JoVE Logo
著者
お問い合わせ

サインイン

このコンテンツを視聴するには、JoVE 購読が必要です。 サインイン又は無料トライアルを申し込む。

この記事について

  • 要約
  • 要約
  • 概要
  • プロトコル
  • 結果
  • ディスカッション
  • 開示事項
  • 謝辞
  • 資料
  • 参考文献
  • 転載および許可

要約

げっ歯類やヒト被験者の脳組織から 生き生きとした 生体試料中のアクチンフィラメントを定量化するための、シンプルで時間効率の高い高スループット蛍光分析ベースのアッセイを報告する。

要約

細胞骨格の主要成分であるアクチンは、神経の構造および機能の維持において重要な役割を果たす。生理学的状態では、アクチンは、単量体球状(G-アクチン)および重合糸状(F-アクチン)の2つの形態で平衡状態で生じる。シナプス末端では、アクチン細胞骨格が重要なシナプス前およびシナプス後機能の基礎を形成する。さらに、アクチン重合状態の動的変化(球状と糸状のアクチン間の相互変換)は、シナプス構造および機能における可塑性関連の変化と密接に関連している。我々は、 エクスビボ 条件におけるアクチンの重合状態を評価するための修飾された蛍光ベースの方法論をここに報告する。このアッセイは、アクチンフィラメント(F-アクチン)に特異的に結合するファロトキシンである蛍光標識ファロイジンを採用し、重合糸状アクチンの直接尺度を提供する。原理の証明として、げっ歯類と死後のヒト脳組織ホモジナートの両方にアッセイの適合性の証拠を提供する。ラトランクリンA(アクチンフィラメントを非重合する薬剤)を用いて、F-アクチンレベルの変化をモニタリングする際のアッセイの有用性を確認する。また、我々は、高細胞外K+での脱分極による刺激時のアクチン重合の増加を確認する単離シナプス末端の生化学的分画にアッセイを拡張する。

概要

細胞骨格タンパク質アクチンは、構造的なサポート、細胞輸送、細胞運動性および分裂を含む複数の細胞機能に関与している。アクチンは、単量体球状アクチン(G-アクチン)と重合糸状アクチン(F-アクチン)の2つの形態で平衡状態で発生する。アクチンの重合状態の急速な変化(G-とF-の間の相互変換)は、迅速なフィラメントアセンブリと分解をもたらし、細胞生理学におけるその調節の役割の根本となる。アクチンは神経細胞骨格構造の主要な構成要素を形成し、広範囲の神経機能1,2に影響を及ぼす。注目すべきは、アクチン細胞骨格はシナプス末端の構造プラットフォームの不可欠な部分を形成する。このように、シナプス形態形成および生理学の主要な決定要因であり、シナプス3、4、5のサイズ、数および形態の制御において基本的な役割を果たしている。特に、動的アクチン重合脱重は、記憶および学習プロセスの基礎となるシナプス可塑性に関連するシナプスリモデリングの重要な決定要因である。実際、シナプス前(例えば、神経伝達物質放出6、7、8、9、10)およびポストナプティック機能(可塑性関連動的リモデリング11、12、13、14など)の両方が、アクチン細胞骨格の重合状態の動的変化に大きく依存する。

生理学的条件下では、F-アクチンレベルは、翻訳後修飾4、15、16だけでなく、アクチン結合タンパク質(AMP)4、17を含むマルチモーダル経路を介して動的かつ緊密に調節される。AMPは、複数のレベルでアクチンダイナミクスに影響を与えることができ(例えば、重合の発芽または抑制、フィラメント分岐の誘導、フィラメントの小片への切断、脱重化の促進、脱重化からの保護など)、様々な細胞外および細胞内信号18、19、20に敏感な厳格な調節制御の下にある。複数のレベルでのこのような調節チェックは、シナプス細胞骨格におけるアクチンダイナミクスの厳格な調節を指示し、基底および活動誘発状態の両方で神経生理学の前および後のナプティックな側面を微調整する。

