オゾンとLPS誘発マウス急性肺損傷時の肺細胞適応の可視化

要約

オゾンと細菌性内毒素を組み合わせたマウスは、好中球を含む広域細胞死を示す。細胞骨格ラメリポディアの破壊、気管支-肺胞洗浄における複雑なV ATPシンターゼサブユニットβおよびアンジオスタチンの細胞発現の増加、肺免疫応答の抑制および好中球の遅れなど細胞適応を観察した。

要約

肺は、無菌(粒子または反応性毒素)および感染性(細菌、ウイルスまたは真菌)の炎症状態の形で直接的および間接的な侮辱に絶えず直面している。圧倒的な宿主応答は、呼吸の低下および急性肺損傷をもたらし、これは病理論理的宿主免疫、凝固および組織改修応答の結果として肺好中球の募集によって特徴付けられる。マウス肺の細胞適応を可視化し定量化する敏感な顕微鏡的方法は、低用量(0.05ppm)オゾンに応答して、細菌リポ多糖と組み合わせた強力な環境汚染物質、TLR4アゴニストであり、宿主の炎症および修復メカニズムを理解するために極めて重要である。各種肺および全身体区画、すなわち気管支肺胞洗浄液、肺血管透過液、左肺凍結切片、および胸骨骨髄透過液の包括的な蛍光顕微鏡分析について述べています。我々は、肺胞マクロファージ、好中球、肺の核組織、ならびに骨髄細胞と、分析された区画内の離散ケモカイン勾配によって特徴付けられた遅延(最大36〜72時間)の免疫応答と相関する骨髄細胞の損傷を示す。また、肺外細胞マトリックスおよび細胞細胞細胞骨格相互作用(アクチン、チューブリン)、ミトコンドリアおよび活性酸素種、抗凝固性プラスミノーゲン、抗血管新生ペプチド断片アンジオスタチン、ミトコンドリアATPシンターゼ複合体Vサブユニット、αおよびβを提示する。これらの代理マーカーは、 生体外 細胞ベースのアッセイおよび 生体内 動物イメージング技術(生体内顕微鏡など)を十分に補えば、新しい免疫調節剤に対する肺応答を理解するための重要な情報を提供できる。

概要

急性肺損傷(ALI)は、血液凝固、線維性および自然免疫系の同時活性化によって特徴付けされる感染性または他の有害な刺激に対する肺の重要な病理学的応答^{である1。}好中球は、トール様受容体(TLR)ファミリー^2、3、4を介して微生物と細胞内損傷パターンを速やかに感知する。好中球は、前形サイトカインおよび細胞傷害性顆粒内容物を放出し、その後、副次組織損傷を引き起こす可能性がある。続く歯槽の損傷は、アデノシン三リン酸(ATP)5などの分子の放出をもたらす二次細胞死と結婚し、免疫調節不全の悪循環に陥る。

ALIの理解における未解決の問題は、歯槽膜内で傷害がどのように開始されるかという問題に関連する。電子輸送複合体V、F1F0 ATP合成酵素は、炎症時に細胞(内皮、白血球、上皮を含む)の細胞上で、遍在的に発現することが知られているミトコンドリアタンパク質である。アクチンとチューブリンで構成される細胞骨格は、ミトコンドリアタンパク質と同様に、多くの細胞形状および機能調節を収容する。我々は最近、内因性分子によるATP合成酵素の遮断が、アンジオスタチン、無音性好中球の募集、活性化およびリポ多糖(LPS)が肺炎症を誘発したことを示^した。したがって、生化学的(ATP合成酵素)と免疫(TLR4)の両方のメカニズムは、肺の炎症時に歯槽バリアを調節する可能性があります。

