流れの下で標的とする血管薬を研究するためのin Vitro 3D細胞培養動脈モデル

要約

ここでは、生理学的流れの下で作製された実大の三次元ヒト動脈モデルにおける内皮細胞への薬物キャリアの標的堆積を研究し、マッピングするための新しいプロトコルを提示する。提示された方法は、血管系内の薬剤キャリアを標的とする新しいプラットフォームとして役立つ可能性がある。

要約

正しい次元および解剖学と設計されている人の動脈の三次元(3D)モデルの使用は、心血管系の様々な重要なプロセスの適切なモデル化を可能にする。近年、ヒト動脈の3Dモデルを用いていくつかの生物学的研究が行われているが、それらは血管標的化の研究には適用されていない。本論文では、3Dプリンティング技術を用いて、実際の大きさの再構築されたヒト動脈モデルを作製し、ヒト内皮細胞(IC)と一致させ、生理的流れ下での粒子ターゲティングを研究する新しい方法を提示する。これらのモデルは、低コストの成分を使用して、人体の血管の生理学的サイズと条件を複製する利点を有する。この技術は、心血管系における薬物標的化を研究し、理解するための新しいプラットフォームとして役立ち、新しい注射可能なナノ医薬品の設計を改善するかもしれない。さらに、提示されたアプローチは、患者固有の流れおよび生理学的条件下での心血管疾患に対する異なる薬剤の標的送達の研究のための重要なツールを提供し得る。

概要

最近、ヒト動脈^{1、2、3、4、5}の3Dモデルを利用して、いくつかのアプローチが適用されている。これらのモデルは、生体内の人体における異なる動脈の生理学的解剖学および環境を複製する。しかし、それらは主に細胞生物学の研究で使用されています。内皮への粒子の血管標的化に関する現在の研究は、インビトロマイクロ流体モデル^{9、10、11、}および生体内動物モデル¹²におけるインビリコ計算シミュレーション^6、7、8に含まれる。彼らが提供した洞察にもかかわらず、これらの実験モデルは、血流と血行力学が支配的な要因を構成するヒト動脈で起こる標的化プロセスを正確にシミュレートすることができなかった。例えば、複雑な再循環流れパターンと壁せん断応力勾配で知られる頸動脈分岐におけるアテローム硬化領域への粒子標的化の研究は、粒子が内皮^{13、14、15、16}に到達する前に粒子が取った旅に影響を与える可能性がある。したがって、これらの研究は、生理的環境、すなわち、サイズ、寸法、解剖学、およびフロープロファイルを複製する条件下で行われなければならない。

近年、この研究グループは、3D再構成されたヒト動脈モデルを作製し、血管系¹⁷に対する粒子の堆積および標的化を研究した。モデルは人間の血管の幾何学的な3Dレプリカに基づいており、その後、内壁に並ぶヒトICで培養された。また、生理的な流れを生み出す灌流系を施した場合、モデルは正確に生理的条件を複製した。この灌流システムは、閉回路構成と開放回路構成の両方で蠕動ポンプを使用して、一定の流速で流体を透過するように設計された(図1)。このシステムは、粒子の堆積とターゲットを頸動脈モデルの内側に播種したセルにマッピングするための閉回路として使用できます。また、実験終了時に非付着粒子を洗い流し、システムを洗浄・維持するための開放回路として使用できます。本論文では、ヒト頸動脈分岐の3Dモデルの製作、灌流システムの設計、モデル内の標的粒子の堆積のマッピングに関するプロトコルを紹介する。

