フィールドベースの熱生理学的アッセイ:周囲条件下でのコールドショック回復

要約

ここでは、環境条件下での蝶のコールドショック回復を評価するために、低コストでアクセス可能なプロトコルについて説明する。

要約

生態学的生理学、特にエクトタームは、生物とその周囲の相互作用を探求し、生存と適性をよりよく理解するために、種と環境特性の尺度を使用するため、この変化する世界でますます重要となっています。従来の熱アッセイは、時間、お金、設備の面でコストがかかるため、多くの場合、小さなサンプルサイズと少数の種に限定されます。ここで提示される、蝶の例を用いて、大きな、ボラント、地上の昆虫の個々の行動と生理学に関する詳細なデータを生成する新しいプロトコルです。本論文では、環境条件下で現場で行うことのできるコールドショック回収アッセイの方法について説明し、費用のかかる実験装置を必要としない。この方法は、熱帯蝶のコールドショックに対する応答と回復戦略を理解するために使用され、蝶の群集全体にわたって個々のレベルのデータを生成しています。これらの方法は、リモートフィールドの設定と教室の両方で使用することができ、生態学的に関連する生理学的データを生成し、教育ツールとして使用することができます。

概要

1970年代後半から1980年代初期の熱生理学と生態学の統合^は、2、生態学生理学の分野を立ち上げました。エクトテルムに関する広範な熱的研究は、多様な環境進化的文脈にわたって生態学的生理学的相乗効果を強調する^3、4,5。近年、世界中の気候変動や変化した熱景観に直面して、熱生理学の研究が注目を集^{めている。}生態学的生理学の学問分野における研究を知らせるだけでなく、熱生理学アッセイは研究者が広くアクセス可能であり、あらゆるレベルの実践的な教育アプローチとして役立ちます。熱的な限界や温度ショックの影響を含む熱性能の成分は、動物の生態、行動、および生命史の基本である^8,9.

具体的には、エンドサミーが周囲温度と生物温度の間の密接なリンクを指示するので、エコトーサームは生理学の質問に対処するために使用されます。生物が耐えることができる温度範囲(極度の熱最小から最大熱範囲)と、その行動とフィットネスが最大化される温度(熱最適化)は、しばしば生態学的および進化的プロセスに根ざしています。これらの生理学的特徴は、温度として重要性が高まり、平均と極端の両方が^、10を増加している。例えば、異常な変化は、温度上昇を含め、生息地の破壊および断片化に伴うが、アヌランを含むエクトサームの群集に影響を及ぼす、生理学的に脆弱な種(狭い熱耐性を有する)を小さな残骸生息地パッチ^11、12に制限する。

熱性能の主要なコンポーネントを評価することは、時間とリソースの両方の面で高価であり、従来は実験室の機器と標準化された条件を必要とします。さらに、従来のアッセイは、類似の生理学実験における温度が慎重に制御され、しばしば動物が経験する周囲条件とは無関係であるため、与えられた動物¹³によって自然界で経験される周囲条件の広さを反映していない。この温度制御は、個々の応答^2、14の変動の理解を減少させることができます。生理学者は、実験室ベースの加熱および冷却実験に依存してきました, 熱性能曲線^を知らせるために着実に加熱または動物の環境を冷却するためにプログラム可能な水浴を使用して.

通常、動物は熱電対を有するバイアルに入れられ、周囲の水浴の温度を制御することによって周囲温度が着実に変化する。研究者は、変化した生理学的状態(例えば、チル昏睡、ノックダウン)と状態変化が発生した温度を達成するのにかかる時間^を測定する^16,17.500米ドル以上から始まるこれらのツールは、大型で重く、追加の技術機器(例えば、コンピュータ、熱電対)を必要とします。その結果、熱性能を評価する古典的な方法を実行するための基本的なツールは、1)すべての人が経済的にアクセスできない、2)小さなディプテランに使用される慣習的なバイアルに含まれるには大きすぎる動物をアッ言するのに適していない、および3)リモートフィールド設定で使用するためにポータブルではない。一般的な慣行への遵守は分類および実験条件^18、19、20の間で限定された表現をもたらした。

