異による)と胚発生中に起こる正常な形態学的変化との間の明確な区別を複雑にする16。.3Dでのイメージングは、以前は標準的な2D法では同定されていなかった新しい形態形成運動をすでに明らかにしており17,18,19,20、脊椎動物のソミトジェネシスおよび軸方向拡張のメカニズムを理解するためのin totoイメージングの力を強調している。

マウス胚の3Dおよび4D顕微鏡、特にライブイメージングは技術的に困難であり、正確で意味のある時空間分析を可能にするために、サンプル調製、画像取得、およびデータ前処理中に重要なステップが必要です。ここでは、マウス胚のライブイメージングおよびホールマウント免疫蛍光染色のための詳細なプロトコールについて述べ、軸延長およびセグメンテーション中にNMPおよび中胚葉系細胞の両方を研究するために使用することができる。さらに、我々はまた、トトにおける3D可視化および染色体形成中の問題(例えば、骨癒合および脊柱側弯症)に起因する病理学的異常の定量化を可能にする、高齢胚および胎児の光投影断層撮影(OPT)のためのプロトコルについても記述する13,21,22。最後に、脊椎動物のセグメンテーションと軸方向の伸びの研究と教育における3Dイメージング再構成の力を示します。

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プロトコル

動物を対象とした実験は、住宅、畜産、福祉に関するポルトガル(Portaria 1005/92)および欧州(指令2010/63/EU)の法律に従っていました。このプロジェクトは、「Instituto Gulbenkian de Ciência」の倫理委員会とポルトガルの国家機関「Direcção Geral de Alimentação e Veterinária」(ライセンス参照:014308)によってレビューされ、承認されました。

1. 3Dおよび4Dイメージング用のサンプル調製

注:ここでは、ライブイメージング用のマウスE8.25~E10.5胚(1.1)、全マウント免疫蛍光顕微鏡用のE7.5~E11.5胚(1.2)、および光投影断層撮影用の胎児(1.3)の解剖および調製方法について詳しく説明します。