オゾン(O3)への暴露は、環境汚染物質、肺機能の低下、肺機能の低下、肺感染症への感受性の増大、および_O3曝露の短い低レベルは、基礎となる心呼吸状態^{7、8、9、10、11、12、13、14}の死亡率のリスクを高める。従って_、O3の生理学的に関連する濃度への暴露は、炎症^7、8の基本的なメカニズムを研究するALIの有意義なモデルを提供^する。私たちの研究室は最近、低用量O₃誘導ALI¹⁵のマウスモデルを確立しました。低_O3濃度に対して用量および時間応答を行った後、我々は、2時間の0.05 ppm_O3への曝露が、LPSモデルと同様の肺ATPシンターゼ複合体Vサブユニットβ(ATPβ)およびアンジオスタチン発現によって特徴付けられた急性肺損傷を誘発することを観察した。インビタル肺イメージングは肺の損傷を示す肺胞アクチンマイクロフィラメントの解体を明らかにした、 そして、肺胞中隔反応性酸素種(ROS)レベルのアブレーション(ベースライン細胞シグナル伝達の省略を示す)およびミトコンドリア膜電位(急性細胞死を示す)を2時間暴露した後、異種肺¹⁸FDG保持16と相関した0.05 ppm O₃¹⁵に曝露し、好中球のリクルートおよびサイトカイン放出、最もILDF-16と¹⁶の放出を伴わない。私たちの最近の研究からの持ち帰りメッセージは、O₃が人間の暴露のために8時間(1日あたり)にわたって0.063 ppmの許容限界を下回る濃度で暴露されると指数関数的に高い毒性を生み出すということです。重要なことに、これらのサブ臨床_O3曝露が細菌内毒素¹⁷などによってTLR4媒介機構を調節できるかどうかについては、明確な理解は存在しない。そこで、デュアルヒット_O3およびLPS曝露モデルを研究し、免疫および非免疫細胞適応を観察した。

各種肺および全身体区画、すなわち気管支肺胞洗浄液(すなわち、 BAL)肺胞空間をサンプリングするBAL)、肺血管穿孔体(すなわち、LVP)が肺血管構造および肺胞中隔間質を凝視し、内皮障壁が損なわれた場合に、左肺凍結管、ラビン肺組織に残された常駐の腹膜および付着性白血球を調べた。、循環性白血球を表す末梢血および胸骨および大腿骨骨髄は、それぞれ炎症時に造血細胞動員の近位および遠位部位をサンプリングする。

プロトコル

この研究デザインは、サスカチュワン大学の動物研究倫理委員会によって承認され、人道的動物使用に関するカナダ動物ケアガイドライン評議会に遵守されました。生後6-8週齢の雄C57BL/6Jマウスを調達した。注:予定された終点の前に重度の無気力、呼吸困難または重度の苦痛の他の徴候を発症する動物を安楽死させる。

注:次の準備:27-18 G針鈍(マウス気管径に依存する)、鈍い針に合わせて適切なサイズのPEチューブ(すべてのマウスにPEカニューレを作る)、カニューレ、 2つの鋭いはさみ、2つの鈍い鉗子(小さい)、1つの鋭い鉗子(小さい)、3 1 mLの注射器、ラベル付きマイクロフュージ管(BAL、血液、血管および骨髄のパーズートコレクションのため)および標識されたバイアル(組織固定用)、組織採取のためのサンプル袋/クライオビアル、肉屋の綿糸ロール(適切なサイズの合字にカット)。実験に利用されるすべての化学物質は、 材料表に示されています。