完全な熱性能曲線は、種の分布、生命史の形質、行動を知らせることができますが、他の形質の中でも、より少なくシンプルな熱メトリックの定量化はより効率的で、依然として非常に有益です。生理学的アッセイは、寒冷昏睡発症およびその後の冷ショック回復を測定し、冷硬化、および正しい行動、生物の臨界熱最小の有効かつ実行可能なプロキシである^8。ここに記載されているコールドショックアッセイは、大きな地球性異性体の昆虫から生理学的データを引き出すのに有用である。このアッセイは、フィールド条件下または教室で、手頃な価格でアクセス可能で簡単に実行できます。このプロトコルによって生成されたコールドショック回復に関するデータは、種または個々のレベルの形質データと結合して、生態学的生理学に関する質問を追求したり、生理学的原理について学生に教えるために使用することができます。

プロトコル

1. 対象種の同定

1. 関心のある種を特定して、コールドショック回復時間を決定します。各グループは、寒い昏睡を誘発するのにかかる時間が異なります(すなわち、昆虫がまだ生きているが、動いておらず、応答しない点)。同様に、データの生物と使用に基づいて、焦点を当てる個人が飛ばなければ実験を停止する別のカットオフポイントを選択します(セクション4を参照)。
   注: このプロトコルは、Lepidoptera で使用するために設計および開発されました。しかし、それは大きな、ボラント、地上の昆虫、特に、動きや損傷を制限するグラシンエンベロープ(例えば、蝶やトンボ/ダムリー)に平らに保管することができるものに適用されます。

2. 公判の実施

1. 個人の小さなサンプルに対して前判を行い、主要なパラメータを決定します。以下のプロトコルのセクション3〜5に従い、5〜10人の個人を前判にします。
   1. 氷上でチル昏睡を誘導するために必要な時間をテストする(動かない)が、30分、60分、90分の治療を用いてステップ5.1に従うことによって焦点種を殺さない。
      注:寒い昏睡を誘発するために必要な時間は、個人のサイズ、場所、自然史/行動に依存します。
   2. ステップ4.1-4.4の結果に基づいて、焦点昆虫の生態に関する知識を使用して、特定の個人が完全に回復しない場合に試験を終了する時間を選択します。この時間は、同様に種の生態にカットオフを基地、飛行することができないの何分の後、多くの昆虫が前もっていることを心に留めて。
      注:たとえば、ほとんどの予備試験が15分後に飛行中に終了した場合、外れ値でさえ完全に回復する機会(つまり、飛行)を確実にするために、25分後に試験を終了することを決定することができます。このプロトコルは、30 分のカットオフ時間 (ステップ 5.4) に基づいています。
2. 公判前データのパラメータを使用して、実験用のデータ収集を通知します。氷のスラリーの時間、試験を最後まで呼び出す時間、データシートに記録されている行動(例えば、シヴァーは、選択した昆虫にとって不適切な行動である可能性がある)など、焦点生物のニーズに基づいて、以下に説明するプロトコルを変更します。
   1. パラメータを調整しながら、これらのデータで回答する特定の研究の質問を定義します。
      注:例えば、研究者が長時間の暴露が回復に及ぼす影響に興味がある場合、氷の中の時間は変更する重要な変数です。研究者が明るい色と暗い色の種の生理学の違いに興味がある場合は、2つの明確な色の種を選択するか、昆虫の翼の色を変更して、回復時間に対する翼の色の影響を測定することができます。重要なことに、この方法は、ニーズや研究の質問に対して高度にカスタマイズ可能です(説明セクションを参照)。

3. 昆虫の収集

1. 餌付けトラップや昆虫網などの適切な方法を用いて昆虫を収集する(補助図 1)。コレクションの際には、一意のIDを持つ別々のガラス封筒に各個人を配置します。
2. 捕獲された後、コールドショック実験に暴露する前に、シェーディングされた涼しい場所に動物を保管してください。捕獲されてから24時間以内に実験処理に動物を常にさらし、試験をまたいで可能な限りこの時間を標準化する。
   1. 貯蔵条件は異なる場合がありますが、昆虫を直接太陽から遠ざけてください。可能であれば、涼しく暗い部屋に屋内に置きます。
   2. 現場では、保存中にシェーディングされ、風(吹き飛ばされる)や封筒に入る可能性のある他の昆虫捕食者から保護されていることを確認してください。