神経生理学におけるアクチンの重要な役割を考えると、神経変性、心理疾患、神経発達疾患3、21、22、23、24、25、26、27を含む神経疾患の広い範囲に関連する重要な病原性事象として、アクチンダイナミクスの変化の証拠を提供したいくつかの研究が驚くべきことではない。しかし、神経生理学や病態生理学におけるアクチンの重要な役割を指摘する豊富な研究データにもかかわらず、アクチンダイナミクス、特にシナプス細胞骨格の理解には依然として大きなギャップが残っています。より多くの研究は、病理学的条件下での神経アクチンとその変化のより良い理解を持っている必要があります。.この文脈における主な焦点領域の1つは、アクチン重合状態の評価である。ウエスタンブロッティングベースの商用キット(G-アクチン/F-アクチン in vivoアッセイ生化学キット;細胞骨格SKU BK03728,29)及びF-アクチンレベル6の評価のための自家製アッセイ。しかし、これらはF-アクチンとG-アクチンの生化学的分離を必要とし、その後の定量化は免疫ブロッティングプロトコルに基づいているため、時間がかかる可能性があります。我々は、F-アクチンの基底レベルの両方を評価するために使用できる修飾を用いて、以前の研究30から適応した蛍光分光法ベースのアッセイと、その組立分解の動的変化を報告する。特に、1 mLキュベットに適したサンプルを必要とするオリジナルのプロトコルを、現在の96ウェルプレート形式に効率的に変更しました。したがって、改質されたプロトコルは、アッセイに必要な組織/サンプル量を大幅に減少させました。また、このプロトコルは、脳組織の均質化だけでなく、単離シナプス末端(シナプトソームおよびシナプトニューロソーム)などの細胞内分画にも適しているという証拠を提供する。最後に、このアッセイは、解剖されたばかりのげっ歯類の脳組織と長期保存された死後のヒト脳サンプルに使用することができる。注意すべきは、アッセイは神経細胞の文脈において提示されるが、それらに関連する他の細胞型および生理学的プロセスに好適に拡張することができる。

プロトコル

実験動物のケアと使用における倫理に関するオタゴ大学委員会の規則に従って、すべての実験的手続きが行われました(倫理議定書第1項。AUP95/18およびAUP80/17)およびニュージーランド議会。ヒト脳組織は、スペイン・バルセロナの病院クリニックIDIBAPSバイオバンクの神経組織銀行から得られた。すべての組織収集プロトコルは、病院クリニック、バルセロナの倫理委員会によって承認され、インフォームドコンセントは、家族から得られました。

1. バッファーおよび試薬の調製

  1. 脳組織の均質化とシナプス末端の濃縮された分率の調製のために、次のバッファーを準備します。
    ホモジナイゼーションバッファー: 5 mM HEPES, pH 7.4 0.32 M スクロースを補った
    リサスペンションバッファー:5 mMトリス、pH 7.4 0.32 Mスクロースを補充
    洗浄バッファー: 5 mM トリス、pH 8.1
    1.2 Mスクロース
    1.0 M スクロース
    0.85 Mスクロース
  2. プロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤の自家製または商業的なミックスを追加します。
    注:完全なプロテアーゼ阻害剤ミックス(10 mLバッファーあたり1錠)とホスファターゼ阻害剤カクテルIV(1:100;ボリューム:ボリューム)のEDTAフリーバージョンを使用しています。
  3. 以下のバッファーと試薬を準備して、ファロイジンの固定、透過性、結合を行います。
    クレブスバッファー: 118.5 mM NaCl, 4.7 mM KCl, 1.2 mM MgCl2,2 mM CaCl2,0.1 mM KH2PO4,5 mM NaHCO3,10 mM グルコース, 20 mM HEPES, pH 7.4
    1 M KCl
    25% グルタルアルデヒド (ストック溶液)
    0.1 % トリトン X-100 および 1 mg/mL NaBH4を含むクレブス バッファー
    400x アレクサフルオール 647 ファロイジンイン DMSO
    0.32 Mスクロースを含むクレブスバッファー
    50 μM ラトランクリン A イン DMSO (ストックソリューション)
    1 M KCl (ストックソリューション)
    注意:ファロイジンは有毒(LD50 = 2mg / kg)であり、注意して取り扱う必要があります。グルタルアルデヒドの吸入は有毒であり、それはフームフードで処理する必要があります。
  4. 長期保存のために-20 °Cで4°CおよびファロイドンおよびラトランクリンAで緩衝液を貯えてください。
    メモ: バッファの長期保存はお勧めしません。プロトコルはここで一時停止することができます。