1. ネズミ肺損傷誘導のためのオゾンおよびLPS暴露

1. オゾン暴露
   1. カスタムO₃ 誘導ボックスを準備します。マウスフィード、水筒、濃縮玩具、清潔な寝具を順番に追加し、マウスの住宅環境を模倣します。
      注:これらの手順は、マウスがカスタム誘導ボックスに収容されたときに食べ物や水に自由にアクセスできることを保証し、過度のストレスを軽減するのに役立ちます。
   2. O₃ キャリブレータ/ジェネレータ"ON"を切り替えて(入口ポートに向かって配置)、UVランプを手前(露出前の約15分)に安定化させ、インラインO₃ モニタで接続します。
      注:O₃ モニターは、一定のチャンバー空気温度(72±3°F)および相対湿度(50±15%)で出口からサンプリングされた平均0.05ppmを読み取る必要があります。
   3. O₃ 曝露の場合、マウスをカスタム誘導ボックスにそっと配置し、マウスを0.05 ppm_O3 に2時間連続的に曝露する。
2. 麻酔および鼻腔内LPS投与
   1. ケタミンとキシラジンの10mg/mLストックを別途準備します。
   2. ケタミン20部とキシラジン1部を混合してカクテルを準備します。マウスの重さがXgの場合は、(X/200)mLのケタミン/キシラジンカクテルを腹腔に注入します。1本のマウスに対して、10mg/mLケタミンストック1000μLとキシラジンストック50μLからなるカクテル1mLを調製します。マイクロフュージチューブで上下にピペットを入れ、よく混ぜます。
      注:ケタミンとキシラジンの在庫は、1週間前に準備することができます。
   3. 軽い腹腔内(IP)ケタミン(50mg/kg)/キシラジン(1mg/kg)の混合(例えば、25gマウスの場合、カクテルの0.125mLを注入する)の下でマウスを麻酔する。
   4. LPSの1mg/mL溶液を生理液で調製し、50μLの溶液をピペットで充填します。
   5. マウスを手のひらの後ろ側/背側で直立し、同じ手で耳を持ちます。さて、50μLのLPS溶液¹⁸ を鼻孔の外に穏やかに置き(すなわち、各鼻孔に25μL、1つの鼻孔に50μL、手順が速い限りは問題ではない)、マウスがLPS溶液を吸入することを可能にする。
   6. 50 μLの滅菌生理液を含むマウスを植え付ける。
      注意: 点心のために100 μLを超えないようにしてください。ボリュームが少なすぎると(すなわち、<50 μL)、鼻の沈着のみというリスクがあります。
   7. LPS投与後、頭をわずかに下に傾けた寝具のマウンドの上に、お腹や背中にそっとマウスを置きます。
      注:この向きは、鼻腔¹⁹内の溶液の保持を延長します。
   8. 暴露後0、2、4、24、36、72時間で、ケタミン(200mg/kg)/キシラジン(4mg/kg)ミックス(すなわち、X/50 mLのカクテル)ミックス(すなわち、X/50 mLのカクテル、Xはマウス体重がグラムまたは25gで0.50mL)でマウスを麻酔する。
   9. マウスが意識を失い、右反射(すなわち、上に置かれたときに引き返さない)まで観察する。さて、1〜2分後に著しく落ちるはずの呼吸(リズミカルな胸の遠足)と心拍数を監視することによって、麻酔の深さについてマウスをチェックしてください。
   10. 次に、ペダル反射、すなわち、後肢の数字のいずれかをつまんで、反射として、手足の後退を観察するために確認してください。マウスが反応する場合は、必要に応じて、追加の 0.1 mL 注射以上でトップアップします。
       注:深部麻酔を行うために、特定の株や肥満マウスは通常、分布の量が多いため、完全な麻酔(約10分以上)を許可しない場合は十分な時間を簡単に過剰に行うことができます。したがって、いくつかの株は麻酔に耐性があり、したがって、より多くのトップアップを必要とすることができます。この知識は、様々な系統および年齢のマウスに関する多くの実用的な観察と経験の後に取得されます。O3およびLPS露光の直後(すなわち、2時間の時点で)のパイロット実験もいくつか行われたので、我々はまた、これらの実験からのいくつかの非常に初期のBAL細胞分析を含み_、O3^とLPSの併用による即時の効果を強調した。

