超高速フォースクランプ分光法によるミオシンのメカノ酵素的性質の解剖

要約

ここでは、処理ミオシン-5モーターで超高速フォースクランプ実験を行うための包括的なプロトコルを提示し、他のクラスのプロセスモーターの研究に簡単に拡張できます。プロトコルは、実験装置のセットアップからサンプル調製、データ収集、分析まで、必要なすべてのステップを詳述しています。

要約

超高速フォースクランプ分光法(UFFCS)は、レーザーピンセットに基づく単一分子技術であり、前例のない時間分解能で負荷がかかった状態での従来型および非従来型ミオシンの両方の化学力学の研究を可能にします。特に、アクチン-ミオシン結合形成直後に一定の力でミオシンモーターをプローブする可能性は、フォースフィードバックの高速レート(200kHz)とともに、UFFCSがミオシン作業ストロークなどの高速ダイナミクスの負荷依存性を研究するための貴重なツールであることを示しています。さらに、UFFCSは、プロセス的および非プロセス的なミオシン-アクチン相互作用が、加えられた力の強度と方向によってどのように影響を受けるかの研究を可能にします。

このプロトコルに従うことで、プロセスミオシン-5モーターやさまざまな非従来型ミオシンで超高速フォースクランプ実験を行うことが可能になります。いくつかの調整により、プロトコルは、キネシンやダイニンなどの他のクラスの処理モーターの研究にも簡単に拡張できます。プロトコルには、実験装置のセットアップからサンプル調製、校正手順、データ取得、分析まで、必要なすべてのステップが含まれています。

概要

過去数十年にわたり、光ピンセットは、立体構造変化と酵素速度論の同時操作と測定の顕著な可能性により、単一分子レベルでタンパク質相互作用のメカノケミストリーを解明するための貴重なツールでした^1,2。特に、細胞内の分子モーターが及ぼす力の範囲の力を適用および測定する能力と、サブナノメートルの構造変化を測定する能力により、光ピンセットは、モータータンパク質の化学力学的特性とその機械的制御を解明するためのユニークな単一分子ツールになりました。

超高速フォースクランプ分光法(UFFCS)は、3ビーズ形状の負荷下での分子モーターの高速速度論を研究するために開発された、ピンセットに基づく単一分子力分光法です(図1a)^3,4。UFFCSは、モータータンパク質への力の加わるタイムラグを光ピンセットの物理的限界、すなわちシステムの機械的緩和時間まで短縮し、ミオシンの実行開始後(数十マイクロ秒)に迅速に力を加えることを可能にします³。この能力を利用して、高速骨格³および心臓⁵筋ミオシンの初期の機械的イベントを調査し、パワーストロークの負荷依存性、弱結合状態と強結合状態、および生化学的(Pi)および機械的(パワーストローク)イベントの順序を明らかにしました。

3ビード形状は通常、非加工モーターの研究に採用され、フォースクランプを備えた単一ビーズ形状は、ミオシン^Va6などの加工型非従来型ミオシンの研究に一般的に使用されています。ただし、プロセシブミオシンに対しても3ビーズUFFCSアッセイを好む理由はいくつかあります。第一に、アクチン-ミオシン結合直後の荷重の迅速な適用により、非プロセスモーターと同様に力発生の初期事象の測定が可能になります。さらに、処理型モータの場合、モータの走行距離と走行時間を一定の力で正確に測定することもできます(図1b)。さらに、フォースフィードバックのレートが高いため、システムはミオシン作業ストロークなどの位置の急速な変化中に力を一定に保つことができ、それによってモーターステッピング中の一定の負荷を保証します。システムの高時間分解能により、サブms相互作用の検出が可能になり、ミオシンのアクチンへの弱い結合を調査する可能性が開かれます。最後に、アッセイ形状は、力がアクチンフィラメントに沿って加えられることを保証し、力の横方向および垂直方向の成分はごくわずかです。垂直方向の力成分がモータの動力学^7,8の負荷依存性に大きく影響することが示されているので、この点は特に関連性がある。この手法を用いることで、加工ミオシン-5Bにさまざまな補助荷重と抵抗荷重を適用し、広範囲の力に対する処理能力の荷重依存性を直接測定することができました⁴。