  1. ライブイメージングのためのサンプル調製
    1. マウス胚解剖およびライブイメージングのための調製(例えば、LuVeLu レポーター23)。
      1. E8.25とE10.5の間のマウス胚を予め加温したM2培地(37°C)で解剖する。清潔な鉗子を使用して卵黄嚢を静かに取り除き、新鮮なM2培地で胚を1回洗い流して、解剖中に生じた血液や破片を取り除きます。
        注:胚を何らかの方法で損傷させないようにすることが重要です、さもなければそれはライブイメージング手順の間に適切に発達しません。
      2. ライブイメージング手順の間、胚を加熱チャンバー(37°C)で、65%O2および5%CO2環境(N2バランス)中で、10%HyClone規定のウシ胎児血清、2mM L-グルタミンおよび1%ペニシリン-ストレプトマイシンを添加した低グルコースDMEM培地中でインキュベートする。
        注:これらの培養条件により、胚発生は約10時間起こる。他のプロトコール9、10は、異なる培養条件を使用して、さらに長い期間を可能にするかもしれない。
  2. 免疫蛍光顕微鏡用サンプル調製
    1. マウス胚の解剖と固定手順
      1. E7.5からE11.5までのマウス胚を、低温(4°C)リン酸緩衝生理食塩水(PBS)またはM2培地のいずれかで解剖する。すべての胚外膜(例えば、ライチャートの膜または卵黄嚢)を除去した後、胚を新鮮なPBSで洗浄し、解剖手順中に生成された血液および破片を除去する。
      2. 胚を4°Cで、PBS中の4%パラホルムアルデヒド(PFA)中で、 表1に規定する時間だけ固定した。
        注意 - PFA はヒュームフード内で取り扱う必要があります。
        発達段階推奨固定時間(PFA 4%)
        E7.5 ·1時間30分
        E8.5 ·2時間
        E9.5 ·3時間
        E10.5 ·4時間
        E11.5 ·4時間
        表1 - 異なる発生段階における胚の固定時間
      3. 固定後、PFAを完全に除去するために、PBS中で少なくとも2回(それぞれ5〜10分)胚を洗浄する。この時点で、胚を免疫蛍光染色プロトコルに直接取り込むことも(ステップ1.2.2)、脱水して将来の使用のために保存することもできます(ステップ1.2.1.4)。
      4. 必要に応じて、胚を-20°Cの100%メタノール中で長期間保存する。
        1. 組織保存を改善するために、メタノール濃度を10%増加させる(PBSで希釈)と共に胚を徐々に脱水し、シェーカー上で室温(RT)で10分間、メタノール100%に達するまで各工程を行う。新鮮なアリコートを使用して100%メタノールを一度交換してください。
        2. 逆メタノール/PBSシリーズに続いて再水和し、各ステップをシェーカー上のRTで10分間、PBSで最終洗浄(2回、それぞれ5〜10分)して免疫染色プロトコルに入ることによって凍結胚を回収する。
          注意 - メタノールはヒュームフード内で取り扱う必要があります。
    2. ホールマウント免疫蛍光染色
      注:以下の免疫蛍光染色プロトコールは、Osorno et al.24に記載の手順から適合させた。すべての洗浄はシェーカーで行う必要があります。ブロッキングステップの後、抗体の完全性/保存を確実にするために、4°Cでインキュベーションが行われます。
      1. 透過処理を改善するために、0.1%Triton X-100(0.1% PBST)を含むPBS中で胚を3回(各30分)、次いで0.5%PBST中に1回1時間洗浄する(RT)。
      2. 非特異的結合を減少させるために、PBS(pH 7.5)中の1 Mグリシン中でRTで30分間洗浄する。
      3. 0.1% PBSTで30分間3回洗浄し、グリシンを完全に除去した。
      4. 3%の血清(二次抗体が産生された動物種由来)、1%のウシ血清アルブミン(BSA)および0.1%のTriton X-100を含むブロッキング溶液中で、胚を4°Cで一晩インキュベートする。
      5. 一次抗体をブロッキング溶液(T抗体およびSox2抗体の場合は通常1:200)で希釈し、4°Cで2〜3日間インキュベートする。
      6. 二次抗体を添加する前に、胚を4°Cで0.1% PBST中で3回(それぞれ30分間)洗浄する。 二次抗体をブロッキング溶液で希釈し(1:1000)、4°Cで2日間インキュベートし、光から保護した。
      7. 胚を4°Cで0.1% PBST中で6回(それぞれ30分)洗浄する。
      8. 核対比染色のために、胚を4',6−ジアミジノ−2−フェニルインドール、二塩酸塩(DAPI)中でインキュベートし、PBSTで1:500に希釈し、4°Cのシェーカー上で一晩、光から保護した。
      9. 最後に、胚を4°Cで0.1% PBST中で3回(それぞれ30分)洗浄する。
    3. 組織クリアリングとスライド調製
      1. サリチル酸メチルまたはベンジルアルコールと安息香酸ベンジル(BABB)の混合物を用いた組織透明化
        1. サリチル酸メチルまたはBABBを使用して透明化する前に、メタノール濃度の連続した10%増加(4°Cでそれぞれ10分のインキュベーション時間)からなるメタノール/ PBSシリーズを介して、胚を100%メタノールにすることによって完全に脱水する。完全な脱水を達成するには、100%メタノールを新鮮なものに交換し、さらに10分間待ちます。
        2. 一連のサリチル酸メチルまたはBABBをメタノール中で20%連続して濃度上昇させ、各ステップについて20分間インキュベーションすることによって胚透明化を行う。サリチル酸メチルまたはBABB溶液が100%に達したら、新鮮な溶液のために2つの追加の変更を加える。
          警告: サリチル酸メチルと BABB はどちらもヒュームフード内で取り扱う必要があります。
          注:適切なクリアリングのためには、胚が完全に脱水されていることが不可欠です。メタノールが透明化溶液シリーズでサリチル酸メチルまたはBABBと完全に混合されることも不可欠です。
        3. 胚が完全に透明になったら、蛍光立体鏡を優先的に使用して個別に処理し、組織損傷の可能性を減らします。
        4. イメージングの場合は、75 mm x 25 mm のくぼみ凹面スライドガラスまたは 20 mm x 60 mm #1.5 カバーガラスに胚を取り付けます。後者のオプションでは、必要に応じて両側からのイメージングが可能になりますが、はるかに壊れやすく、シールが困難です。胚を爪楊枝、細かい綿の先端、パスツールピペット、またはその他の同様の器具を使用して顕微鏡スライドに移します。
        5. 胚の圧縮を避けるために、#1カバーガラスの破片(厚さ170μm)、シリコーンまたは薄い金属ワッシャーで作られたスペーサーを追加します。次に、マウントメディアを一滴加え、#1または#0 20x20 mmのカバーガラスで覆い、シールします。
        6. ガラスまたは金属スペーサーを使用する場合は、調製物をよりよく安定させるために溶融パラフィンでシールしてください - サリチル酸メチルまたはBABBで溶解するため、マニキュアでシールしないでください。泡を避けるために、カバースリップを片側に置き、徐々に静かに横にスライドさせます。必要に応じてメディアを追加します。
          注:クリアされた胚を操作する方法と顕微鏡スライドに取り付ける方法をよりよく理解するために、ビデオを参照してください。
      2. ラピクリアによる組織クリアリング
        1. RapiClearを使用する場合、胚脱水は必要ありません。ステップ1.2.2.9の後、75 mm x 25 mmのくぼみ凹面スライドガラスの中央に胚を置き、顕微鏡窪みスライド内のすべてのPBSTを除去し、200 μLの透明化溶液を加える。
        2. 光から保護されて10分後、胚が透明になり始めたら、透明化溶液を交換し、さらに20分間待って(光から保護)、カバースリップで覆い、片側から始めて、もう片方に向かって静かに移動します。
          注:胚を完全にクリアする時間は、胚の段階とサイズに応じて数分から一晩になることがあります。また、プロセス全体を実体顕微鏡下で行う必要があります。クリアリングと顕微鏡スライドの準備をよりよく理解するために、ビデオプロトコルを参照してください。
  3. 光投影断層撮影のためのサンプル調製
    メモ: 次の手順は、以前のプロトコルから変更されています。19,25,26.E18.5マウス胎児の分析のためのプロトコルについて説明する。
    1. マウス胎児の解剖と固定手順
      1. E18.5マウス胎児を冷たい(4°C)PBSで解剖し、すべての胚外膜を除去し、次いで新鮮なPBSで胎児を数回洗浄して、解剖手順中に生成された血液および破片を除去する。
      2. PBSで作られた4%PFA中の胎児を4°Cで5〜7日間固定する。
      3. 胎児をPBSで1回(15分)、次いで脱塩水またはPBSで3回(それぞれ30分)洗う。シェーカーで洗浄を行います。
      4. 100%メタノールまで、増加する濃度のメタノール溶液(脱塩水またはPBSで希釈された10%増加)でインキュベート(振とう機上のRTで25分系列)することによって胎児を脱水する。
      5. 100%メタノール溶液(新鮮なアリコートを使用)を3回(それぞれ20分)交換して、完全な脱水を確実にします。その後、胚を-20°Cで保存することも、漂白プロセスに直接(1日後)採取することもできます(ステップ1.3.2)。
    2. 漂白プロセス
      1. 天然色素沈着を除去するために、胎児をシェーカー上で(別々に)インキュベートし、まずメタノール中の5%H20 2で1日間、次いでメタノール中の10%H202中で、胚がすべての天然色素沈着を失うまで最大3日間培養する。
        警告: H 2 O2はヒュームフード内で慎重に取り扱ってください。試料と接触するとH2O2を含む漂白液は蒸気を生成するため、胎児を含むチューブは漂白手順全体を通して開いたままにしておく必要があります。いくつかの漂白プロトコルは、H2O2とホルムアミドとの組み合わせを示唆している。この代替手段を使用する場合は、希釈されていないホルムアミドにH2O2を添加すると爆発を引き起こす可能性があるため、特別な注意が必要です。
      2. 胚を逆メタノール系列(10%減少)で脱塩水中で徐々に再水和し、それぞれをシェーカー上でRTで20分間インキュベートし、最後に脱塩水で3回(それぞれ30分)洗浄する。1日待って、脱塩水を交換してさらに進んでください。
        メモ: 漂白プロセスの代表的な結果については、 補足図 1 を参照してください。
    3. 脱灰プロトコル
      注:脱灰はオプションですが、胎児や子犬に推奨されます。
      1. 胎児を0.1 M EDTAで42°Cで数時間洗浄し[Cho et al.27も参照]、その後脱塩水で5回(それぞれ20分)洗浄してEDTAを完全に除去して脱灰を行う。シェーカーですべての手順を実行します。
    4. クリアリングのためのサンプル調製
      1. 胎児を1%アガロースブロックに埋め込む。これらのブロックを準備するには、50mLのプラスチックチューブまたはシリンジ(シリンジの出口側を切り取り、プランジャーを使用して反対側を塞いで円筒形の空間を構築する)を溶融したアガロースで満たし、アガロースの胎児を垂直位置に置き、アガロースの凝固中に鉗子の助けを借りてこの位置をブロックの中心に保つ。
      2. ブロック付きの型を4°C(30分)に置き、アガロースを完全にゼリゼーションします。ブロック内の胎児の位置が間違っている場合や気泡が現れた場合は、ブロックを50°Cで一晩置いてアガロースを溶かし、翌日にこの手順を繰り返します。
      3. 胎児の入ったアガロースブロックを型から取り出し、脱塩水を入れた容器に入れます。15分後に新鮮な脱塩水と交換してください。
      4. BABBでクリアする前に、試料を脱水してください。組織の完全性をよりよく維持するために、メタノール濃度(脱塩水またはPBSで希釈)を10%増加させ、各ステップをシェーカー上のRTで45分以上、100%メタノールに達するまで徐々に胎児脱水を行う。
      5. 100%メタノール(新鮮なアリコートを使用)を交換し、最初に1時間間隔で4回、次に翌日に再び完全に脱水する。
    5. OPTイメージングのためのクリアリングプロセスとサンプルマウント
      1. 100%BABBに達するまで、メタノール中のBABB溶液のシリーズ(それぞれ2.5時間)を通して、BABB濃度が25%増加する状態で、シェーカー上の胎児をきれいにする。
      2. 胎児が完全に透明になるまで、BABB溶液を毎日新鮮なものと交換してください。このプロセスには 3 ~ 5 日かかる場合があります。胎児を含むブロックを、手順全体を通してシェーカーに保管してください。胎児は長期間100%BABB溶液にとどまることができます。
        注:胎児が正しく脱水されていない場合、最初にBABBを添加した後、わずかに半透明(「白っぽい」エマルジョン)になります。このような場合は、純粋なメタノールに戻り、新鮮なメタノールでさらに2回の洗浄を行います。脱水や清澄化を行っている間は、温度の変化が水の結露につながる可能性があるため、サンプルを冷蔵しないでください。
      3. クリアされたアガロースブロックをOPTスキャナの運動軸に取り付け、光学系を調整して胎児全体の画像を取得し、完全投影データセット19、28の取得に進む。