プロトコル

注: このプロトコルは、頸動脈の 3D モデルの製造を記述し、単に幾何学的パラメータを変更するだけで、関心のある他の動脈を生成するために適用することができます。

1. ヒト頸動脈モデルの3D分岐の設計と製作

1. 患者またはヒト頸動脈分岐の以前に研究された幾何学から画像を選択し、印刷する必要がある金型のコンピュータ支援設計モデルを作成します。
   注意:頸動脈分岐には1つの入口と2つの出口があります。フレームと動脈型の間の動脈と一時的な印刷サポートの周囲に3Dモールドフレームを設計することが重要です(図2A-C)。
2. 3D プリンタを使用してジオメトリを印刷します。一時的な印刷サポートをカットし、特にサポートが切断された領域で、金型を研磨し、滑らかにするためにサンドペーパーを使用しています。プラスチックダストを除去するためにイソプロピルアルコールでサンドモデルをリンスし、2〜3時間の化学フードで完全に乾燥させます。
   注:ここでは、印刷された金型は、クリア樹脂v4(図2D、E)で作られました。
3. プラスチックを簡単に溶解するには、化学フードの内側に透明なラッカーで金型をスプレーし、1時間空気乾燥させます。この3倍を繰り返します。
   注:ここでは 、2Xウルトラカバークリアスプレー が使用されましたが、木材ラッカーでない限り、他の種類は適しているはずです。プラスチックがシリコーンと反応して固化を防止する可能性があるため、露出したプラスチックが残っていないか確認してください。スプレーされた表面の品質は、最終的なシリコーンモデルの表面の品質を決定します。
4. 金型フレームと同じ寸法の滑らかなプラスチックの透明な長方形のスライド/ストリップをカットし、ラッカーを使用して、すべての側面のフレームとフレームの片側から接着し、下部に密封して上部に開きます。化学フードの中にペイントブラシを使用してラッカーを塗布し、スライドが少なくとも24時間完全に乾燥するようにします(図2F)。
5. シリコーンゴム混合物を調製するには、プラスチック板に硬化剤(質量比1:10)を含む液体シリコーンを加え、完全に混合するために十分に攪拌します。頸動脈モデルの場合、シリコーンの54 gと6gの硬化剤を加えます。
6. 4°Cで15分間冷却し、すべての気泡が除去されるまで真空デシケーターで脱気します。デシケータに金型を置き(開いた側を上にして)、ゆっくりとシリコーン混合物を金型に注ぎ、混合物が透明になるまで再び気泡を取り除きます。
7. 金型は室温で一晩シリコーンと一緒に立たせます(可能であれば、真空なしでデシケータに入れます)。混合物が完全に乾燥していない場合は、さらに数時間60°Cでインキュベートする。
8. 混合物が完全に乾燥したら、透明なスライドを取り除き、プラスチックが完全に溶解するまで化学フードに48時間の絶対アセトンでモデルを浸します。木製のスティックでプラスチック製の残り物を取り除きます。モデル内に閉じ込められたアセトンを蒸発させるには、細胞播種前の少なくとも4日間60°Cでインキュベートする。

2. 細胞培養とモデルの播種

1. 頸動脈モデル用の 3 つのコネクタを準備します( 入口用と出口用のコネクタ 2 つ) ( 材料表を参照)。20分間、生物フードに紫外線を照射してモデルとコネクタを滅菌します。
2. モデルに100 μg/mLフィブロネクチン(1xリン酸緩衝生理食塩分、(PBS))を4 mLで37°Cで2時間、または4°Cで一晩コーティングします。 フィブロネクチン溶液を5または10mLのプラスチック注射器を使用して、注入口を通してモデルに注入します。フィブロネクチンを出口から取り出し、EC培地でモデルを洗浄する。
3. 2.5×10^個の6 細胞/mLヒト臍静脈内皮細胞(HUVEC、<6)を懸濁し、5または10mLのプラスチック注射器を使用して4mLの細胞懸濁液でモデルを充填する(図3A)。モデルをインキュベーター(37°C)内の回転子に1rpmの速度で48時間置き、均質な播種を確保します。モデルが回転子に適切に取り付けられていることを確認します(図3B)。生物学的フードの内部で24時間後に培地を交換し、さらに24時間インキュベーターの内側のローテーターに戻す。
   注:24時間後、細胞は播種され、顕微鏡を使用して画像化することができます。
4. 回転子からモデルを取り外し、10 mLプラスチックシリンジを使用して1x PBSで洗浄します。細胞を固定するには、4%パラホルムアルデヒド(PFA)の4 mLで細胞を化学フードの中で15分間モデルにインキュベートし、PBSで3倍のリンスを行います。4 mLのPBSを加え、実験まで4°Cで保存します(図3C)。標準的な染色プロトコルを使用してモデル内の細胞を染色する(例えば、4′、6-ジミジノ-2-フェニリンドール(DAPI)による核染色、図3D)。