2. 脳組織均質化

  1. 陶芸器-エルベジェム ガラス管および氷上の害虫の均質化バッファーの10体積で凍結保存または分解されたばかりのラットの脳組織を均質化する。
    注:最適な均質化は、脳組織のために手で15〜20ストロークの害虫によって達成される。正常な均質化はガラス管を通る懸濁液の滑らかな流れによって確認することができる。プロトコルはここで一時停止することができます。
  2. ブラッドフォードアッセイ31を用いてホモジネート中のタンパク質濃度を決定する。
    注:タンパク質推定のための代替自家製または商業アッセイも使用することができます。
  3. 50 μLの体積で2-3 mgタンパク質/mLの濃度でクレブスバッファー内の均質化サンプルを希釈します。
    注:いくつかの実験では、37°Cで2μMラトランクリンAまたはDMSO(コントロール)を1時間インキュベートします。このために、ホモジナートは48 μLのクレブスバッファに再懸濁され、2 μLの50 μMラトランクリンAまたは2 μLのDMSOが加えられました。さらに免疫ブロッティングのために、少量のサンプル(10 μg)をインキュベーション後に回収する。
  4. ホモジネートサンプル(セクション5)を固定します。

3. 隔離された神経終末の準備

  1. シナプトソームの調製
    注: シナプトソーム用の代替プロトコル32,33も使用できます。
    1. 遠心分離機脳は、4°Cで10分間1,200xgでホモゲネートする。
    2. 粗核分画であるペレットを捨てる。
    3. さらに遠心分離機(S1)をステップ3.1で得た12,000xgで4°Cで15分間用いた。
    4. 上清(S2)を除去し、これは可溶性の細胞分画である。
    5. ステップ3.1.3で得られたペレット(P2)を再懸濁し、リサスペンション緩衝液中の粗シナプトソーム分画である。
      注:再懸濁液の量は、開始組織の量と得られるペレットの量に依存します。例えば、150〜300mgの脳組織で始まる場合、得られたペレットを200μLの再懸濁液バッファーに再懸濁させることができる。
    6. 0.85-1.0-1.2 Mショ糖の等しい量で作られた不連続なスクロース勾配に再懸濁された粗シナプトソームをロードします。
      注:我々は通常、スクロース溶液のそれぞれ1 mLを使用します (150-300 mgの組織のために).これは、より大きな組織量に応じて変更することができます。不連続勾配は、超遠心チューブの内壁に押し付けられた25Gシリンジとショ糖層の優しい層を使用して作ることができます。
    7. 遠心分離機は4°Cで2時間85,000xgで。
      注:遠心分離の高速のため、加熱を減らすために真空を作成することができる超遠心分離機が必要です。
    8. 200 μL のピペットチップを使用して、1.0 M と 1.2 M のスクロースの間のインターフェイスでシナプトソーム分画を収集します。
    9. シナプトソーム分率を氷冷洗浄バッファーで18,000 x gで10分間4°Cで10分間洗浄します。
      注:洗浄のために、1.0および1.2 Mのスクロースの界面で得られたシナプトソーム分画を新鮮な1.5mLチューブに集め、等量の洗浄バッファーを加え、培地から高いショ糖の除去を確実にする。
    10. シナプトソームペレットを、氷冷均質化バッファーで12,000 gで4°Cで10分間再度洗浄します。
    11. シナプトソームを氷上の均質化バッファーに再懸濁します。
      注: プロトコルはここで一時停止することができます。
    12. ブラッドフォードアッセイを用いてタンパク質濃度を決定します。
    13. 50 μLの体積で2〜3mgのタンパク質/mLの濃度でクレブスバッファー内のシナプトソームを再中断する (シナプトソームが KCl によって脱分極化する場合は 47.5 μL; セクション 4 を参照)。
      注意:再懸濁のために、シナプトソーム分画は、最初に4°Cで5分間12,000 x gで紡球され、上清(緩衝液)が除去されます。シナプトソームペレットは、200 μL ピペットチップを使用して穏やかなピペッティングを行い、クレブスバッファーに再懸濁します。
    14. 脱分極を進めます(セクション4)。
  2. シナプトニューロソームの調製
    注:シナプトニューロソーム用の代替プロトコル34、35も使用できます。
    1. 1 mL シリンジを使用して、フィルターホルダーに 100 μm の細孔径のあらかじめ湿ったネットフィルターを通して脳ホモジネートを通過させます。
      注:すべてのフィルタの事前湿潤は、サンプルの損失を避けるために重要であり、均質化バッファを使用して行う必要があります。このために、ホモジナイゼーションバッファーは、バッファーが流出するまで1 mLシリンジを使用してフィルタホルダ内のフィルタを通過する。
    2. 氷の上に冷やされた1.5 mLチューブに濾液(F1)を集める。
    3. F1 分数に対して手順 (ステップ 3.2.1 および 3.2.2) を繰り返して、2 番目の濾過液 (F2) を取得します。
    4. 5 μmの細孔サイズのネットフィルターを通してF2の濾液を渡す。
    5. 氷の上に冷やされた1.5 mLチューブに濾液(F3)を集める。
    6. 遠心分離機はF3を1,500 x gで4°Cで10分間濾液する。
    7. 50 μLの体積で2〜3mgのタンパク質/mLの濃度で氷上のクレブスバッファー中のペレット(シナプトニューロソーム)を再懸濁する(シナプトソームがKClによって脱分極される場合は47.5 μL;セクション4参照)。
      注: プロトコルはここで一時停止することができます。
    8. ブラッドフォードアッセイを使用してタンパク質濃度を推定します。
    9. 脱分極を進めます(セクション4)。