2. 顕微鏡/画像取得

  1. 正しい3Dおよび4Dイメージングを行うには、実験目標に最も適した顕微鏡を選択してください。 表 2 に、選択をガイドする一般的な情報を示します。
光学顕微鏡技術イメージング原理実験の目標と考慮事項
広視野イメージング蛍光、反射または透過光を使用します。胚の迅速かつ一般的な概要(スクリーニング、発生段階および明らかな表現型の評価など)に最適です。高倍率で観察可能な厚さと比較して被写界深度が減少すると、3D形態の正確な解釈や解析が可能になりません。
共焦点(レーザースキャン;ティッカー)レーザースキャニング照明とピンホールを通る蛍光の検出を使用します。蛍光標識されたサンプルの光学スライスを、理想的には強いシグナルでイメージングできます。ピンホールを通してイメージングすると、被写界深度外から信号が除去されるため、3Dで情報を正確に識別できます。この取得はワイドフィールドよりも桁違いに遅いですが、比類のないコントラストと形態学の3D識別を備えています。画像は一度に1ピクセルずつ取得されるため、高い時間分解能は達成できません。E9.5までの固定マウス胚の3Dイメージングに適しています。プレソミティック中胚葉またはソマイト全体を通るイメージングは、より深い組織における光散乱のために、組織クリアリングを必要とする。光毒性および漂白性は考慮事項である。フォトブリーチングは、制限内で、後部を補償することができる。しかし、生きたサンプル中の光毒性の影響は判断できず、しばしば決定することは容易ではありません。これは、サンプルが低い発現を示し、高いレーザー出力が必要な場合、より明白です。
二光子励起蛍光(TPEFM)可視レーザー照明の代わりにパルス近赤外(NIR)レーザー励起を使用します。TPEFMは、CLSMよりも厚いサンプルを通して光学スライスを可能にします。解像度はわずかに低いですが、より深い組織のコントラストはかなり良く、マウス胚のライブイメージングに最適です。TPEFMは、従来のCLSMよりも光毒性が低いと考えられることが多いが、高いレーザー出力を必要とし、細胞および組織にも有害な影響を及ぼす可能性がある。E11.5までの胚の3Dイメージングに最適ですが、前厌性中胚葉全体にわたるイメージングには依然として組織クリアリングが必要です。
共焦点(回転ディスク)単一のレーザーの代わりに、複数の点状の光源を使用する共焦点の一形態。複数の点状の構造を使用すると、CLSMよりも光学スライスを高速に作成できます(1秒あたり数フレームまたは1分あたりのスタックが達成可能です)。買収は事実上ワイドフィールドと同じくらい速く、合理的な3D差別があります。しかし、それはマウス胚の最も表在的な組織の画像化のみを可能にする。CLSMよりも高感度な検出が可能で、蛍光タンパク質の発現が低い胚の代替品となります。
ライトシート/シングルプレーン(LSFM/SPIM)広視野または点状の照明の代わりに、サンプルは一度に1つの直交平面を照明する。ほとんどの構成では、複数の角度からのイメージングが可能です。また、蛍光標識されたサンプルも必要です。光学スライスの取得取得は非常に高速で(1秒あたり数フレーム)、光毒性や漂白の影響が軽減されます。ただし、マルチビューが必要な場合は、後続のデータセットの前処理手順で数時間/数日の計算が必要になることがあります。LSFM/SPIMは、CLSMよりも低い発現レベルのより良い検出を可能にする。胃形成中のtotoマウス胚の3Dイメージングに最適です。サンプルは、多くの場合、懸濁液(型破りな調製)でマウントおよび維持する必要があります。
光投影断層撮影(OPT)光学スライスは検出されないが、異なる角度からの胚全体の一連の広視野画像(「突起」)から計算される。後期段階のマウス胚/胎児(>5mm)の3Dイメージングに最適ですが、固定およびクリアのみです。蛍光サンプルと非蛍光サンプルの両方の光学スライスの3Dスタックを生成するという利点があります。データセットはアイソメトリック(3次元すべてで同じ解像度のスライス)であるため、解剖学的分析に最適です。投影データセットの取得には、わずか数分で完了し、その後に 15 ~ 30 分の再構成が必要になる場合があります。
光コヒーレンス断層撮影(10月)サンプルを通る NIR 照明を使用して、光反射との干渉に基づいて光学スライスを取得します。OCTは、数十マイクロメートルの分解能で生きた組織(蛍光コントラストなしでサンプルに数ミリメートルの深さ)を通して容易にイメージングを可能にします。集録は非常に高速です(毎秒数スライス)。OPT の代替手段として考えられますが、この手法は一般的には利用できません。
超解像(SR)、原子間力(AFM)、または近接場イメージング(NSOM)SRは通常、サブ回折分解能(数ナノメートル)での走査表面上の単一分子局在化およびAFM/NSOMに基づいている。サブ回折レベル(<200nmの分解能)でのイメージングを可能にし、多くの場合、細胞表面の単一分子または分子を検出することを意図しています。マウス胚などの大型サンプルの形態学的解析には理想的ではありません。取得は通常、低速なプロセス(画像ごとに数秒から数分)です。