4. コールドショック実験の設定

1. 冷却器に氷と水を入れます。少なくとも1時間は持続するのに十分な氷があることを確認し、必要に応じて定期的に氷を加え、0°Cの水中環境を維持することを目標にしてください。
2. 実験のラウンドのために1と4の焦点の個人の間で選択し、各個人が識別可能であることを確認します。
   1. 複数の種を使用する場合は、データシート上の混乱を避けるために、それぞれ 1 つだけを使用します。1つの種のみを試す場合は、例えば壊れた翼や明確なマーキングなどで容易に区別できる個体のみを使用してください。
   2. 実験の目的が翼の着色と無関係である場合は、個々を区別するために細かいフェルトチップマーカーでユニークなID(例えば、数字)で翼をマークします。
   3. 実験が上記の基準のいずれも満たしていない場合は、一度に1人の個体に対して実験を行う。
3. 種名や区別文字などのノートに一意のIDと有用な識別子を含む各昆虫アッセイに関連する情報をデータシートの行に設定する(補足表1)。
4. すべての焦点の個人(まだ個別にマークされた封筒に)を重み付きの密閉されたビニール袋に入れ(材料表)、60分間氷水に入れます(またはチル昏睡が誘発されるまで、議論を参照)。
   1. 重量が重く(例えば、大きな硬貨、大きな洗濯機、滑らかな岩)であり、昆虫の袋を氷水に沈め、水面に垂直に保つのに十分な大きさであることを確認してください。密封されたビニール袋に漏れを起こさない重量を使用してください。
      注:昆虫は水没中に直接水にさらされた場合でも回復することができますが、濡れた封筒は個々の除去を複雑にします。それは彼らのバッグの中で乾燥した昆虫を維持するのが最善です。
5. 温度と光のデータを記録します。
   1. ステップ 5.1 または 5.2 を使用して周囲温度と光データを記録するには、データロガー( 材料表を参照)を使用します。
      1. 昆虫が放出される時から、10s間隔で温度と光のデータを収集するようにデータロガーをプログラムします。
      2. データロガーの開始時刻を、昆虫が氷水に入れられた時点に基づいて設定します。データロガー情報(日付、時刻)が同期され、周囲の状況に関するデータが後で個々の焦点昆虫と一致するようにします。
   2. 簡単な温度計を使用して、温度と光のデータを短い間隔で(2人目の研究者によって)記録します。
      1. データロガーなしで測定できる復旧時間に関連付ける実験用パラメータを決定します。個別のトリートメントを使用する:日陰/太陽;夕暮れ/真昼。
6. 温度と光環境がケージ内で可能な限り均質になるように、適切な場所に昆虫のメッシュケージを配置し、ケージのベースが上昇し、観察者によってタップされるようにします。
7. データロガーをケージのすぐ外側に置くか、ケージの内側に置いて、ケージ内の小さな動きによって倒されたり、影響を受けたりしないようにします。データロガーを使用しない場合は、温度計を適切に配置するか、適切な設定でケージを設定します。
   注: データロガーは、記録された周囲の状態が、昆虫が経験している環境条件にできるだけ近づくように配置する必要があります。

5. コールドショック実験を開始

1. 60分後に氷水浴から動物を取り除く(または適切な時間を決定した;上記参照)。すぐにビニール袋から昆虫を取り出し、取り扱いを最小限に抑えながら、できるだけ早く各個体をエンベロープから取り出します(補足図3)。
2. 動物がメッシュケージに入ったらすぐにストップウォッチを開始します(サンプルデータ、 補足表1を参照)。
3. ケージのベースを鉛筆でタップして、回復する昆虫を攪拌します。
   注:回復中に刺激を提供することで、焦点昆虫が生理学的に可能になるとすぐに回復状態と行動を示すことができます(補足ビデオ)。
   1. 動物が可能であれば応答しますが、応答を引き起こさないことを確認するために、頻繁かつ強くタップします。
      注:例えば、ケージをタップすると、動物が空中にカタパルトされ、直立して着陸しても、生物が実際に単独で立っていなかったので、それは「スタンド」行動とは見なされません。
4. 個人が飛行した後に、トライアルを完了としてマークします(つまり、完全な回復を示しています)。試験を終了し、昆虫が30分後に動かない場合、完全に回復したと考えてください。
5. メッシュケージから昆虫を取り除き、ラベル付きのガラス封筒に個人を戻します。動物を解放するか、さらにデータ収集のためにそれらを維持します(例えば、サイズ、体重の個々の形質)。
6. データロガーを使用する場合は、データロガーのデータ収集を停止し、適切な日付/時刻情報を使用して実験中に温度と光のデータのファイルを保存します。