4. 分離シナプス末端のKCl媒介脱分極化

  1. シナプトソーム/シナプトニューロソームを37°Cで5〜10分間平衡化する。
  2. 37 °Cで30 sの細胞外K+ を50mMに増加させ、それぞれの非刺激制御セットに等量のクレブスバッファーを加えるためにKClを加えることによってシナプトソーム/シナプトニューロソームを刺激する。
    注:例えば、クレブスバッファの47.5 μLに再中断されたシナプトソームに1 M KClの2.5 μLを追加します。各非刺激制御シナプトソームに2.5μLのクレブスバッファーを加えます。多数のサンプルが関与する実験では、脱分極時間が30sを超えないように、一度に2個以下のサンプルを使用して進めます。
  3. グルタルアルデヒド(セクション5)を添加して刺激を終了する。

5. 試料の固定とファロイジン染色

  1. 室温で2〜3分間の最終濃度2.5%にホモゲネート/シナプトソーム/シナプトニューロソームサンプルにグルタルアルデヒドを加えます。
    注:50μLサンプル(ホモジネート/シナプトソーム/シナプトニューロソーム)中のグルタルアルデヒドの最終濃度が2.5%になるように、25%グルタルアルデヒド溶液の6 μLを添加しました。固定は重要であり、速く、グルタルアルデヒドを添加した直後に、サンプルは激しく渦を流す必要があります。
  2. サンプルを20,000 x gで5分間沈めます。
  3. 上清を取り除く。
    注:グルタルアルデヒドが有毒であるため、ヒュームフードに上清を捨てます。
  4. 0.1%トリトンX-100と1 mg/mL NaHB4 を含むクレブスバッファーの100 μLで室温で2〜3分間再懸濁してペレットを透過させます。
  5. サンプルを20,000 x gで5分間沈めます。
  6. パーメビル化バッファーを取り外します。
  7. ペレットを200 μLのクレブスバッファーで200 μLで洗浄し、20,000 x g で 5 分間遠心分離します。
  8. クレブスバッファーの100 μLで1x Alexa Fluor 647ファロビン(500 μUに対応)でペレットを再中断して、室温で暗く10分間染色します。
    注:他の種類の蛍光ファロイジンアナログは市販されており、アッセイ用に交換することができます。ファロイジンの濃度およびインキュベーションの総サンプル量は、検査対象の組織/サンプルの量と種類に応じて変更する必要があり、それに応じて最適な条件を標準化する必要があります。
  9. 5分間20,000 x gで染色したサンプルを遠心分離します。
  10. 非結合ファロイジン(上清)を取り除きます。
  11. 200μLのクレブスバッファーでサンプルを20,000 x gで5分間遠心して洗浄します。
  12. 0.32 Mショ糖を含むクレブスバッファの200 μLで再中断します。
    注: プロトコルはここで一時停止することができます。

6. 蛍光分析と光散乱

  1. 黒い96ウェルの版でアレクサのFluor 647ファロジン染色されたサンプルを分配する。
  2. 室温でプレートリーダーで645nmの励起波長と発光波長670nmの蛍光強度を測定します。
  3. 200 μL ピペットチップを使用して、黒色の 96 ウェルプレートから透明な 96 ウェルプレートにサンプルを移します。
  4. 540 nmで光散乱を測定し、固定、透過、染色の前のステップで発生した損失を修正します。
    注: 染色されたサンプルに保持される生物材料の変動は、少量の開始物質の場合より顕著である可能性があります(説明を参照)。
  5. 異なる濃度(0.05x、0.1x、0.25x、0.35x、0.75x、0.5xおよび1x)の異なる濃度のクレブスバッファーにAlexa Fluor 647ファロイジンのセットを標準として含める。
    注:これはオプションのステップであり、特にF-アクチンレベルが相対的な方法で発現されている場合(セクション7)のアッセイの結果には影響しません。プロトコルはここで一時停止することができます。