表2 - 研究者の特定の実験目標により適したイメージング技術/顕微鏡の選択を導くための一般情報。

3. 画像データセットの前処理

注: ここでは、画像データセットの前処理、すなわちノイズリダクション(3.1)とデコンボリューション(3.2)の重要なステップのいくつかを強調し、3Dデータセットの時系列(3.3)とホールマウント免疫蛍光染色(3.4)の適切な準備と前処理を可能にするアルゴリズムを提供します。最後に、OPT データセットの前処理と再構築のプロトコルを詳細に記述した参照を示します。

  1. ノイズリダクション
    1. 画像が信号対雑音比の低下を示している場合は、Fiji/ImageJ29で利用可能な「中央値」フィルタや「異方性拡散」などの古典的な方法、または「CARE」30 や「Noise2Void」31などの機械学習に基づくより精巧な方法を適用することを検討してください。
      注:これは、フォトブリーチングと光損傷が大きな懸念事項であり、低露光とより高い検出器ゲインが必要なライブイメージングデータセットに特に関連しています。
  2. デコンボリューション
    1. 画像が高解像度(ナイキストサンプリングの近くまたはナイキストサンプリングで)で取得された場合は、解析前にデータセットの品質を向上させるために、デコンボリューションを使用して画像復元を実行することを検討してください。一部のデコンボリューションツールにはノイズ除去ステップも含まれていることに注意してください。
      注: これは Krull et al.32 および Huygens デコンボリューションソフトウェアのウェブサイト (https://svi.nl/HomePage) で入手可能なドキュメントで広く取り上げられています。
  3. 適切な視覚化と解析のための 3D データセット時系列の準備
    注:多くの場合、タイムラプスイメージング中に胚またはステージドリフトが発生する可能性があります。これは、解析を実行する前に修正する必要があります。場合によっては、ドリフトが十分に深刻であるため、集録を中断して調整を行う必要があります。この場合、同じ X、Y、Z 次元を維持するのが最善です。
    1. 個別の4Dスタックは、フィジーの"連結"関数を使用して単一の4Dハイパースタックに連結することができます。しかし、このツールはコンポジット/ハイパースタックを処理しないので、操作Imageを使用してすべての4Dセグメントを単純なスタックに変換する必要 があ|ハイパースタックの|スタックするハイパースタック。これらの4Dセグメントの順序を維持し、各セグメントに関する情報(チャンネル、スライス、タイムポイント)を書き留めるために、番号付けシステムを維持してください。すべてのセグメントについてこの手順を繰り返し、「Image |」の手順を使用してセグメントを連結します。 スタック|ツールの|連結。
    2. 連結されたハイパースタックを 操作 Image | で再構築します。ハイパースタックの|ハイパースタックにスタック し、異なるディメンションの正しい順序を選択します。ハイパースタックを調べて、すべてのディメンションが正しく順序付けられていることを確認します。
      注: チャンネル (c ) と スライス (z) の数は、すべての4Dセグメントで同じでなければなりません。(時間) フレーム数(t) は、すべての4Dセグメントに追加されたタイムポイントの合計に等しくなければなりません。ハイパースタックへの変換を実行する前に、スタックを参照して、さまざまな次元がどのように補間されるかを理解することが重要です。Fiji/ImageJ のデフォルトは、チャンネルを交互に、次に Z スライスを交互に、次にタイムポイントを交互に ("XYCZT") することです。これが顕微鏡によって生成されたデータに適用されることを確認します。
    3. 表示モードとして「合成」を選択し、タグ付き画像ファイル形式(TIFF)として保存します。大規模なデータセットの場合は、プラグイン | の操作を実行して、BigDataViewer33 形式への変換を検討し てください。ビッグデータビューア |現在の画像を XML/HDF5 として書き出します。これにより、BigDataViewer を使用してより効率的かつ 3D で参照できるデータセットが生成され、ビッグデータ データセット用の他のフィジー/ImageJ ツールで処理できます。
    4. 連結されたハイパースタック(3Dスタックの時系列)を登録して、必要なドリフト補正の程度に応じて、「正しい3Dドリフト」ImageJプラグイン34 またはBigStitcherプラグイン35のいずれかを使用して胚/ステージドリフトを補正します。XML/HDF5 ファイルは BigStitcher で開くことができます。
      注:細胞追跡または移動解析を実行する前に、胚の漂流を示す3Dタイムラプスの登録を実行する必要があります。ドリフトの補正は、形態形成運動を適切に解釈するためにも必要です。
  4. 免疫蛍光イメージングデータセットの前処理
    1. Z深度信号減衰
      注:信号減衰を補正するために私たちが提案する方法は有用ですが、深さの少ない信号が実際に光学現象ではなく生物学的現象を反映している可能性があるため、これは慎重に使用する必要があります。目的の分子が存在することも発現することも予想されない組織の領域における崩壊を測定し、その領域の補償を調整することを検討してください。それでもなお、深さの低い正の信号がある場合、それは実際の生物学的現象を明らかにするかもしれない。また、サンプルの一部の領域は、他の領域よりも多くの散乱またはレーザー減衰を生成する可能性があり、この単純な方法では完全に補正されないことも考慮してください。
      1. より厚い/後期段階の胚の場合、屈折率の不一致(搭載媒体と顕微鏡対物レンズとの間の)によって引き起こされるビーム減衰、フォトブリーチングおよび球面収差は、Zスタックのより深いスライスで蛍光強度が大幅に減衰するデータセットをもたらす可能性がある。したがって、解析前にこの信号損失を補償してください。最も正確な減衰を解析的に決定することは複雑でサンプルに大きく依存する36が、簡単な近似は、プロセスを使用してImageJ/Fijiで経験的に決定することができ |数学|マクロ 機能と プレビューをクリックします。
      2. フィジー/ ImageJでZスタックをロードし、手順 を実行します イメージ|スタック|スライスし直します。開始: 先頭、 補間を避ける にチェックを入れて OK にします。これで、"Z" が "Y" 軸になります。次に、 画像|を行いますルックアップ テーブル (LUT) |火災 (または他の多色のLUT)。これは、次のステップで最適な報酬を視覚的に評価するのに役立ちます。胚の中央にあるスライスに切り替えて、深さの減衰の影響がはっきりと見えるようにします(強度は上[表面]から下[より深い]に低下します)。
      3. 垂直(「y」)強度低下の補正の決定に進む手順 で、プロセス|数学|マクロ、およびここに書かれているとおりに次の "コード"を追加します。
        v = v * A * exp ( B * y/h )
        この式では、"v" はピクセル強度の変数 (深度の関数として調整されます)、"y" は深度の変数、"h" は深度、"exp" は指数関数です。"A" は 0.5 ~ 1.0 の数値に置き換える必要があります (Z スタックの最上位層の過飽和を避けるために、低い値を選択してください)。Bは、Z深度の減衰の程度に応じて、0.5〜2.0の数値に置き換えられます - 理想的には1でなければなりませんが、場合によっては最下層を正しく補償するために必要な量が少なくて済みます。B の値を大きくすると、減衰補償が大きくなります。 [プレビュー] をクリックして、最初の評価を行います。画像の上から下に向かって適切な補正が得られるまで、A と B のさまざまな値をテストします (この評価には "Fire" LUT が役立ちます)。問題がなければ、[OK] をクリックして設定を適用し ます。