3. 灌流システムの設計

1. この灌流システムには、2つの入口と2つの出口管があります。2つの入り江を単一の4 mm IDチューブにマージし、再び蠕動ポンプに接続する2つの6 mm IDチューブに結合します。蠕動ポンプから出てくる2つの6 mm IDチューブを単一の4mmチューブに結合し、振動ダンパーに接続してポンプからの振動を除去します。ダンパーとして3オリフィス蓋を持つ250 mLの口の狭いボトルを使用してください。
2. ポンプから入口に1つのオリフィスを接続し、緊急時に通気にする圧力に使用されるコルクで2番目のオリフィスを閉じ、3番目のオリフィス(出口)をボトルの底まで伸ばします。
3. 出口管を使用して、培養された頸動脈モデルの入口にダンパーを接続します。モデルの 2 つのコンセントを 1 つのチューブにマージします(これはシステムの出口になります(すべてのチューブは4 mm IDです)。
4. 出口管を2つの出口管(1つは閉回路用、もう1つはオープン回路の廃棄物容器用)に分割します。各チューブにプラスチック製のクランプを取り付けます。
   メモ:開閉クランプの組み合わせにより、システムが閉回路構成か開回路構成かを決定します。 図1に示すように、bとcが開いている間にクランプaとdが近い場合、システムは閉回路です。逆にシステムを開放回路構成にします。
5. 3つの容器を準備する:300 mLの液体(閉回路用)と1 Lの他の2つの他の2つの容器:洗浄用と廃棄物用(開回路用)用。

4. 閉回路構成:灌流実験とイメージング

1. 閉回路容器に300 mLのPBSを加え、チューブやモデルを含むシステム全体を充填するのに十分です。入口チューブ1つと出口チューブ(開いたクランプbとc)を容器の中に入れます。
2. 1L洗浄容器に蒸留水(実験終了時の洗浄用)を充填し、残して他の1L廃棄物容器を空にしておきます。他の入口と出口チューブ(クランプを閉じるaとd)を洗浄容器と廃液容器にそれぞれ入れます。
3. 4°Cの貯蔵から固定細胞培養頸動脈モデルを取り出し、PBSを空にする。手順 3.3 ~3.4 で説明されているように、頸動脈の入口と出口を接続します。モデルを長時間乾燥させたままにしないでください。モデルが接続されたら、ポンプをアクティブにして流体を浸透させます。
4. 頸動脈モデルを顕微鏡の下に置きます。入口の前と頸動脈モデルの出口の後にチューブを開きます。蠕動ポンプを10rpmにセットし、電源を入れます。速度を5 rpm、4~5分ごとに増加させます。漏れがないことを確認してください。
5. 100rpmでは、ヒト頸動脈の生理学的波形の最大流量(約400mL/min)に相当し、閉回路容器内の300mLのPBSに蛍光カルボキシ化ポリスチレン(PS)粒子(2μm、1.6μg/mLの濃度)を加える。1.5 時間(必要に応じて単一の画像またはビデオ)の 10 s ごとに対象領域をイメージします。