7. データ分析

  1. 試料中のF-アクチンの量は、結合ファロイジンの蛍光強度に直接比例する。タグ付きファロイジン標準の直線曲線から計算されたファロイジン結合の単位の絶対換算での発現。
    注: 例として、図 2A-B、3A、4A-B および補助図 2を参照してください。
  2. コントロールサンプルの一部としてF-アクチンレベルを発現する。
    注: 例として、 図 5A-Bを参照してください。

結果

F-アクチンレベル評価のためのアッセイの直線性
まず、Alexa Fluor 647ファロイジンの蛍光の線形上昇に対する標準曲線を確認し、実験の各セットについて繰り返し行った(図1)。アッセイの線形範囲を調べるため、げっ歯類とは異なる量の脳均質(図2Aおよび2B)および事後ヒト被験者(図3Aおよび3B)が?...

ディスカッション

ここで説明するアッセイは、本質的に改変を伴う以前の研究30から適応し、ファロトキシン、ファロイジンを蛍光標識でタグ付けして採用する。蛍光ファロイジンアナログは、固定組織47、48、49におけるアクチンフィラメントの染色に関するゴールドスタンダードであると考えられている。実際、それら?...

開示事項

著者らは開示するものは何もない。

謝辞

この研究は、ニュージーランド神経学財団(1835-PG)、ニュージーランド保健研究評議会(#16-597)、ニュージーランドのオタゴ大学解剖学学科によって支援されました。私たちは、人間の脳組織のためのHCB-IDIBAPSバイオバンク(スペイン)の神経組織銀行にお世話になっています。私たちは、ビデオの記録と編集で彼女の助けをしてくれたジアシアン・ザンに感謝します。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
3.5 mL, open-top thickwall polycarbonate tubeBeckman Coulter349622For gradient centrifugation (synaptosome prep)
Alexa Fluor 647 PhalloidinThermo Fisher ScientificA22287F-actin specific ligand
Antibody against  b-actinSanta Cruz BiotechnologySc-47778For evaluation of total actin levels by immunoblotting
Antibody against GAPDHAbcamAb181602For evaluation of GAPDH levels by immunoblotting
Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent ConcentrateBio-Rad5000006Bradford based protein estimation
Calcium chloride dihydrate (CaCl2·2H2O)Sigma-AldrichC3306Krebs buffer component
cOmplete, Mini, EDTA-free Protease Inhibitor CocktailSigma-Aldrich4693159001For inhibition of endogenous protease activity during sample preparation
Corning 96-well Clear Flat Bottom PolystyreneCorning3596For light-scattering measurements
D-(+)-GlucoseSigma-AldrichG8270Krebs buffer component
Dimethyl sulfoxideSigma-AldrichD5879Solvent for phalloidin and latrunculin A
Fluorescent flatbed scanner (Odyssey Infrared Scanner)Li-Cor BiosciencesFor detection of immunoreactive signals on immunoblots
Glutaraldehyde solution (25% in water) Grade IISigma-AldrichG6257Fixative
HEPESSigma-AldrichH3375Buffer ingredient for sample preparation and Krebs buffer component
Latrunculin ASigma-AldrichL5163Depolymerizer of actin filaments
Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2·6H2O)Sigma-AldrichM2670Krebs buffer component
Microplates
Mitex membrane filter 5 mmMilliporeLSWP01300Preparation of synaptoneurosomes
Nunc F96 MicroWell Black PlateThermo Fisher Scientific237105For fluorometric measurements
Nylon net filter 100 mmMilliporeNY1H02500Preparation of synaptoneurosomes
Phosphatase Inhibitor Cocktail IVAbcamab201115For inhibition of endogenous phosphatase activity during sample preparation
Potassium chloride (KCl)Sigma-AldrichP9541Krebs buffer component and for depolarization of synaptic terminals
Potassium phosphate monobasic ((KH2PO4)Sigma-AldrichP9791Krebs buffer component
Sodium borohydride (NaBH4)Sigma-Aldrich71320Component of Permeabilization buffer
Sodium chloride (NaCl)LabServ (Thermo Fisher Scientific)BSPSL944Krebs buffer component
Sodium hydrogen carbonate (NaHCO3)LabServ (Thermo Fisher Scientific)BSPSL900Krebs buffer component
SpectraMax i3xMolecular DevicesFor fluorometric measurements
SucroseFisher ChemicalS/8600/60Buffer ingredient for sample preparation
Swimnex Filter HolderMilliporeSx0001300Preparation of synaptoneurosomes
Tissue grinder 5 mL Potter-ElvehjemDuran Wheaton Kimble358034For tissue homogenization
Triton X-100Sigma-AldrichX100Component of Permeabilization buffer
Trizma baseSigma-AldrichT6066Buffer ingredient for sample preparation