        注: 赤方偏移した染料とレーザーの減衰が少なく、一部の染料は他のチャンネルよりも速く漂白するため、これは各チャンネルで個別に実行する必要があります。この手順は、深さの信号の減衰によって深刻な影響を受ける元の3Dデータセットで直接定量を実行するよりも確実に信頼性が高いですが、蛍光強度の深さの変化を確実に定量化できるほど正確ではない可能性があることに注意してください。この効果について同定および制御する1つの方法は、背側または腹側から異なる胚を画像化して比較することである。
      4. 補正されたZスタックの元のジオメトリを復元するには、 Image |スタック|スライスし直し、 一番上から開始し、[ 補間を避ける] にチェックを入れたままにすると、 "Y"は再び "Z"平面になる必要があります。「画像|を実行して色を置き換えますルックアップ・テーブル|グレー」(または選択した他のLUT)。元の非補償 Z スタックを破棄し、補正バージョンを保存します。
        メモ: Z深度信号減衰法の代表的な結果については、 補足図2 を参照してください。
    2. Z 軸スケーリング補正
      1. 胚の装着に使用されたものと異なる屈折率のために設計された対物レンズでイメージングする場合、スライスの厚さの再スケーリングを行う必要があり、さもなければ深さの測定は不正確であろう(組織をクリアした胚に「乾燥」対物レンズを使用する場合、潜在的に50%)。これは、 37 と 38で説明され、レビューされ、議論されたさまざまな方法です。実際のZ軸歪みスケールを解析的に決定することは複雑ですが、サンプルの屈折率と対物レンズの屈折率との比を見つけることによって、許容可能な近似値を容易に決定できます(例えば、乾燥した20 x対物レンズで画像化されたサリチル酸メチル除去胚の場合は1.53/1.0、BABBで透明化され、水浸漬対物レンズで画像化された胚の場合は1.56/1.33)。
      2. ZスタックデータセットがFiji/ImageJで既に開かれている(マルチチャンネル画像の場合、すべてのチャンネルと「コンポジット」としてアセンブルされた後)、 画像|プロパティ と変更 する ボクセルの深さ 画像取得時に得られたスライスの厚さに、前のステップで決定したZ軸スケーリング補正を掛けたもの(4.2.1;「画像データセットの前処理」セクション)。画像|を使用して結果を確認する スタック|直交ビュー。
    3. フィジー/ ImageJを使用した解剖学的に標準的な位置への胚の再配置
      注:胚の位置を変更する(で強調されている利点を参照してください)。 補足図 3)をフィジー/ ImageJを使用して標準化された前後[A-P]および背腹[D-V]軸位置にするには、TransformJの取り付けが必要です 39 フィジーの「ImageScience」アップデートウェブサイトからのプラグインスイート。
      注: この手法は、エイリアシング アーティファクトや解像度の低下を引き起こす 3 つの平面での回転のラウンドよりも適しています。ただし、Fiji/ImageJ 3D ビューアプラグインは 200 ~ 300 MB を超えるデータセットを適切に処理できないため (視野角を回転させようとすると、プラグインがレンダリングされないか、予測不能な動作を示すことがあります)、元の 3D データセットを最初にダウンサンプリングする必要があります。
      1. まず、フィジーの画像|のデータセットサイズを縮小します。 データセット を 200 MB 未満に減らすために必要な X、Y、Z の "scale" 値をスケーリングして挿入します (たとえば、0.5 x 0.5 x 0.5 のダウンサンプリングを行うと、データセットは 8 倍小さくなります)。 [新しいウィンドウの作成] オプションがオンになっていることを確認します。
      2. 次に、 プラグイン|3Dビューアに移動します。3Dビューアウィンドウ内で、胚をクリックして選択すると、赤い3Dボックスが表示されます。このモード (赤いボックスがアクティブになっている状態) を使用すると、データセットの回転をマウスで制御できますが、既定の動作である視野角を回転させる動作とは対照的です。マウスで胚の位置を変更するときは、外側をクリックしないでください。そうしないと、データセットの選択が解除されます。
      3. 胚の新しい位置に満足したら、[ 編集]を選択|変換| 「3Dビューア」ウィンドウのメニューで変換した画像をエクスポートします。異なる直交平面を調べるには、 画像|スタック|直交ビュー。胚が正しく配置されていない場合は、ウィンドウを閉じて 3D ビューア ウィンドウに戻り、再調整します。手順 4.3.2 を繰り返します。
      4. 胚が正しく配置されたら、「3Dビューア」ウィンドウのメニューから [編集]を選択|変換|変換を保存し、変換 マトリックスを拡張子 *.mat のテキスト ファイルに保存します。Fiji/ImageJを使用してこのテキストファイルを開き、最初の2行(テキスト)を削除して再保存します。これにより、 39で説明したプラグイン「TransformJ」と互換性のある変換行列ファイルが作成されます。
      5. フル解像度データセット (マルチチャネル複合ハイパースタックでも可) に切り替えて 、プラグインの操作を実行|変換J |TransformJ affine.新しいウィンドウで、以前に保存した行列ファイルを参照して検索し、 立方体 B スプライン補間|選択して等方的に再サンプリング|わかりました。
        メモ: この操作はメモリと CPU を集中的に消費します。ワークステーションとデータセットのサイズによっては、操作に数分から数時間かかる場合があります。 等方的に再標本するオプションを使用すると、変換操作中に分解能が失われないことが保証されるため、データセットのサイズが大幅に増加し、元の共焦点 z スタックのような異方性ではなくなります。Z 軸のスライスの数は、各スライスの X ピクセルと Y ピクセルの同じ数に増加し、スタックは元のサイズの 5 ~ 10 倍に肥大化すると予想されます。これは、回転および平行移動中のボクセルの補間中に情報が失われないことを保証するために必要です。
      6. 胚が適切に再配置されると、胚の周りに作成された空のスペースの大部分をトリミングすることがしばしば可能です。完全な Z 投影 イメージ|を実行するスタック|Z プロジェクト... をクリックし 、[最大強度]を選択します。XとYの胚全体を含む最小ROIを描画します。元のデータセット画像ウィンドウに切り替えて、[ 編集]|選択|選択範囲を復元し、[画像] を選択してトリミング |します。
      7. 胚組織と交差しない最初と最後のスライスをトリミングします。このためには、[画像|]を選択します。 スタック|ツールの|スライスリムーバー を選択し、削除する最初と最後のスライスを指定し、「インクリメント」を1に変更してください(それ以外の場合は、他のすべてのスライスのみが削除されます)。
      8. 新しいデータセットを再配置してトリミングした後は、必ず新しい TIFF ファイルとして保存してください。このデータセットが大きすぎる (GPU RAM を超える) 場合は、手順 3.3 (「画像データセットの前処理」セクションから) で説明したように、BigDataViewer を使用して XML/DHF5 としてエクスポートすることを検討してください。
  5. OPT データセットの前処理と再構築
    1. Martins et al.19 および Gualda et al.28 で説明されている OPT データセットの前処理と再構成のためのプロトコルを使用します。