5. オープン回路構成:洗浄工程

1. 洗浄管と廃チューブのクランプを1L容器(クランプaおよびd)に開き、300 mLコンテナ(クランプbおよびc)の入口と出口管の両方のクランプを直ちに閉じて、閉回路から開閉回路構成にシステムを変更します。
2. 水の大部分を洗浄容器から廃棄物容器に100rpmで流す。それが完全に移る前に、蠕動ポンプを止め、入口の前および頸動脈モデルの出口の後に管クランプを閉じる。
3. 適切なフィルタを使用して、対象領域でモデルの画像をキャプチャし、細胞への粒子の堆積および接着を示す。頸動脈モデルを取り外します。慎重かつゆっくりとモデルの入口を通して10 mLの注射器でPBSの4 mLを加えます。
4. 頸動脈モデルの代わりに「ダミーモデル」(洗い物専用のシリコーンゴム3D頸動脈モデル)を接続し、システムをすすいでください。さらに1Lの水を加え、すべての水が洗浄容器から廃棄物に移るまでシステムを再び洗います。蠕動ポンプをオフにします。

6. データの取得と分析

1. カスタマイズされたソフトウェア コードを使用して、実験中に撮影した画像を使用して、対象領域でのパーティクル堆積のデジタル ムービーを取得します ( 材料表を参照)。
2. モデルに沿ったパーティクルのデポジションのマッピングについては、複数の画像をタイル表示して、対象の調査対象領域を覆います (図4A,B)。
   注: カスタマイズされたソフトウェア コードを記述して、対象のサイトでの被着パーティクルの数を数値化できます (サンプル ファイルは 補足情報として提供されています)¹⁷。

結果

本論文は、実際の大きさの3Dヒト動脈モデル内の粒子の堆積をマッピングする新しいプロトコルを提示し、薬物送達研究のための新しいプラットフォームを提供する可能性がある。3D印刷技術を用いて、動脈のヒト頸動脈分岐のモデルを作製した(図2)。このモデルはシリコーンゴム製で、人間のICをまいた(図3)。重要なことに、このプロトコルは、?...

ディスカッション

粒子の血管標的を研究するための現在のアプローチは、人体に存在する生理学的状態を複製するのに不足している。ここでは、カスタマイズされた灌流システムを使用して適用される生理学的流れの下で動脈を裏打ちするECに対する粒子ターゲティングを研究するために、ヒト動脈の3D再構成モデルを製造するためのプロトコルです。3D印刷用の材料を選択する場合は、透明なプラスチックを?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
3D printer	FormLabs	PKG-F2-REFURB
Acetone, absolute (AR grade)
Connectors	Nordson Medical	FTLL013-1	Female Luer
		FTLL230-1	Female Luer
		FTLL360-1	Female Luer
		LP4-1	Male Luer Integral Lock
Damper	Thermo-Fisher Scientific	DS2127-0250	Nalgene Polycarbonate, Validation Bottle
Damper Cover	Thermo-Fisher Scientific	2162-0531	Nalgene Filling/Venting Closures
Elastosil Elastosil RT 601 A	Wacker	60003805
Elastosil RT 601 B	Wacker	60003817	The crosslinker
Endothelial Cell Media	ScienCell	1001
Fibrontectin	Sigma Aldrich	F0895-5mg
HUVEC	Lonza	CC-2519
Isopropyl alcohol, AR grade 99.5%			Remove plastic dust from the sanded model
Lacquer	Rust-Oleum		2X-Ultra cover Gloss Clear
Matlab	Mathworks		https://www.mathworks.com/products/matlab.html
Microscope	Nikon	SMZ25
Microscope Camera	Nikon	DS-Qi2
Peristaltic pump	Watson Marlow	530U IP31	With 2 pumpheads: 313D
Plastic tube clamp	Quickun	1-2240-stopvalve-2pcs
Polystyrene Particles	Thermo-Fisher Scientific	F8827	Diameter = 2 µm
Printer resin	FormLabs	RS-F2-GPCL-04
Rotator	ELMI Ltd.		Intelli-Mixer RM-2
Solidworks	SolidWorks Corp., Dassault Systèmes		https://www.solidworks.com/
Tubing	Watson Marlow	933.0064.016	Tubing for the pump: 6.4 mm ID
All the other tubing: Silicon tubing: 4 mm ID