2. サンプルコレクション

1. 外科用トレイにマウスを置きます。今、穏やかに液の損失を避けるために両方の目に潤滑目軟膏を置き、70%エタノールスプレーでマウスを消毒します。
   1. 気管と胸郭を露出させるために、はさみで上下の皮膚膜を小さく切り裂きます。
   2. 胸骨のすぐ下にカットを行い、心臓を露出します。
2. 心臓穿刺
   1. ヘパリン化された注射器に取り付けられた25G針を右心室に入れ、心臓穿刺で血液を引き出す。
      注:心臓を心臓穿刺に曝す時間が1分以内の場合、血液は通常、最小限のプランジャードローで引き出されます。約0.4〜0.5 mLを収集した後、残りの血液を収集する前に数秒間一時停止する必要があります。これは、心臓が右心室室に任意の残りの体積をポンプできるように行われます。採血の終わりまでに、心臓はポンプに停止します。
   2. 血液を収集し、さらなる処理のためのマイクロフュージチューブに保存します。
3. 気管 切開
   1. ピンセット/鈍い鉗子を慎重に使用して、上の組織から気管領域を取り除きます。出血を避けるために、手術器具よりも手袋をした手を使用してください。多くの血液がにじみ出ている場合は、BALサンプルを汚染する危険性があります。好ましくないが、必要に応じて綿棒を使用してください。キムワイプはより良い選択肢です。
   2. さて、肺を露出させるために胸部を切り裂きます。ここでも、胸骨や肋間動脈や上大動脈を切断しないように 注意 してください。リブケージを進めながら小さな切り傷を作る)
   3. 気管切り取り口の下に綿の合字を渡し、当分の間そのままにしておきます。
   4. 遠位1/3rd部分の適切な位置で気管を切り取り、肺を指し示し、28G気管カニューレにアクセスできるようにする。
   5. 気管に28 G PEカニューレ(3-5 mmの最小の長さと挿入を容易にするためにトリム遠位端)を挿入します。分岐する前に気管の終わりに気をつけてから、1本のローブだけをサンプリングしないようにmmほど引き戻します。
   6. しっかりと、カニューレを所定の位置に保持するために綿の合字を結びます。カニューレを折り畳まないで下ろしてください。
4. 気管支肺胞洗浄(BAL)
   1. 1 mL の注射器に 0.5 mL の PBS を充填します。
   2. 今徐々に1 mLの注射器の助けを借りてカニューレにPBSの0.5 mLを注入します。
   3. PBSを注入した後、吸引に抵抗しない限り注射器を吸引する。
      注:BAL液を吸引している間に抵抗がある場合、それは肺胞または気管支組織の崩壊を示す。その場合、カニューレを小さな形で引き戻し、カニューレを組織の壁に取り外す。
   4. 標識されたマイクロフュージチューブに吸気液を採取し、氷の上に置きます。
   5. 同じバイアルで収集同様の方法で2つのより多くの洗浄を実行します(すなわち、0.5 X 3 = 1.5 mLの洗浄の合計)。
   6. 集めたBAL液の体積を測定します。洗浄の回復は90%に近いはずです。
5. 肺血管透過物(LVP)
   1. 右心室を通して浸透しながら肺のパーフューズのバックアップを避けるために、胸部と腹部の半分の間の場所で下降胸部大動脈を切断します。