6. データ処理

1. データシートから提示されたデータをスプレッドシートに入力します (MS Excel など)。
2. データロガーを使用する場合は、個々のアッセイの応答ごとに温度と光データを追加します。
   1. 各個人のそれぞれの動作の温度と光の平均と標準偏差を計算します。
      注:データロガーは10 sごとにデータを記録するので、1匹の動物のスタンド動作が48 sを取った場合、そのトライアルのためにデータロガーからの最初の5エントリを使用してください。
   2. 各個人の各回復動作をデータロガーによって記録された、必要に応じて 10 s 間隔に切り上げたり切り捨てる、アバイオティクス データと関連付ける。
3. データをプロットして分析します。 図1は、例えば、低温衝撃回復時間に対する温度と光の影響を可視化する。他の関連データ(種の形質、地域の生息地の特徴)をコンパイルして、テストしたグループの生理学的形質における生態学的および進化的パターンを調べる。
   注: 図 1 は、R の ggplot2 パッケージを使用してプロットしました。周囲の条件に関するデータの詳細レベルは、周囲の状態を測定するために使用される計測器によって異なります。データロガーを使用すると、 図2 に相当する詳細を持つ図形が生成されます。温度計を使用すると、研究者は周囲光によって通知されるプロットを作成することはできません。同様に、研究者が光や温度のカテゴリを使用する場合、これらの散布図をボックスプロットまたは別の適切なテンプレートに変更して、これらの現象を説明することができます。

結果

このプロトコルで収集されたデータは、組織生理学にとって重要な変数の検査と区分化を可能にする。例えば、温度と光の両方の条件が、コールドショックからの蝶の回復に寄与する(図1)。このプロットは、周囲の状態とコールドショック回復の相互作用を調べるものです。トラップと網の両方から野生捕獲された蝶を使用して、181種の蝶がコールドショックによって誘発された冷たい昏睡から明確な回復を示した(図2)。図2に示すデータは、コロンビアアンデスで約5ヶ月間(2020年1月、2月、5月から7月)に3人のオブザーバーによって収集されました。実験は、常に蝶の収集後の朝に行われました。最大効率で、2人の観察者がそれぞれ4つの蝶を同時に観察し、7回(最低7.37時間)繰り返し、1朝に56人の個体をテストすることが可能でした。これにより、個々のバリエーションに関するデータを含めたり考慮しながら、バタフライコミュニティ全体で多くのデータ収集が可能になります。アッセイは周囲の環境条件下で起こり得るため、回復条件は生息地を代表し、自然界の生物が経験する自然変動を反映しています。図3は、コールドショック回復実験の温度と光条件と、試験された蝶が採取された牧草地の条件との間の重複を示しています。

図1:コールドショック後の蝶の回収時間(秒)の散布図(A)平均温度及び(B)は、回復中のLUX(光強度)を意味する。種は家族によって組織され、着色されています。全体的に、光と温度の上昇に伴い、コールドショック回復時間が減少し、タキサ全体に変動を示します。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図2:コロンビア・アンドスの181種のバタフライに対するコールドショック回復アッセイの結果の例 データは、寒さから蝶を取り除いてから経過した秒数と飛行ができた時間を表します。種は家族によって組織され、着色されています。この図は、この実験をうまく適用できる分類学的幅と、種間のコールドショック回復応答の多様性を示しています。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図3: 低温ショック回復試験中の周囲温度とLUX 周囲温度(青)とLUX(光強度、赤色)のプロットは、バタフライコレクションが行われた牧草地に配置されたデータロガー(明るい色、条件は一日中にわたる)とコールドショック回復試験中の条件(暗い色、朝の時間のみ)によって記録されます。プロットされた周囲のフィールド条件と実験条件は、フィールドサンプリングと実験の1週間にわたって蝶が経験した平均条件の範囲と平均を示しています。実験は早い時間(07:00-13:00)にのみ行われ、データロガーは1週間フィールドに展開されました(日照時間、06:00-18:00 h)。ここに示されているのは、蝶が経験する実験条件と周囲条件の重複であり、周囲の条件下で生理学アッセイを行うことの生態学的関連性を示している。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