参考文献

  1. Penzes, P., Rafalovich, I. Regulation of the actin cytoskeleton in dendritic spines. Advances in Experimental Medicine and Biology. 970, 81-95 (2012).
  2. Venkatesh, K., Mathew, A., Koushika, S. P. Role of actin in organelle trafficking in neurons. Cytoskeleton. 77 (3-4), 97-109 (2020).
  3. Shirao, T., González-Billault, C. Actin filaments and microtubules in dendritic spines. Journal of Neurochemistry. 126 (2), 155-164 (2013).
  4. Bertling, E., Hotulainen, P. New waves in dendritic spine actin cytoskeleton: From branches and bundles to rings, from actin binding proteins to post-translational modifications. Molecular and Cellular Neuroscience. 84, 77-84 (2017).
  5. Bellot, A., et al. The structure and function of actin cytoskeleton in mature glutamatergic dendritic spines. Brain Research. 1573, 1-16 (2014).
  6. Wolf, M., et al. ADF/Cofilin controls synaptic actin dynamics and regulates synaptic vesicle mobilization and exocytosis. Cerebral Cortex. 25 (9), 2863-2875 (2015).
  7. Morales, M., Colicos, M. A., Goda, Y. Actin-dependent regulation of neurotransmitter release at central synapses. Neuron. 27 (3), 539-550 (2000).
  8. Doussau, F., Augustine, G. J. The actin cytoskeleton and neurotransmitter release: An overview. Biochimie. 82 (4), 353-363 (2000).
  9. Sakaba, T., Neher, E. Involvement of actin polymerization in vesicle recruitment at the calyx of held synapse. Journal of Neuroscience. , (2003).
  10. Lee, J. S., Ho, W. K., Lee, S. H. Actin-dependent rapid recruitment of reluctant synaptic vesicles into a fast-releasing vesicle pool. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , (2012).
  11. Rust, M. B., et al. Learning, AMPA receptor mobility and synaptic plasticity depend on n-cofilin-mediated actin dynamics. EMBO Journal. 29, 1889-1902 (2010).
  12. Bosch, M., et al. Structural and molecular remodeling of dendritic spine substructures during long-term potentiation. Neuron. 82, 444-459 (2014).
  13. Hanley, J. G. Actin-dependent mechanisms in AMPA receptor trafficking. Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 381 (2014).
  14. Kasai, H., Fukuda, M., Watanabe, S., Hayashi-Takagi, A., Noguchi, J. Structural dynamics of dendritic spines in memory and cognition. Trends in Neurosciences. 33, 121-129 (2010).
  15. Terman, J. R., Kashina, A. Post-translational modification and regulation of actin. Current Opinion in Cell Biology. 25 (1), 30-38 (2013).
  16. Wilson, C., Terman, J. R., González-Billault, C., Ahmed, G. Actin filaments-A target for redox regulation. Cytoskeleton. 73, 577-595 (2016).
  17. Borovac, J., Bosch, M., Okamoto, K. Regulation of actin dynamics during structural plasticity of dendritic spines: Signaling messengers and actin-binding proteins. Molecular and Cellular Neuroscience. 91, 122-130 (2018).
  18. Saneyoshi, T., Hayashi, Y. The Ca2+ and Rho GTPase signaling pathways underlying activity-dependent actin remodeling at dendritic spines. Cytoskeleton. 69 (8), 545-554 (2012).
  19. Mizuno, K. Signaling mechanisms and functional roles of cofilin phosphorylation and dephosphorylation. Cellular Signalling. 25 (2), 457-469 (2013).
  20. Dos Remedios, C. G., et al. Actin binding proteins: Regulation of cytoskeletal microfilaments. Physiological Reviews. 83 (2), 433-473 (2003).
  21. Bamburg, J. R., Bernstein, B. W. Actin dynamics and cofilin-actin rods in Alzheimer disease. Cytoskeleton. 73 (9), 477-497 (2016).
  22. Penzes, P., VanLeeuwen, J. E. Impaired regulation of synaptic actin cytoskeleton in Alzheimer's disease. Brain Research Reviews. 67 (1-2), 184-192 (2011).