   2. 切り取られた大オルタの端の近くの空洞を、血液を含まないブロット。
   3. 次に、右心室を通して注入された室温ヘパリン化生理食い物の0.5 mLで肺を浸透する。
   4. 下降胸部大動脈の切り取り端にある空洞から血管透過液を採取し、マイクロフュージチューブに入れ、その体積を測定する。
   5. 右気管支の近位を気管から分岐(綿糸付き)にリゲートします。
6. 左肺固定の場所で
   1. 1 mL シリンジを気管カニューレに接続します。
   2. 0.6 mLのマークまでシリンジに空気を引き戻します。
   3. その後、残りのシリンジ(最後まで)を室温で2%パラホルムアルデヒドで満たします。プランジャーがカニューレから空気を吸い戻すことなく飛び出す準備ができていることを確認してください。
   4. 次に、シリンジにスコッチテープを貼り付け、高さ20cmまで測定した直立容器に貼り付けます。
   5. 静かに、気管に向かって固定剤が流れるにはプランジャーを引き出します。カニューレに気泡が少しある場合は、シリンジの上にプランジャーをそっと置くと、数秒後に流体が流れ始めます。
   6. 左肺を20cmの水柱を形成する20cmの高さから5分間、 その中でその総容量に膨らませます。
   7. この手順の間、下流のアッセイに影響を与えるため、右肺葉がパラホルムアルデヒドと接触するのを防ぐようにしてください。
   8. 折り畳まれた実験室組織を置き、右肺葉に接触する可能性のあるパラホルムアルデヒドを吸収する。
      注意:パラホルムアルデヒドは非常に有毒です。したがって、身体の露出部分を吸入したり、接触させたりしないでください。取り扱い中は細心の注意を払ってください。
   9. パラホルムアルデヒドの内在時に、腹部を消毒する。
   10. 右肺ローブを気管から切り取り、スレッドを除去し、すぐにローブをラベル付きのクライボビアルに入れ、下流分子/生化学的サイトカイン分析/肺ホモゲネートのRT-PCR/ウェスタンブロット分析のために液体窒素に落とします。
   11. 慎重に任意の結合組織または胸膜のための左肺をトリミングし、4 °Cで24時間の2%パラホルムアルデヒドに浸します。
   12. 標準埋め込みプロトコルに従って、固定肺をパラフィンに埋め込む。
       注意: 肺サンプルを過熱しないでください。
   13. 腹部部分を切り、骨盤(股関節)の骨から脱皮する。
   14. 骨盤部分から左右の大腿骨の骨を分離し、氷の上に保管された生理食音で満たされたシャーレで。
7. 胸骨および大腿骨骨髄吸引物コレクション
   1. 実験室の組織を使用して骨から組織と筋肉をきれいにします。
   2. 腹側胸部と胸骨を、氷の上に保管されている生理食動物で満たされたペトリ皿に集めます。
   3. 胸骨と大腿骨の遠位と近位の先端を切ります。
   4. 1 mLの注射器に十分に取り付けられた針(24〜28 G)を使用して、0.5 mLの生理食音で骨を4回浸透させ、各骨の分画をフィルターを取り付け、氷の上に置かれたラベル付きチューブに集めます。
      注: 針ゲージは動物のサイズによって異なります。紅潮後、大腿骨は透明に表示されます。
   5. サンプルが採取されたら、マウスをビニール袋に入れ、適切な処分のために動物の死体冷凍庫に入れます。