4.3D レンダリング、視覚化、分析

注:ここでは、3Dイメージングデータセットの視覚化と分析を許可または強化するさまざまなソフトウェアツールの可能なアプリケーションのリストを提供します。

  1. Drishtiを使用した3Dレンダリングと視覚化
    注:Drishti 40は、マイクロCT、コンフォカル/マルチフォトン、ライトシート顕微鏡から3Dおよび4D データセットを探索して提示するように設計された無料の科学可視化ソフトウェアです。ここでは、このソフトウェアを使用して、3Dレンダリングと全マウント免疫蛍光染色の視覚化を行います(ステップ2;「3Dイメージングのためのサンプル調製」セクション)。ユーザーがDrishtiの操作方法を理解するのに役立つ複数のチュートリアルがオンラインにあります。オンラインで「Ajay Limaye Drishti 3Dチュートリアル」を検索してください。DrishtiはTIFFファイルのスタックを直接読み取ることができないため、最初にネイティブの「pvl.nc」形式に変換する必要があります。
    1. Drishtiのインストールフォルダにある「drishtiimport.exe」ツールを実行します: ファイル|負荷|ファイルの|「グレースケールTIFF画像ファイル」を選択し、Fiji/ImageJから保存されたシングルチャンネル3Dスタックをロードします。マルチチャンネルコンポジットスタックの場合は、Fiji/ImageJでチャンネルを分割し、それぞれを個別に保存します。ボクセルタイプは「ushort」です。"ファイル"..."名前を付けて保存"..."TIF"、すべての質問に "y" と返信します。ボクセルサイズを求める 追加情報 ウィンドウで、正しい「X Y Z」ボクセルサイズを追加してください。
    2. *.pvl.nc ファイルを Drishti にロードしてレンダリングする: Drishti のメインウィンドウで、 ファイル|負荷|使用可能なチャネル数に応じて 1 ( から 4 ) ボリューム を (別々のファイルとして) ロードします。読み込み後、 F2 キーを押して高品質のレンダリングを行います。このアクションには、強力な GPU カードが必要です。レンダリングパラメータを処理するための情報、 伝達関数エディタ、オンラインチュートリアルで検索します。レンダリングプロパティに満足したら、アニメーションレンダリングの生成に進みます。
    3. 「表示」に移動し、「キーフレームエディタ」をアクティブにします。胚を処理し、所望の開始位置に配置する。必要に応じてマウスの右ボタンを使用して胚を中央に「ドラッグ」するか、マウスをスクロールしてズームします。キーフレームエディタで「キーフレームを設定」をクリックし、別の位置、角度、またはズームを選択し、タイムラインマーカーを別のタイムポイントにドラッグして、キーフレームをもう一度設定します。これで、胚が2つの異なる位置/角度/ズームで表される2つのキーフレームと、その間にいくつかのフレームがあります。再生ボタンを押すと、Drishtiは不足している条件を補間し、アニメーションとして再生できます。ファイル|に移動[画像シーケンスを保存] は、すべてのフレームのアニメーションシーケンスを保存します。このフレームシーケンスは、後でフィジー/ ImageJで開き、AVI(ファイル|として保存できますインポート|画像シーケンス...ファイルの||として保存妥当なフレームレートでのJPEG圧縮(15〜30をお勧めします)。
      注:Drishtiでは* .wmvビデオの保存が可能ですが、代わりに別々のフレームとして保存し、後でシリーズをAVIまたはMOVビデオ形式に変換することをお勧めします(これはFiji / ImageJを使用して行うことができます)。
  2. アミラを使用した組織の3D再構成と手動セグメンテーション
    注:この商用ソフトウェアは、3Dデータセット内の胚組織の手動または自動/半自動の3Dセグメンテーションを可能にします。このソフトウェアにはオンラインの「ラーニングセンター」があり、複数のチュートリアルが利用可能です 41.以下に、免疫蛍光染色された胚から胚組織を手動でセグメント化するために必要な基本的なステップを説明する(ステップ1.2)。手動セグメンテーションは、胚が標準のA-P/D-V軸に正しく配置された後、はるかに簡単になります(「画像データセットの前処理」セクション、ステップ4.3を参照)。
    1. 3D TIFF データセットを読み込みます。尋ねられたら、正しいボクセル寸法を指定してください。視覚化モジュール ("Orthoslice" や "Volren" など) を作成して接続し、データセットを 3D で検査します。
    2. [ラベル] フィールドを接続します (または新しいバージョンの Amiraでは [新しいラベルフィールドを編集])。このソフトウェアでは、手動セグメンテーションの結果が「材料」に格納されるため、対象組織ごとに1つの材料を作成します。手動セグメンテーションには「なげなわ」ツールを使用します。これを実行する方法を説明するチュートリアルがいくつか用意されています(「アミラセグメンテーションエディタチュートリアル」をオンラインで検索してください)。
    3. 対象となるすべての組織のセグメンテーションが終了したら、プロジェクトモードに切り替えてセグメンテーションエディタを終了します。各マテリアルに属するピクセルが同じ値を持つ新しいバージョンのデータセット ("labels フィールド" は元のデータセット モジュールにアタッチされています) を作成しました。
    4. これらの「マテリアル」を 3D オブジェクトに変換するには、「ラベル」データセットから 3D サーフェス モデルを生成します。これを行うには、「サーフェスの生成」モジュールをアタッチし、必要に応じてパラメータを調整します(「コンパクト化」、「境界線」、「座標の調整」および「制約なしのスムージング」オプションを有効にします)。 「適用 」をクリックすると、新しいモジュール *.surf が生成されます。
    5. サーフェスオブジェクトを視覚化し、*objファイルとして個別に抽出およびエクスポートします。ディスプレイ|を取り付けるSurfaceView モジュールを *.surf モジュールに移動し、メイン ビューアーで検査します。「SurfaceView」モジュールの「プロパティ」パネルで、「マテリアル」プロパティで「すべて+すべて」を選択し、「削除」をクリックすると、ビューアのバッファが空になります。次に、[材料]プロパティの2番目のプルダウンで材料を1つだけ選択し、[バッファに追加]をクリックします。その材料だけが見えるはずです。
    6. プロパティ [スタイルを描画] で、その他のオプション|クリックしてサーフェスを作成すると、新しい *.surf モジュールが作成され、プロジェクトに追加されます。ティッシュの名前に変更し (キーボードの F2 キーを押し)、ファイル|データをエクスポート...タイプとして保存: 波面 (*.obj)。材料ごとに操作を繰り返します。
      注:これらの* .objファイルは、それぞれAmiraでセグメント化された組織の1つを含み、他のツール(Fiji/ImageJおよびSimLabの「3Dviewer」プラグイン)で使用できます。
  3. SimLab Composerを使用したポータブルドキュメント形式(PDF)でのインタラクティブな3Dビジュアライゼーション
    注:この3Dコンピュータグラフィックスソフトウェアは、表面レンダリング画像、アニメーション、シミュレーションの作成を容易にします。役に立つチュートリアルは 42 行目にあります。ここでは、このソフトウェアがAmiraで作成された波面(*.obj)3Dサーフェスファイルを使用して、3D PDFインタラクティブイラストレーションの作成をどのように可能にするかを説明します(ステップ2.3;「3Dレンダリング、視覚化、解析」セクション)。