補助 図1:焦点昆虫を収集するための手順-この場合、蝶-餌付きヴァン・ソメレントラップと活性網を使用して。 トラップは腐った魚と腐ったフルーツの餌の両方で餌付けされました。背景に(餌なし)トラップは、前景には、青いプラスチック製の収集ボックスに対するユニークな封筒の標本です。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足 図2:最大4羽の蝶が氷水に沈んだ袋を冷却器に入れる。 ビニール袋は氷水に入れられた時間でマークされていたので、コールドショック実験は朝を通してずらされる可能性があります。プラスチック袋は、標本が濡れないように密封する必要があります。しかし、この場合の袋や封筒の洪水は、蝶の回復に測定可能な影響を与えはありませんでした。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補助 図3: 2人の観測者が現場でデータを収集します。 各メッシュケージには、コールドショックから回復する4つのユニークな蝶が含まれています。ケージ内のポリ塩化ビニルTジョイントは、直接の太陽や雨の露出を防ぐためにデータロガーを収容します。各観察者は、ケージに蝶の解放直後に開始されたストップウォッチを持っています。ケージはベンチによって上昇し、観察者は蝶が生理学的に可能な限り迅速に行動的に反応することを確実にするためにケージの基部を攪拌することを可能にする。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足表 1: データ・シートの例。 シートには、フィールドに割り当てられた各蝶の一意の ID と、ノート内の識別文字 (種名、キーの色) が表示されます。また、回復期間中に蝶の支配的な位置(すなわち、翼のどの側が太陽にさらされたか)も記録され、D(ドーサル)またはV(腹側)として指摘される。 このテーブルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足ビデオ1:コールドショック回復のためのケージのタッピング。 蝶が回復すると、観察者はケージの根元を静かにタップして、蝶が可能になるとすぐに行動を誘発します。 このビデオをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

ディスカッション

熱生理学の研究は、生存とフィットネスの鍵となる生物とその周囲の相互作用をよりよく理解するために、種と環境特性の尺度を組み込んでいます。常に植物や動物の自然史と生態を理解するために不可欠であるが、熱形質は、景観や気候変動^11、21に直面して重要性が高まっている。特に、鱗翅目およびオドネータンの等級は、比較的大きく豊富であり、独特な行動を示し、操作に適している。ここでは、このような昆虫の生理学的応答を効果的に測定するための効率的で低コストのアッセイを概説する。このプロトコルは、実験前の取り扱い時間が限られているアッセイするために健康な生物の供給源を必要とします。一度にアッセイされる生物の数は柔軟ですが、実験ごとの焦点個体数は、データ収集の目的やオブザーバーの数によって異なります。

例えば、このプロトコルは、コミュニティ全体の蝶に関する詳細な個々のデータを収集するために開発されました。そのため、代表的な結果は、できるだけ多くの種の個体に対して、そして地域環境に関連する様々な条件下でデータ収集を最大化するための取り組みを示している。焦点種の数に関係なく、観察者が回復を経験しているケージ内の各個体を識別できることが重要です。1つの種からデータを収集することが目標の場合、1つまたは2つの個体(異なる翼摩耗に基づいて識別できる場合、または個別にマークされている場合)のみを一度にアッセイする必要があります。研究対象は、特定の研究課題または研究計画に従って選択されなければならない。提起された質問とデータ収集の目的(研究や教室など)に基づいて、サンプルのサイズと他の特性の収集は異なります。

このプロトコルによって解明された生理学の基本的な構成要素(寒性昏睡の誘導、回復のステップ、周囲の状態の役割)を説明するために、教室のインストラクターは、単一の種の2つの異なる種または形態を選択することができる。焦点の個人が1つの重要な特性(例えば色)でしか異ならない場合は、より小さなサンプルサイズが必要であり、学生はその形質と組織生理学の関係を綿密に研究することができます。生態学的生理学に興味がある研究者は、実験データを使用して複雑な生態学的および進化的な問題を探求することができる。研究者は、自分の質問に直接対処する焦点昆虫(例えば、ライフステージ、年齢、性別、場所に基づいて)を慎重に選択し、関係する変数の数に基づいて、適切なサンプルサイズを決定する必要があります。複雑なモデルのサンプル サイズは、上記のサイズよりも大きくなります。