図1aに示すように、このシステムでは、単一のアクチンフィラメントが、二重光ピンセット(「ダンベル」)の焦点に閉じ込められた2つのポリスチレンビーズの間に吊り下げられています。不均衡な正味力F = F_{1-F 2}は、高速フィードバックシステムを介してフィラメントに課され、フィラメントは、正味の力が反対方向に反転するユーザー定義の反転点に到達するまで、一方向に等速で移動します。モータータンパク質がフィラメントと相互作用していないとき、ダンベルは単一のモータータンパク質が付着している台座ビーズにまたがる三角形の波状(図1b、下のパネル)で自由に前後に動きます。相互作用が確立されると、ダンベルによって運ばれる力はモータータンパク質に非常に急速に伝達され、モーターはミオシンがアクチンから分離するまで、相互作用時にフィードバックシステムによって加えられた力の強さと方向の下でステップすることによってフィラメントを移動させ始めます。トラップされたアクチンフィラメントの極性に依存するモーターのステッピングによって生成される変位であるため、負荷は、加えられた力の方向に応じて、補助的、つまりモーター変位と同じ方向に押す(図1b上のパネルを押す)、または抵抗性、つまりモーターの変位に対して反対方向に引っ張る(図1bの引っ張り)のいずれかになります。 上パネル)は、加えられた負荷の強度と方向性の両方によって運動処理能力の化学力学的調節を研究することを可能にする。

次のセクションでは、1)光学セットアップのセットアップ、光学トラップのアライメントとキャリブレーションの手順、2)サンプルチャンバー内のすべてのコンポーネントの準備とそれらのアセンブリ、3)測定手順、 4)ランレングス、ステップサイズ、モータータンパク質の速度などの重要な物理的パラメータを抽出するための代表的なデータとデータ分析。

プロトコル

1.光学セットアップ

注意: 実験セットアップは、ナノメートルのポインティング安定性と<1%のレーザー強度変動を備えた二重光ピンセットで構成されています。これらの条件下では、典型的なトラップ剛性(0.1 pN/nm)と張力(1 pN - 数十 pN)の下で、ナノメートルレベルでのダンベルの安定性が保証されます。 図2 は、光学セットアップの詳細なスキームを示しています。