3. サンプル処理

1. 合計 (TLC) および差動 (DLC) 白血球数
   1. 遠心分離末血、BAL、肺血管透過物、骨髄(胸骨および大腿骨)サンプルを500gで10分間用いた。
   2. 上清を収集し、フラッシュはそれらを凍結し、さらなる分析まで-80°Cでそれらを保存します。
   3. 200 μL以上のPBSで細胞を再構成します。
   4. 血球計上のBAL、血液、肺血管透過物および骨髄細胞を数えることによってTLCを行う。
   5. カルセイングリーンと赤エチジウムホモジマー-1の1 μLミックスを含むBALの別の9 μLアリコートを染色し、細胞内エステラーゼ活性と、血漿膜完全性の喪失による損傷したBAL細胞(赤)による生きた(緑色)細胞を定量化します。
   6. 2%の酢酸をRPCをlyseに加え、血液TLCの1:10比、肺血管パーフューゼートTLCの1:2比で添加する。
      注意:濃度が1mL当たり1x10⁶ 細胞(骨髄サンプルにとって非常に重要)である場合は、PBSで希釈することによって細胞濃度を調整します。
   7. DLcの下で説明するように、スライドと汚れ上の細胞スピンを調製するために細胞を遠心分離します。
      メモ:通常、1つのスライドに2つのサイトスピンを準備することができます。そして、10~15分間の空気乾燥後、染色工程を進める。
   8. 収集したBALをグループごとに3匹のパイロットマウスからそれぞれ2つのサイトスピンに分割し、活性酸化リン酸化(還元ミトトラッカー)でアクチン/チューブリンとミトコンドリアを染色します。さらに3匹のマウスのBALを利用して、それぞれ2つのサイトスピンに分け、NK1.1/Gr1/CX3CR1およびATPβ/Ki-67/CD61/アンジオスタチン染色スライド。BALを3匹のマウスからそれぞれ2つのサイトスピンに分割し、ATPα/Ly6GおよびCX3CR1/Siglec-Fの染色を行います。
2. 気管支肺胞洗浄(BAL)および肺血管パーフサテ(LVP)総タンパク質定量
   1. O3およびLPS誘発された血管障壁の摂動または2つの肺区画における相対的な腫瘍圧(すなわち、肺胞中隔(間質)および肺血管透過体(血管)コンパートメントを定量するために、採取された流体中の全タンパク質含有量を測定する。
   2. 標準的な洗剤耐性の着色アッセイを使用して、その総タンパク質濃度の解凍された上清分を分析します。
   3. 気管支肺胞洗浄(BAL)および肺血管透過物(LVP)ケモカイン分析
      1. 次に、33プレックスの磁気ビーズベースの免疫測定法を用いて、BALおよび肺血管透過物(LVP)上清中のケモカインを解析する。これは、結合露光後に確立された気道/インタースティジウム対血管ケモカイン勾配の方向性について通知します。
      2. Analyze the following panel of chemokines : CXCL13 (B-lymphocyte chemoattractant), CCL27 (IL-11 R-alpha-locus chemokine (ILC)), CXCL5 (epithelial-derived neutrophil-activating peptide 78 (ENA-78)), CCL-11 (eotaxin-1), eotaxin-2 (CCL-24), CX3CL1 (fractalkine), GM-CSF (CSF-2), CCL1, IFNγ (interferon gamma), IL-10 (interleukin-10), IL-16 (interleukin-16), IL-1β (interleukin-1 beta), IL-2 (interleukin-2), IL-4 (interleukin-4), IL-6 (interleukin-6), CXCL-10 (interferon gamma-induced protein 10 (IP-10)), CXCL11 (Interferon-gamma-inducible protein 9 (IP-9)), KC (keratinocyte chemoattractant), MCP-1 (monocyte chemoattractant protein-1), MCP-3 (monocyte chemoattractant protein-3), MCP-5 (monocyte chemoattractant protein-5), MDC (macrophage-derived chemokine (CCL22)), MIP-1α (macrophage inflammatory protein-1 alpha), MIP-1β (macrophage inflammatory protein-1 beta), MIP-2 (macrophage inflammatory protein-2), MIP-3α (macrophage inflammatory protein-3 alpha), MIP-3β (macrophage inflammatoryタンパク質-3β)、RANTES(活性化に調節され、正常なT細胞発現および分泌(CCL5))、CXCL-16、CXCL-12/SDF-1α(間質細胞由来因子1)、TARC(胸腺および活性化調節ケモカイン(TARC))、TECK(胸腺発現ケモカイン(CCL25))およびTNF(腫瘍因子α)。