    1. ファイル|に移動します。新規作成し、空のシーンを作成します。次に、ファイル|インポートし、Amiraから保存された最初の* .objファイルをインポートします。「ファイルのインポート」ウィンドウのすべてのオプションにチェックマークを付けずに、「OK」をクリックします。
    2. コンポーザーの表示ウィンドウに何も表示されない場合は、 Ctrl+F をクリックするか、アイコンをクリックしてすべてに 収まります。これで、セグメント化されたオブジェクトがウィンドウの中央に表示されます。このプロセスを繰り返して、別のセグメント化されたオブジェクトを追加し、最初のオブジェクト(たとえば、隣接する2つのソマイト)に対する相対的な位置を確認します。
    3. マウスの左ボタンでクリックして表示ウィンドウ内のオブジェクトの1つを選択し、解剖学的構造または組織の名前を反映するようにその名前を変更してから、「3DGeom~1」表現に切り替え、 マテリアル パネルを使用してR、G、B値を変更して色を変更します。
    4. 3D イラストレーションが完全にアセンブリされるまで、すべてのオブジェクトについて繰り返します。一部のマテリアルは、RGB値の横にある「アルファ」チャンネルを操作することによって透明にすることもでき、それによって内部または遮蔽されたオブジェクトの観察を可能にすることに注意してください。
    5. このソフトウェアを使用すると、組み立てられた胚のイラストを「3D PDF」ファイルとしてエクスポートし、出版物に含めることができます。まず、テキストとアクティブなリンクを含む「テンプレート」を作成して、「シーンの状態」を変更して、同じイラストに指示と3つの異なるステージを含めることができるようにします。これを行うには、「シーン構築」モードから「共有」モード(コンポーザーウィンドウの左側にあるボタン)に切り替えてから、「 PDF設定を表示」をクリックして新しいページテンプレートを作成します。原稿に含める単純なインタラクティブな図を作成するには、テンプレートを使用せず、単に PDFをエクスポートしてください。
      メモ: Adobe Acrobat Reader ソフトウェアを使用して 3D PDF を操作します(インタラクティブ 3D PDF イラストレーションの機能の操作性は、使用可能な Acrobat Reader のバージョンによって異なる場合があります)。他のほとんどのビューアは、Webブラウザを含む3D PDF形式と互換性がありません。このような3D PDFインタラクティブイラストレーションは、出版物に含めることができます。この可能性については、事前に編集者に尋ねてください。
  4. イマリスを用いた3D可視化・解析
    注:このソフトウェアは、直感的なインターフェースとワークフローにより、2D-4D顕微鏡データセットの包括的なイメージング視覚化、分析、解釈を可能にします。このソフトウェアを使い始める方法についてのいくつかの便利なチュートリアルがオンラインで提供されており、ウェブサイト(https://imaris.oxinst.com/tutorials)で入手できます。Imaris の大規模なデータセット (通常は GPU メモリよりも大きいデータセット) をより効果的に読み込んで操作するには、Imaris のインストール フォルダーにインストールされている "ImarisFileConverter.exe" プログラムを使用して、まずデータセットを "*.ims" に変換することをお勧めします。ImarisFileConverterは、フィジーのBigDataViewerによって保存されたOMEおよび「h5」ファイルを含む、多くの顕微鏡画像フォーマットを読み取ることができます。
    1. 3Dビジュアライゼーション
      1. このソフトウェアは、「3Dビュー」モードを使用してデータセットの3Dビジュアライゼーションをレンダリングすることができ、ユーザーはデータセットの表示方法にいくつかの調整を加えることができます(例えば、MIP(最大強度投影)またはブレンドモード(深度キューとシャドウによるより良いレンダリング)のいずれかを選択します)。
      2. 直交ビュー」モード - 適切な胚位置決め(ステップ4.3;「画像データセットの前処理」セクション)は、「セクション」タブを使用して胚全体をナビゲートし、通常の平面(横方向、冠状、矢状)から光学セクションを見ることができます。胚の位置が適切に再配置されていない場合、直交平面で解剖学を解釈することは非常に困難です( 補足図3を参照)。Imarisには、3D胚を分析する際にこの問題を回避するために「参照フレーム」と呼ばれる機能がありますが、先験的にデータセットを再配置することが好ましい。
    2. 3D解析
      注:このソフトウェアには、形態と蛍光強度を分析するためのいくつかのツールもあります。例として、ここでは、Imaris "Spots"ツールを使用して経時的な組織蛍光強度の変化を分析する簡単なワークフローについて説明します。このツールでは、ユーザーが手動で球状の関心領域(ROI)を胚に3Dで配置し、Imarisはこれらの球状ROI内の組織蛍光を測定できます。
      1. Imaris で 3D または 4D データセットを読み込み、3D ビューモードで新しいスポットを追加します。次に、胚の特定の点(4Dデータセットを使用する場合は複数の時点でも)を選択し、それらの斑点の内部、例えば強度平均を定量化することができます。
        メモ:このソフトウェアでは、時間の経過とともに強度をプロットすることもできます。これにより、ユーザーは「時間の経過とともにソマイト内の蛍光はどのように変化するか」などの質問に簡単に答えることができます。
      2. スポットモジュールを追加するには、「新しいスポットを追加」ボタンをクリックするか、3D ビューを選択して|イマリスメニューのスポット。[自動反応をスキップ]を選択し、手動で編集します。Imaris ポインター モードを [移動] から [選択] に切り替えます (これは、キーボードの ESC キーを押しても実行できます)。
      3. スポットのプロパティウィンドウで、スポットがアタッチされる特定のチャンネル(「チャンネル1」など)を選択し、手動トラッキングで選択したスポットへの自動接続と自動 進行前の遅延を有効にするオプションを有効にします。
      4. マウスカーソルをビジュアライゼーションウィンドウに移動すると、カーソルが中空の黄色の線球に変わります。タイムポイント 1 に移動し、対象組織をクリックしてスポット (=球) を追加します。球体(「スポット」)は、 Shift キーを押しながらクリックした場合にのみ追加されます。目的のすべての時点について繰り返し、組織の同じ部分を経時的に追跡するようにします。
      5. 「スポットのプロパティ」ウィンドウで、「統計」タブに切り替え、「統計」内で「全体」から「詳細統計」に切り替えます。最初のプルダウンから特定の値を選択し、2番目のプルダウンから「強度平均Ch=*...」を選択します(Ch*は測定が実行されるチャンネルです)。「クリックしてタイムプロットパネルを開く」の右側のボタンが、スポットプロパティウィンドウの左下にあります。このボタンをクリックすると、「スポット」内の蛍光強度の中央値が時間の経過とともにプロットされたプロットが開きます。これらの値は、スプレッドシートにエクスポートしてさらに分析することもできます。