1. 光ピンセットの設計と建設 9,10,11.
   1. セットアップのすべてのコンポーネントを 、図2のスキームに従って光学テーブルに配置します。光学テーブルには、機械的振動を最小限に抑えるためのアクティブアイソレータが含まれていることに注意してください。さらに、顕微鏡構造はエラストマーアイソレータに取り付けられ、音響ノイズと機械的共振を吸収します。
   2. 光アイソレータをレーザー光源( 図2の「OI」)の近くに挿入して、光フィードバックによるランダムな振幅変動を回避します。
   3. レーザーポインティングの安定性に影響を与える可能性のある気流や乱流を減らすために、パス全体を閉じたボックスに密閉します。
   4. 偏光ビームスプリッター(PBS)を使用して、メインレーザー光源(Nd:YAGレーザー、図2の波長1,064nm)を直交偏光の 2つの分岐に分割して、二重光ピンセットを作成します。タイムシェアトラップは、張力¹²の下でダンベルの振動を誘発するため、避ける必要があります。
   5. ダイレクトデジタルシンセサイザ(DDS)によって駆動される2つの音響光学偏向器(図2のAOD)を使用して、フィールドプログラマブルゲートアレイFPGAボードからのデジタル出力を介してDDSを直接駆動することにより、2つのトラップの微細で迅速な動きとアクチン張力の正確な調整を可能にします(図2を参照)。
      注:測定中に、非結合状態、ミオシン相互作用、動きなど、両方のトラップを迅速に補正して一定の力を維持するには、全体的なフィードバック応答時間を<10μsにする必要があります。このためには、位置検出器の帯域幅は>= 100kHzで、データは>= 200kHzのサンプルレートで集録する必要があります。集録されたデータポイント(5μsのアクイジション時間)ごとに、2つのトラップの比例補正がFPGAによって計算され、AODを駆動する2つのDDSに送信されます。AODの応答時間は、必要なフィードバック応答時間を満たすために5μs未満でなければなりません。
   6. トラップされたビーズ位置をnm検出するには、コンデンサの後焦点面に2つの象限フォトダイオード検出器( 図2のQPD)を配置します。コンデンサーの後焦点面に共役した面内のQPDと、対物レンズの後方焦点面に共役した面内のAODを正確に位置合わせすることで、QPD信号がAOD周波数に依存しないことが保証されます。
   7. AODをマイクロメータドライブのリニアトランスレータに取り付け、結晶の端がレーザービームに近づくまで配置します。次に、対物レンズを螺山付き対物レンズハウジングを中心としたアイリスに交換し、対物レンズの背面開口部サイズに合わせて絞りを調整します。
   8. ピエゾ結晶によってブロックされたビームの部分がアイリスの後に見えるまでトランスレータをレーザービームに向かって動かし、トランスレータを少し後方に回して、ビームがアイリス開口部を再び完全に埋めるようにします。
   9. 2 番目の AOD に対して手順 1.1.7-1.1.8 を繰り返します。カバーガラス¹³の表面に貼り付けられたビード上のビームを急速に移動させながら、QPDからのタイムラグを測定することにより、フィードバックループの応答時間を確認します。
      注意: 上記の3つのステップ(1.1.7-1-1-9)は、AOD結晶の慎重な位置合わせにつながります。これらのステップは、ビーム偏向およびフィードバック¹³の両方の時間応答を最適化するために重要である。
2. フォトダイオードを使用して、顕微鏡入口でのトラップレーザーの強度変動を測定しますが、これは1%未満でなければなりません。フォトダイオードの帯域幅はイメージングレートよりも大きくなければならないことに注意してください。
3. 両方のトラップのポインティング安定性を確認します。
   1. 20 μLのシリカビーズ(1.2 μm、10%固形分)を1 mLのアセトンで希釈し、30秒間超音波処理し、短時間ボルテックスし、19,000 x gで2分間遠心分離することにより、リン酸緩衝液(PB)でシリカビーズを調製します。
   2. 上清を取り除き、1 mLのアセトンに再懸濁し、洗浄を繰り返します。1 mLの50 mM PBに再懸濁し、2回洗浄します。最後に、100 μLの50 mM PBに再懸濁します。
   3. シリカビーズで光学ピンセット校正を行い、両面テープ(厚さ約60μm)で顕微鏡スライドにカバーガラスを貼り付けてフローチャンバーを構築します。チャンバーに1 mg/mL BSA(ウシ血清アルブミンタンパク質)を入れ、3分間待ちます。
   4. PB中のシリカビーズの1:1000希釈液をチャンバーに流します。シリコングリースで満たされたシリンジを使用して、チャンバーを慎重に密閉します。各トラップに単一のビーズをトラップし、パワースペクトル法¹⁴ を適用してそれらを較正します。
   5. 20μLのシリカビーズ(直径1.2μm、固体10%)を1〜1.5mLのアセトン、ボルテックスに溶解し、30秒間超音波処理することにより、酢酸ペンチル(室温)中のシリカビーズを調製する。
   6. 18,500 x g で2分間遠心分離します。上清を捨て、1 mLのアセトンに再懸濁してから、洗浄を繰り返します。1 mLの酢酸ペンチルに再懸濁し、酢酸ペンチルで洗浄(遠心分離機と再懸濁)を2回繰り返します。ペレットを100 μLのニトロセルロース1%および900 μLの酢酸ペンチルに再懸濁します。4°Cで2ヶ月間保存します。
   7. 24 x 24 mmのガラスカバーガラスを取り、純粋なエタノールに浸した紙で慎重に拭きます。次に、きれいなピンセットで保持しながら、純粋なエタノールで直接洗ってもう一度すすぎます。穏やかな窒素の流れの下で乾かします。必要に応じて、この操作を繰り返して、ガラス表面の目に見える残留物をすべて取り除きます。
   8. シリカビーズストックを取り、それを渦巻き、~30秒間短時間超音波処理します。
   9. 2番目のカバーガラス(24 x 60 mm)を洗浄した後、それを使用してカバーガラスの片面に2 μLのシリカビーズ溶液を塗りつけ、乾くのを待ちます。
   10. フローチャンバーの作成に使用する顕微鏡スライド(26 x 76 mm)を注意深く清掃します。
   11. 図3に示すように、二重粘着テープ(~3mm、厚さ60-100μm)を2本切り取り、顕微鏡スライドの片面に貼り付けます。
   12. きれいなピンセットを使用して、 図3aに示すように、ニトロセルロース+ビーズ層をチャンバーの内側に向けて、コーティングされたカバーガラス(1.3.9)を粘着テープラインに接触させてチャンバーを閉じます(最終容量約20μL)。フローチャンバーに50 mMリン酸バッファーを満たし、シリコングリースで密封します。
   13. >1.4メガピクセルの電荷結合素子(CCD)または相補型金属酸化膜半導体(CMOS)カメラを使用して、>200倍の倍率で明視野顕微鏡で単一のシリカビーズを画像化します。フィードバックソフトウェアを使用してピエゾステージを(ナノメートル以上の精度で)動かし、熱ドリフトを補正します¹⁰。
   14. 左側のトラップの中心をビードの中心と重ね合わせます(QPDからのx-y信号レベルはキャリブレーションからのx-y信号レベルと一致する必要があります)。次に、このトラップの位置ノイズと位置信号の標準偏差を測定します。
   15. 右のトラップ¹⁵ に対して前の手順を繰り返します。
4. トラップ位置キャリブレーション:MHzからnm
   1. カバーガラス表面にシリカビーズ(1.3.5-1.3.12)と浮遊ポリスチレンビーズ(次のセクション2.1のように調製したα-アクチニン結合ビーズを使用)を備えたフローチャンバーを準備します。
   2. 視野(FOV)の中心からわずかに偏角した(~5μm)カバーガラス表面にシリカビーズを集束させ、FOVの画像を取得します。ピエゾステージを使用してビーズをFOV中心に向かって10μm移動し、2番目の画像を取得します。重心アルゴリズムなどを使用して2つの画像のビーズの中心を計算し、2つのビーズ間の距離をピクセル単位で計算して、明視野カメラのnm /ピクセルキャリブレーションを取得します。
   3. 1 つの浮遊パーティクルを 1 つのトラップにトラップします。次に、AODを使用してトラップを小さなステップ(0.2MHz)で移動させ、粒子の画像と各ステップのAODの対応する周波数を取得します。前と同じように重心アルゴリズムを使用してFOV内の粒子の位置を計算し、前の手順で取得したnm/ピクセルキャリブレーションを使用してnmに変換します。
   4. 周波数位置データに線形フィットを実行し、校正定数をnm/MHzで計算します。
   5. 2番目のトラップのキャリブレーションを繰り返します
5. トラップパワーと剛性のキャリブレーション(MHz対W)、QPD(MHz対pN/nm)
   1. カバーガラス表面にシリカビーズ(1.3.5-1.3.12)を取り付けたフローチャンバーと浮遊ポリスチレンビーズ(次のセクション2.1のように調製したα-アクチニン結合ビーズを使用)を準備し、1つのトラップに単一粒子をトラップします。次に、両方のトラップをAODを介して小さなステップ(0.2 MHz)で変位させ、QPDとAODの対応する周波数を使用して、両方のトラップ内の粒子のブラウン運動を記録します。
   2. 各位置の検出器の平均パワーを計算し、記録されたブラウン運動のパワースペクトルにローレンツ関数を当てはめることにより、トラップ剛性とQPDキャリブレーション定数ベータを取得します¹³。