4. 細胞スピン染色と肺の細胞

1. 細胞スピン生化学的染色
   1. 疎水性ペンでサイトスピンを囲み、処置中にインキュベーション用の化学物質を含む。
   2. 5分間PBSで細胞スピンを水分補給します。
   3. 2%パラホルムアルデヒドで細胞スピンサンプルを10分間固定し、それぞれ5分間PBSで3回洗浄します。
   4. 7分間70%のアセトンを氷冷で透過し、再びPBSで3回、それぞれ5分間洗浄します。
   5. アクチンとチューブリンまたは還元されたミトトラッカー(緑色で示すアレクサ488コンジュゲートファロイジンの2μg/ 50 μLの混合でインキュベート、および2μg/μLのAlexa 555コンジュゲートマウス抗αチューブリンまたは還元されたミトトラッカーを赤で示す)
      注:マウスIgG1アイソタイプ対照抗体を別のサイトスピンで使用して、チューブリン染色プロトコルを検証します。4.1.1 から 4.1.8 まで説明されているのと同じ手順を実行しますが、アイソタイプ コントロールの場合は同じ手順を実行します。
   6. スライドからミックスをそっと傾けることで汚れを取り除きます。DAPI(4′,6-ジミディノ-2-フェニリンドール)でスライドを5〜10分間インキュベートして核を染色します。
   7. サイトスピンをPBSで3回洗浄し、それぞれ5分間、アンチフェードマウントメディアでカバースリップし、イメージング前に室温で暗い場所で一晩保管します。
   8. 科学カメラを搭載した広視野直立顕微鏡で画像を取得します。スライドをイメージングする際に、異なる蛍光チャンネルに設定されたカメラ露出時間を一貫して確保します。
2. 細胞スピン免疫蛍光染色:
   1. 疎水性ペンでサイトスピンを囲み、処置中にインキュベーション用の化学物質を含む。5分間PBSで細胞スピンを水分補給します。
   2. 2%パラホルムアルデヒドで10分間インキュベートして細胞スピンサンプルを固定し、それぞれ5分間PBSで3回洗浄します。
   3. 0.1%冷たいトリトンX-100で2分間透過し、それぞれ5分間PBSで3回洗浄します。
   4. 次に、Fcブロックは、Fcブロック抗体ストックの1:50希釈でサイトスピンをインキュベートして15分間(一次マウス抗体がマウスFc抗体と非特異的に交差反応しないようにするため)である。
   5. スライドにヒントを与えてFcブロックを取り除き、目的とする3つの一次抗体を混合してサイトスピンを1%BSAに変更し(様々な組み合わせについては 表1 参照)30分間インキュベートします。
      注:我々の最近の研究²⁰で説明したように、isotype対照抗体(ステップ4.2.1〜4.2.9を実行し、抗体をアイソタイプコントロールに置き換えることによって、マウスIgG1とラットIgG2bカッパ一次抗体を併用してインキュベートする)を、対応する二次抗体と並行して実行してください。
   6. PBSで3回、それぞれ5分間洗います。適切に設計された二次抗体を混合してサイトスピンをインキュベートする(詳細は 表1 参照)。
   7. スライドからミックスをそっと傾けて汚れを取り除き、核を染色するために5〜10分間DAPI(4′,6-ジミジノ-2-フェニリンドール)でインキュベートします。PBSで3回、それぞれ5分間洗います。
   8. アンチフェード取り付けメディアでカバースリップし、イメージングの前に室温で暗い中で一晩保存します。
   9. 科学カメラを搭載した広視野直立顕微鏡で画像を取得します。スライドのイメージング時にすべての蛍光素チャネルに設定されたカメラ露出時間を一貫して確保します。
3. ヘマトキシリンとエオシン(H&E)の病態
   1. すべてのグループの肺クライオセクションで修正されたH&E染色³ を行う。
4. 画像解析
   1. フィジーのImageJオープンソフトウェア(https://imagej.net/Fiji/Downloads)で画像データ(.tiff)ファイルを処理し、分析します。
   2. 必要なパラメータ (面積、周長、統合密度、形状記述子、フェレットの直径、円形度、表示ラベル) を [解析 ]タブと [測定を設定]の下に記録することを確認します。
   3. ROI マネージャを使用して、マージされたイメージ パネルの 50 ~ 200 個のセルを手動で「フリーハンド選択」ツールを使用してアウトラインを作成します。Ctrl+Tコマンドを使用して対象領域 (ROI) を保存し、各セルの保存された ROI をすべてのフルオロフォア チャネルにコピーします。
   4. 次に Ctrl+M を押して、すべての蛍光チャネル(例えば、405 nm(青でDAPIまたはATPβ)、488nm(緑色のアクチンまたはNK1.1またはKi-67)、568nm(赤でチューブリンまたはGr1またはCD61)および633nm(CX3CR1またはアンジオスタチン中のママ)の事前設定パラメータを測定する。
   5. 解析を表す適切な名前で結果.csvファイルとして保存します。.csvファイルの結果をスプレッドシートにコピーし、染色された分子の蛍光強度(FI)(結果ファイルの生の統合密度列)をDAPIまたはCD61 FIの場合、染色設計に従って分割します。これらの比率は、「DAPIまたはCD61正規化FI比」と呼ばれます。
   6. 次に、これらの正規化比率、円形度、細胞周囲およびフェレット径をプロットし_、O3 とLPSを合わせた後の細胞サイズの変化を評価する。
   7. 適切な統計ソフトウェアを使用して、収集したデータの正規性を確認し、帰無仮説を検定します(以下の統計分析セクションを参照してください)。
5. 統計分析
   1. SEM±平均として結果を表現します。1群につき少なくとも3匹のマウスを使用した。
   2. ケモカインデータ解析では、ベンジャニとホシュベルク補正に従って、誤検出率の一方向ANOVA p値を調整します。
   3. これらのデータが正常に分布していなかったので、画像パラメータ、細胞性、フェレット径、周長、DAPIまたはCD61正規化蛍光強度比をMann-Whitney U検定(2つのグループを比較するため)またはクルスカルウォリス試験(複数群を比較するため)による分析。
   4. 残りのイメージング実験では、一方向分散分析を使用して結果を分析し、その後にSidakの多重比較を行います。p値<0.05は有意であると考えられた。