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結果

ライブおよび免疫蛍光イメージングの両方についてこの論文に示された代表的な結果は、20×1.0NAの水対物レンズ、960nmに同調された励起レーザー、およびGaAsP光検出器(Dias et al. (2020)43に記載されているように)を備えた2光子システムを使用して得られた。光学投影断層撮影は、カスタムビルドのOPenTスキャナ(Gualda et al. (2013)28に記載されているように)を使用?...

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ディスカッション

軸方向の伸長とセグメンテーションは、脊椎動物の胚発生中に起こる最も複雑で動的なプロセスの2つです。単一細胞追跡を伴う3Dおよび4Dイメージングの使用は、しばらくの間、ゼブラフィッシュおよびニワトリ胚の両方においてこれらのプロセスを研究するために適用されており、そのためにアクセス可能性および培養条件が複雑なイメージングを容易にする19、44、45、46...

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開示事項

著者らは利益相反がないと宣言しています。

謝辞

LuVeLuレポーター株のオリビエ・プルキエとアレクサンダー・オーレフラ、RapiClearテストサンプルのSunJin研究所、BigStitcherを使用した支援のHugo Pereira、ライブイメージング装置のセットアップを支援してくれたNuno Granjeiro、IGC動物施設、およびこの作業の過程で有益なコメントとサポートを提供してくれたMalloラボの過去および現在のメンバーに感謝します。

我々は、ポルトガル2020年パートナーシップ協定に基づき、欧州地域開発基金(FEDER)及びFundação para a Ciência e a Tecnologia(FCT, Portugal)を通じて、リスボン地域運用プログラム(Lisboa 2020)が共同出資する、ポルトガルの資金提供 ref# PPBI-POCI-01-0145-FEDER-022122及びref# PTDC/BII-BTI/32375/2017の支援を受けているIGCの先進イメージングファシリティの技術支援に感謝する。この原稿に記載されている研究は、研究インフラCongento、プロジェクトLISBOA-01-0145-FEDER-030254(FCT、ポルトガル)およびSCML-MC-60-2014(サンタカーサダミゼリコルディア、ポルトガル)に助成金を支給し、M.M、研究インフラCongento、プロジェクトLISBOA-01-0145-FEDER-022170、およびPhDフェローシップPD/BD/128426/2017からADへの助成金によって支援されました。

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資料

NameCompanyCatalog NumberComments
Agarose low gelling temperatureSigmaA9414Used to mounting embryos (e.g. for OPT)
Amira softwareThermofisher-Commerial software tool
Anti-Brachyury (Goat polyclonal)R and D SystemsAF2085 RRID:AB_2200235For immunofluorescence
Anti-Sox2 (Rabbit monoclonal)Abcamab92494 RRID:AB_10585428For immunofluorescence
Anti-Tbx6 (Goat polyclonal)R and D SystemsAF4744 RRID:AB_2200834For immunofluorescence
Anti-Laminin111 (Rabbit polyclonal)SigmaL9393 RRID:AB_477163For immunofluorescence
Anti-goat 488 (Donkey polyclonal)Molecular ProbesA11055 RRID:AB_2534102For immunofluorescence
Anti-rabbit 568 (Donkey polyclonal)ThermoFisher   ScientificA10042 RRID:AB_2534017For immunofluorescence
Benzyl Alcohol (99+%)(any)-Used to clear embryos (component of BABB)
Benzyl Benzoate (99+%)(any)-Used to clear embryos (component of BABB)
Bovine serum albuminBiowestP6154For immunofluorescence
Coverglass 20x20 mm #0(any)-100um thick
Coverglass 20x20 mm #1(any)-170um thick
Coverglass 20x60 mm #1.5(any)-To use as “slides”
DAPI (4’,6-Diamidino-2- Phenylindole Dihydrochloride)Life TechnologiesD3571For immunofluorescence
Drishti software(open source)-Free software tool
EDTASigmaED2SSFor demineralization
Fiji/ImageJ software(open source)-Free software tool
GlycineNZYtechMB01401For immunofluorescence
Huygens softwareScientific Volume Imaging-Commerial software tool
HyClone defined fetal bovine serumGE Healthcare#HYCLSH30070.03For live imaging
Hydrogen peroxide solution 30 %Milipore1085971000For clearing
Imaris softwareBitplane / Oxford instruments-Commerial software tool
iSpacersSunJin Lab(varies)Use as spacers for preparations
L-glutamineGibco#25030–024For live imaging medium
Low glucose DMEMGibco11054020For live imaging medium
M2 mediumSigmaM7167To dissect embryos
MethanolVWRVWRC20847.307For dehydration and rehydration steps
Methyl salicylateSigmaM6752Used to clear embryos
ParaformaldehydeSigmaP6148Used in solution to fix embryos
Penicillin-streptomycinSigma#P0781For live imaging medium
PBS (Phosphate-buffered saline solution)BiowestL0615-500-
RapiClearSunJin LaboratoryRapiClear 1.52Used to clear embryos
Secure-Sea hybridization chambersSigmaC5474Use as spacers for preparations
simLab softwareSimLab soft-Commerial software tool
Slide, depression concave glass - 75x25 mm(any)-To mount thick embryos.
Triton X-100SigmaT8787For immunofluorescence

参考文献

  1. Wilson, V., Olivera-Martinez, I., Storey, K. G. Stem cells, signals and vertebrate body axis extension. Development. 136 (12), 2133(2009).
  2. Dias, A., Aires, R. Axial Stem Cells and the Formation of the Vertebrate Body. Concepts and Applications of Stem Cell Biology. , 131-158 (2020).
  3. Tzouanacou, E., Wegener, A., Wymeersch, F. J., Wilson, V., Nicolas, J. F. Redefining the Progression of Lineage Segregations during Mammalian Embryogenesis by Clonal Analysis. Developmental Cell. 17 (3), 365-376 (2009).
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