2. サンプル調製

1. α-アクチニン結合蛍光ビーズの調製
   1. コンジュゲーション¹⁶の実行:アミノ官能化ポリスチレンビーズ(直径1 μm、固形分2.5%)を取り、500 μLの蒸留水で2回洗浄し、500 μLのPBS(pH 7.0)に再懸濁します。1 mM HaloTagスクシンイミジルエステル_O2 リガンドを添加し、室温で1時間インキュベートします。500 μLのPBSで3回洗浄し、100-200 μMのHaloTag α-アクチニンで再懸濁します。37°Cで1時間インキュベートし、500 μLのPBSで3回洗浄します(1.5週間以内にビーズを使用するか、液体窒素で瞬間凍結して-80°Cで保存します)。
   2. 標識:200 μLのビーズ溶液をローダミン-BSAとともに最終濃度5 μg/mLで10分間インキュベートします。50 mM PBで3回洗浄し、500 μLのPB 50 mMに再懸濁します。これは、-80°Cで数ヶ月間アリコートで保存できます)。
2. 先に述べたようにビオチン化ミオシン-5Bを発現および精製する^4,17。
3. F-アクチン¹³を重合して標識する:
   1. F-アクチン重合:69 μLの超純水、10 μLのアクチン重合バッファー10x(100 mM Tris HCl、20 mM MgCl₂、500 mM KCl、10 mM ATP、50 mM 炭酸グアニジンpH 7.5)、20 μLのG-アクチン10 mg/mL、および1 μLのDL-ジチオスレイトール(DTT)1 Mを混合します。
   2. ローダミンによるF-アクチン標識(例/Em:546/575 nm):25 μLの重合F-アクチンを取り、19.5 μLの超純水、2.5 μLのアクチン重合バッファー10x(100 mM Tris HCl、20 mM MgCl 2、500 mM KCl、10 mM ATP、50 mM 炭酸グアニジンpH 7.5)、1 μLの1 M DTT、および₂ μLの250 μLローダミンファロイジンを加えます。氷の上に置いて一晩放置します。トラップ実験のために、ローダミンF-アクチンは氷上に保存し、1週間以内に使用することができます。
4. サンプル組立
   1. フローチャンバー(1.3.5-1.3.12)を取り、1 mg/mLのビオチン化BSAを5分間インキュベートします。ABバッファー(25 mM MOPS、25 mM KCl、4 mM MgCl 2、1 mM EGTA、1 mM DTT、pH_7.2)で洗浄した後、1 mg/mLストレプトアビジンを5分間インキュベートし、ABバッファーで再度洗浄します。ビオチン化ミオシン-5B重メロミオシンをM5Bバッファー(10 mM MOPS pH 7.3、0.5 M NaCl、0.1 mM EGTA、3 mM NaN 3)中で₃ nM濃度で2 μMカルモジュリン(CaM)とともに5分間インキュベートします。AB溶液に2 μM CaMを添加した1 mg/mLのビオチン化BSAを3回投与して洗浄し、3分間インキュベートします。
   2. インキュベート中に、反応ミックス(RM):0.005%α-アクチニン官能化ビーズ(セクション2.1)、1 nMローダミンF-アクチン(セクション2.3)をイメージングバッファー(IB:実験に必要な濃度で1.2 μMグルコースオキシダーゼ、0.2 μMカタラーゼ、17 mMグルコース、20 mM DTT、2 μM CaMおよびATPを含むABバッファー)で調製します。
   3. RMで洗浄し、シリコングリースでチャンバーを密封します。これで、サンプルを顕微鏡で観察する準備が整いました。