結果

O₃およびLPS曝露を組み合わせることで、72時間で全身性炎症および骨髄動員が発生する:異なるコンパートメントにおける細胞数は、末梢血の有意な変化を明らかにし、大腿骨骨髄総細胞数は_O3およびLPSを合わせた。_O3とLPSを合わせた露光は総BAL(図1A)またはLVP(図1B)の細胞数に変化?...

ディスカッション

現在の研究で提示された方法は、肺の炎症中に複数の細胞事象を研究するための複数のコンパートメント分析の有用性を強調する。我々は、その結果を表2にまとめた。私たちおよび多くの研究室は、肺中球の急速な採用によって特徴付けられた鼻内LPS点眼に対するマウス応答を広範囲に研究してきました。そして最近、サブ臨床_O3(2時間0.05ppm)単独で、肺血管区画内の好?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
33-plex Bioplex chemokine panel	Biorad	12002231
63X oil (NA 1.4-0.6) Microscope objectives	Leica	HCX PL APO CS (11506188)
Alexa 350 conjugated goat anti-mouse IgG (H+L)	Invitrogen	A11045
Alexa 488 conjugated goat anti-mouse IgG (H+L)	Invitrogen	A11002
Alexa 488 conjugated phalloidin	Invitrogen	A12370
Alexa 555 conjugated mouse anti-α tubulin clone DM1A	Millipore	05-829X-555
Alexa 568 conjugated goat anti-hamster IgG (H+L)	Invitrogen	A21112
Alexa 568 conjugated goat anti-rat IgG (H+L)	Invitrogen	A11077
Alexa 633 conjugated goat anti-rabbit IgG (H+L)	Invitrogen	A21070
Armenian hamster anti-CD61 (clone 2C9.G2) IgG1 kappa	BD Pharmingen	553343
C57BL/6 J Mice	Jackson Laboratories	64
Confocal laser scanning microscope	Leica	Leica TCS SP5
DAPI (4′,6-diamidino-2-phenylindole)	Invitrogen	D1306	aliquot in 2 µl stocks and store at -20°C
Inverted fluorescent wide field microscope	Olympus	Olympus IX83
Ketamine (Narketan)	Vetoquinol	100 mg/ml	Dilute 10 times to make a 10 mg/ml stock
Live (calcein)/Dead (Ethidium homodimer-1) cytotoxicity kit	Invitrogen	L3224
Mouse anti-ATP5A1 IgG2b (clone 7H10BD4F9)	Invitrogen	459240
Mouse anti-ATP5β IgG2b (clone 3D5AB1)	Invitrogen	A-21351
Mouse anti-NK1.1 IgG2a kappa (clone PK136)	Invitrogen	16-5941-82
Pierce 660 nm protein assay	Thermoscientific	22660
Rabbit anti-angiostatin (mouse aa 98-116) IgG	Abcam	ab2904
Rabbit anti-CX3CR1 IgG (RRID 467880)	Invitrogen	14-6093-81
Rat anti-Ki-67 (clone SolA15) IgG2a kappa	Invitrogen	14-5698-82
Rat anti-Ly6G IgG2a kappa (clone 1A8)	Invitrogen	16-9668-82
Rat anti-Ly6G/Ly6C (Gr1) IgG2b kappa (clone RB6-8C5)	Invitrogen	53-5931-82
Rat anti-mouse CD16/CD32 Fc block (clone 2.4G2)	BD Pharmingen	553142
Reduced mitotracker orange	Invitrogen	M7511
Xylazine (Rompun)	Bayer	20 mg/ml	Dilute 2 times to make a 10 mg/ml stock