行動回復データを収集している間、観察者はケージの底をタップして回復行動を引き出すことができる必要があるため、ケージが地上に残ることは重要です。これにより、生物は生理学的に可能になるとすぐに応答(スタンド、ハエ)を保証し、端末の回復行動(飛行)が文書化されます。コールドショック回復中の周囲の状態を記録することは、このプロトコルが研究し、生物生理学における環境の役割を混乱させるように設計されているように、熱生理学の研究に不可欠です。データロガー( 材料表を参照)は、関連する条件(温度、光、湿度など)の標準化された測定値を記録するのに役立ちます。しかし、これらのツールが使用できない場合は、デジタル温度計や環境条件の変数を単純化し、日陰や太陽などの異なる環境を使用するなど、他の方法で関連する条件を測定することができます。このプロトコルは、研究の目的と範囲に基づいてコールドショック回復中の条件を測定するための研究者のオプションを提供します。

この方法は特定の分類群により適するように変更できますが、大きなボラントな昆虫を使用することをお勧めします。独立して飛ぶ能力を取り戻す飛行昆虫は、完全な回復を達成したと考えられるかもしれません。この方法は、説明したように、熱帯および亜熱帯の蝶にうまく使用された。特定の領域の熱的傾向(すなわち、変化する場所で経験される温度の範囲、したがって、標高、緯度、天蓋カバーに基づく期待に影響を与える)に基づいて、生物は氷水浴でチル昏睡に入るのに1時間以上または1時間未満を必要とするかもしれません。生物の大きさは、寒冷昏睡状態に入るのに必要な時間にも影響を与える可能性があります。寒冷昏睡(動かない)を誘発するために必要な冷たい暴露の時間を見つけることが重要ですが、焦点種を殺すものではありません。寒冷昏睡を誘発するために必要な時間は、個人の大きさ、場所、自然史/行動に依存します。本明細書に記載されたコールドショック実験の結果に基づいて、焦点昆虫の生態に関する知識を用いて、特定の個体が完全に回復しない場合に試験を終える時期を選択する。

研究者の具体的な質問に基づいて、この方法は、それぞれ、重要な変数のための自然環境変動と制御の両方を可能にするために、フィールドまたは実験室のいずれかで採用することができます。このアッセイは、簡単で安価であり、熱生理学の分野で既存のギャップを埋めるのに役立ちます。このプロトコルの容易さは、それがラボに優しい生物以上にフィールドを開く、分類の多様な配列のために採用することが可能になります。標準化された環境熱アッセイを行うことの新しさにより、実験室と現場の結果²²との間のギャップが埋まります。生物の回復のための周囲条件を活用することは、研究者が生理学^14、22における環境および種要因の役割^を分割するのに役立ちます。最後に、低コストと必要な材料の不足のために、このプロトコルは、多くのフィールド生物学者だけでなく、教室で少しの機器で、現場の遠隔地で使用することができ、若い学生に実践的な学習体験を提供します。

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
24 x 24 x 36" Popup Rearing & Observation Cage	Bioquip	1466PB	Ensure that the cage is slightly elevated from the ground to be able to tap the floor of the cage during experiments.
Cooler	Any	NA
Glassine envelopes	Bioquip	1130B
HOBO Pendant Temperature/Light 8K Data Logger	Onset	UA-002-08	If a datalogger is not accessible, researchers may choose to use a digital thermometer to record ambient temperatures at regular intervals. See protocol step 4.5 for additional information.
HOBO Optic USB Base Station	Onset	Base-U-1
Ice water	NA	NA
Insects (focal taxa)	NA	Any	Collect sufficient samples to test, ensuring replication of experimental groups (e.g. species, sampling location)
PVC T-joint	Any	Any
Sealable plastic bag	Any	NA
Stopwatch/timer	Any	NA
Weight	Any	NA	Large coins or small rocks to weigh down the plastic bags will ensure that specimens are submerged in ice water. A standardized weight is ideal.