3. 測定

1. ダンベルを組み立てます。
   1. 長距離トランスレータを使用してサンプルを移動して浮遊αアクチニンビーズを探し、1つのトラップをオンにして1つのビーズをトラップします。
   2. 最初のトラップが占有されたら、トランスレータを動かしてトラップされたビードをカバーガラス表面の近くに配置して複数のビーズをトラップしないようにし、別のビードを2番目のトラップにトラップします。
   3. AOD音波のパワーを調整して、2つのトラップを同じ剛性に調整します。剛性は通常0.03〜0.14 pN/nmの間で設定されます。剛性が小さいほど、特に低力での力のノイズは小さくなります。
   4. 次に、電動ミラーM(図2)を反転させて蛍光顕微鏡に切り替え、長距離トランスレータ¹³を通してサンプルを移動させて溶液中に浮遊するアクチンフィラメントを探します。長いフィラメント(>5μm)を好むのは、処理ミオシンがそれを変位させ、剥離する前に数ミクロンの間動かすからです。
   5. サンプルを移動して、トラップされたビーズの1つが互いに付着するまでフィラメントの一方の端に近づきます。次に、ビーズ距離をおおよそのフィラメント長に調整し、ステージをその方向に動かして、結合されていない第2のビーズの方向に流れを作ります。フィラメントは流れによって引き伸ばされ、最終的にはそれに結合します¹³。ビーズ - アクチン - ビーズ複合体は「ダンベル」と呼ばれます。
2. アクチン - ミオシン接触を確立する。
   1. 2つのトラップをゆっくりと離してフィラメントを約3pNまでプリテンションし、2つのAODのうちの1つの周波数を変更して1つのトラップを三角波で振動させ、その結果、位置信号を介して後続ビードにモーションが伝達されることを確認することで、ダンベルの剛性を調べます。
   2. ステージを移動してダンベルを台座シリカビーズの近くに置き、トラップされたビーズの中心の高さをシリカビーズの直径よりわずかに低く調整することにより、フィラメントとビーズ表面に付着したタンパク質との接触を許可します。次に、トラップされたビーズの間にシリカビーズの中心を配置します。
3. フォースクランプとnm安定化フィードバック:
   1. 2〜3 pNの力と200 nmの振動で超高速フォースクランプのスイッチを入れ、アクチンフィラメントに垂直な方向に約20〜30 nmの離散ステップでペデスタルビーズをスキャンします。各位置で相互作用が発生するのを待ち(数秒)、相互作用が観察されない場合は先に進んでください。タンパク質とフィラメントの相互作用が確立されたら、相互作用がより頻繁に発生する位置を探します。
   2. プロセッシブミオシンがアクチンフィラメントの一端(通常は+末端)に向かって移動すると、+末端に付着したトラップビーズがシリカビーズに向かって移動することを確認します。ミオシンが結合していないときにシリカビーズがフィラメントの端に付着したトラップされたビーズにできるだけ近くなるようにステージをフィラメントの端に向かって移動し、ナノメートル安定化フィードバックを開始します。そうすることで、フィラメントの+端に取り付けられたトラップされたビーズがシリカビーズに衝突する可能性が最小限に抑えられます。
4. データを記録します。