  23. Pelucchi, S., Stringhi, R., Marcello, E. Dendritic spines in Alzheimer's disease: How the actin cytoskeleton contributes to synaptic failure. International Journal of Molecular Sciences. 21 (3), 908 (2020).
  24. Kounakis, K., Tavernarakis, N. The Cytoskeleton as a Modulator of Aging and Neurodegeneration. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1178, 227-245 (2019).
  25. Nishiyama, J. Plasticity of dendritic spines: Molecular function and dysfunction in neurodevelopmental disorders. Psychiatry and Clinical Neurosciences. 73 (9), 541-550 (2019).
  26. Michaelsen-Preusse, K., Feuge, J., Korte, M. Imbalance of synaptic actin dynamics as a key to fragile X syndrome. Journal of Physiology. 596 (14), 2773-2782 (2018).
  27. Hensel, N., Claus, P. The Actin Cytoskeleton in SMA and ALS: How Does It Contribute to Motoneuron Degeneration. Neuroscientist. 24 (1), 54-72 (2018).
  28. Kommaddi, R. P., et al. Aβ mediates F-actin disassembly in dendritic spines leading to cognitive deficits in alzheimer's disease. Journal of Neuroscience. 38 (5), 1085-1099 (2018).
  29. Kommaddi, R. P., et al. Glutaredoxin1 Diminishes Amyloid Beta-Mediated Oxidation of F-Actin and Reverses Cognitive Deficits in an Alzheimer's Disease Mouse Model. Antioxidants and Redox Signaling. 31 (18), 1321-1338 (2019).
  30. Bernstein, B. W., Bamburg, J. R. Cycling of actin assembly in synaptosomes and neurotransmitter release. Neuron. 3 (2), 257-265 (1989).
  31. Sapan, C. V., Lundblad, R. L., Price, N. C. Colorimetric protein assay techniques. Biotechnology and applied biochemistry. 29 (2), 99-108 (1999).
  32. Kolodziej, A., et al. High resolution quantitative synaptic proteome profiling of mouse brain regions after auditory discrimination learning. Journal of Visualized Experiments. (118), e54992 (2016).
  33. Byun, Y. G., Chung, W. S. A novel in vitro live-imaging assay of astrocyte-mediated phagocytosis using pH indicator-conjugated synaptosomes. Journal of Visualized Experiments. (132), e56647 (2018).
  34. Chmielewska, J. J., Kuzniewska, B., Milek, J., Urbanska, K., Dziembowska, M. Neuroligin 1, 2, and 3 Regulation at the Synapse: FMRP-Dependent Translation and Activity-Induced Proteolytic Cleavage. Molecular Neurobiology. 56 (4), 2741-2759 (2019).
  35. Kuzniewska, B., Chojnacka, M., Milek, J., Dziembowska, M. Preparation of polysomal fractions from mouse brain synaptoneurosomes and analysis of polysomal-bound mRNAs. Journal of Neuroscience Methods. 293, 226-233 (2018).
  36. Fischer, M., Kaech, S., Knutti, D., Matus, A. Rapid actin-based plasticity in dendritic spines. Neuron. 20 (5), 847-854 (1998).
  37. Caesar, M., Felk, S., Aasly, J. O., Gillardon, F. Changes in actin dynamics and F-actin structure both in synaptoneurosomes of LRRK2(R1441G) mutant mice and in primary human fibroblasts of LRRK2(G2019S) mutation carriers. Neuroscience. 284, 311-324 (2015).
  38. Star, E. N., Kwiatkowski, D. J., Murthy, V. N. Rapid turnover of actin in dendritic spines and its regulation by activity. Nature Neuroscience. 5, 239-246 (2002).
  39. Okamoto, K. I., Nagai, T., Miyawaki, A., Hayashi, Y. Rapid and persistent modulation of actin dynamics regulates postsynaptic reorganization underlying bidirectional plasticity. Nature Neuroscience. 7, 1104-1112 (2004).
  40. Bernstein, B. W., Dewit, M., Bamburg, J. R. Actin disassembles reversibly during electrically induced recycling of synaptic vesicles in cultured neurons. Molecular Brain Research. 53 (1-2), 236-250 (1998).
  41. Ahmad, F., Liu, P. Synaptosome as a tool in Alzheimer's disease research. Brain Research. 1746, 147009 (2020).