4. データ分析⁴

注:説明されている分析方法では、ミオシンステッピングによって引き起こされるダンベル速度の変化に基づいて、プロセス実行と高速ステッピングイベントを検出および測定できます。加工工程の分析は、参考文献^3、4、13に記載の非加工モータのデータ解析方法に基づいて行われる。

1. 速度変化のしきい値を設定して、ステッピング イベントの検出を可能にします。この場合、順方向と逆方向の両方のステップが予想されるため、しきい値の交差は両方向で受け入れられます。
2. 各ステップを対応する実行に割り当てる:2つの連続するステップ間の時間間隔が3ミリ秒より短く、ステップの振幅が90nm<場合、ステップは同じ実行に割り当てられ、それ以外の場合はステップが異なる実行に割り当てられます⁴。
3. 補助部隊の正しいランレングス⁴.
   1. 次の式(Dは振動範囲)から測定された平均ランレングス値<RL_m>から実際のランレングス値RLを計算することにより、補助力の下でのランレングスを修正します。
      
      注:この方程式の導出に関する詳細は、参考文献⁴に記載されています。

結果

代表的なデータは、図 4 に示すように、時間の経過に伴う位置レコードで構成されます。位置レコードには、2種類の変位が表示されます。まず、ミオシンモーターがアクチンフィラメントと相互作用していないとき、トラップされたビーズは溶液の粘性抗力に対して等速で移動しており、三角波³でオペレーターが設定した振動範囲内で振動する線形?...

ディスカッション

3ビーズアッセイなどの単一分子技術は技術的に困難でスループットが低いですが、UFFCSはデータの高いS/N比により分子相互作用の検出を改善します。UFFCSは、モータータンパク質の負荷依存性の研究を可能にし、モーターがフィラメントに結合する際に非常に迅速に力を加えるという主な利点により、制御された力の下での力の生成および弱い結合状態における早期かつ非常に迅速な事象を?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Aliphatic Amine Latex Beads	ThermoFisher	A37362	1.0-μm diameter, 2% (w/v)
Acetone	Sigma	32201
Actin polymerization buffer	Cytoskeleton	BSA02	10X
AODs (acousto-optic deflectors)	AA Opto Electronic	DTS-XY 250	Laser beam deflectors
ATP	Sigma	A7699
Biotinylated-BSA	ThermoFisher	29130
BSA	Sigma	B4287
Calmodulin from porcine brain (CaM)	Merck Millipore	208783
Catalase from bovine liver	Sigma	C40
Condenser	Olympus	OlympusU-AAC, Aplanat, Achromat	NA 1.4, oil immersion
Creatine phosphate disodium salt tetrahydrate	Sigma	27920
Creatine Phosphokinase from rabbit muscle	Sigma	C3755
DDs	AA Opto Electronic	AA.DDS.XX	Two-channel digital synthesizer
DL-Dithiothreitol (DTT)/td>	Sigma	43819
EGTA	Sigma	E4378
G-actin protein	Cytoskeleton	AKL99
Glucose	Sigma	G7528
Glucose Oxidase from Aspergillus niger	Sigma	G7141
HaloTag succinimidyl ester O2 ligand	Promega	P1691
High vacuum silicone grease heavy	Merck Millipore	107921
KCl	Sigma	P9541
KH2PO4/K2HPO4	Sigma	P5379/ P8281
Labview	National Instruments	version 8.1	Data acquisition
Labview FPGA module	National Instruments	version 8.1	Fast Force-Clamp
Matlab	MathWorks	2016	Data analysis
MgCl2	Fluka	63020
Microscope Objective	Nikon	Plan-Apo 60X	NA 1.2, WD 0.2 mm, water imm.
MOPS	Sigma	M1254
Nitrocellulose	Sigma	N8267	0.45 pore size
Pentyl acetate solution	Sigma	46022
Pure Ethanol	Sigma	2860
QPDs	UDT	DLS-20	D Position Detecto
Rhodamine BSA	Molecular Probes	A23016
Rhodamine Phalloidin	Sigma	P1951
Silica beads	Bangslabs	SS04N	1.21 mm, 10% solids
Sodium azide	Sigma	S2002
Streptavidin protein	Sigma	189730