  42. Ahmad, F., et al. Isoform-specific hyperactivation of calpain-2 occurs presymptomatically at the synapse in Alzheimer's disease mice and correlates with memory deficits in human subjects. Scientific Reports. 8 (1), 13119 (2018).
  43. Ahmad, F., et al. Reactive Oxygen Species-Mediated Loss of Synaptic Akt1 Signaling Leads to Deficient Activity-Dependent Protein Translation Early in Alzheimer's Disease. Antioxidants and Redox Signaling. 27 (16), 1269-1280 (2017).
  44. Ahmad, F., et al. Developmental lead (Pb)-induced deficits in redox and bioenergetic status of cerebellar synapses are ameliorated by ascorbate supplementation. Toxicology. 440, 152492 (2020).
  45. Ahmad, F., Salahuddin, M., Alsamman, K., Herzallah, H. K., Al-Otaibi, S. T. Neonatal maternal deprivation impairs localized de novo activity-induced protein translation at the synapse in the rat hippocampus. Bioscience Reports. 38 (3), 0118 (2018).
  46. Ahmad, F., Salahuddin, M., Alsamman, K., Almulla, A. A., Salama, K. F. Developmental lead (Pb)-induced deficits in hippocampal protein translation at the synapses are ameliorated by ascorbate supplementation. Neuropsychiatric Disease and Treatment. 14, 3289-3298 (2018).
  47. Melak, M., Plessner, M., Grosse, R. Actin visualization at a glance. Journal of Cell Science. 130 (3), 525-530 (2017).
  48. Adams, A. E. M., Pringle, J. R. Staining of actin with fluorochrome-conjugated phalloidin. Methods in Enzymology. 194, 729-731 (1991).
  49. Belin, B. J., Goins, L. M., Mullins, R. D. Comparative analysis of tools for live cell imaging of actin network architecture. BioArchitecture. 4 (6), 189-202 (2014).
  50. Wulf, E., Deboben, A., Bautz, F. A., Faulstich, H., Wieland, T. Fluorescent phallotoxin, a tool for the visualization of cellular actin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76, 4498-4502 (1979).
  51. Taffarel, M., de Souza, M. F., Machado, R. D., de Souza, W. Localization of actin in the electrocyte of Electrophorus electricus L. Cell and Tissue Research. 242, 453-455 (1985).
  52. Glebov, O. O. Distinct molecular mechanisms control levels of synaptic F-actin. Cell Biology International. 44 (1), 336-342 (2020).
  53. Dancker, P., Löw, I., Hasselbach, W., Wieland, T. Interaction of actin with phalloidin:. Polymerization and stabilization of F-actin. BBA - Protein Structure. , (1975).
  54. Lengsfeld, A. M., Löw, I., Wieland, T., Dancker, P., Hasselbach, W. Interaction of phalloidin with actin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 71 (7), 2803-2807 (1974).
  55. Coluccio, L. M., Tilney, L. G. Phalloidin enhances actin assembly by preventing monomer dissociation. Journal of Cell Biology. 99, 529-535 (1984).
  56. Colicos, M. A., Collins, B. E., Sailor, M. J., Goda, Y. Remodeling of synaptic actin induced by photoconductive stimulation. Cell. 107 (5), 605-616 (2001).
  57. Lemieux, M. G., et al. Visualization of the actin cytoskeleton: Different F-actin-binding probes tell different stories. Cytoskeleton. 71, 157-169 (2014).
  58. Bubb, M. R., Senderowicz, A. M. J., Sausville, E. A., Duncan, K. L. K., Korn, E. D. Jasplakinolide, a cytotoxic natural product, induces actin polymerization and competitively inhibits the binding of phalloidin to F-actin. Journal of Biological Chemistry. , (1994).
  59. Holzinger, A. Jasplakinolide: an actin-specific reagent that promotes actin polymerization. Methods in molecular biology. 269, 14869-14871 (2009).

転載および許可

このJoVE論文のテキスト又は図を再利用するための許可を申請します

許可を申請

さらに記事を探す

172 F A

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

個人情報保護方針

利用規約

一般データ保護規則

お問い合わせ

図書館への推薦

JoVE ニュースレター

研究

教育

著者

図書館員

JoVEについて

Copyright © 2023 MyJoVE Corporation. All rights reserved