収穫と分解:バイオフィルム法研究における見過ごされたステップ

要約

この論文では、2つの表面タイプにおける3つの一般的なバイオフィルム収穫および分解技術、収穫方法の堅牢性試験、および再現性を高めるために収穫および分解技術を選択および最適化する際に考慮すべき最小限の情報を示す方法を詳述する。

要約

バイオフィルム法は、関連するモデルでバイオフィルムを成長させる、成熟したバイオフィルムを処理する、表面からバイオフィルムを採取し、凝集塊を分解する、およびサンプルを分析するという4つの異なるステップからなる。4つのステップのうち、収穫と分解は最も研究されていませんが、テストバイアスの可能性を考慮すると、それにもかかわらず重要です。この記事では、3つの異なる表面で成長したバイオフィルムに一般的に使用される収穫および分解技術を示します。広範な文献レビューから収集された3つのバイオフィルム収穫および分解技術には、ボルテックスおよび超音波処理、スクレイピングおよび均質化、ならびにスクレイピング、ボルテックスおよび超音波処理が含まれる。硬質非多孔質(ポリカーボネートおよびホウケイ酸ガラス)と多孔質(シリコーン)の2つの表面タイプが考慮される。さらに、従う収穫技術を報告する際に含めるべき最小限の情報と、バイアスをチェックするための付随する方法に関する推奨事項を提供します。

概要

バイオフィルムの定義は過去数十年にわたって進化しており、さまざまな生物学的および/または非生物学的表面との微生物の関連、マトリックス内の異なる成長および遺伝子発現²を示す非細胞成分¹の包含を包含する。バイオフィルムは、乾燥などの環境ストレスからの保護を提供し、微生物の生存をもたらす化学消毒剤の作用をあまり効果的でないものにする可能性があります。バイオフィルム内の生存者は、公衆衛生上の懸念事項である病原性微生物の発生源を提供する可能性があります³。

バイオフィルム法は、成長、処理、サンプリング(収穫および分解)、および分析の4つのステップで構成されています。成長は、第1のステップにおいて、使用者が生物の生育条件、温度、媒体等を決定するところ、バイオフィルム文献⁴、⁵、^6、7において最も考慮され^、報告されている。処理ステップは、抗菌剤(例えば、消毒剤)を評価して、成熟バイオフィルム^3、8、⁹に対するそれらの有効性を決定するか^、または抗菌剤が表面に組み込まれ得るバイオフィルム増殖を防止または低減する製品の能力を決定する¹⁰。第3のステップは、サンプリング、それが成長していた表面からバイオフィルムを採取し、除去された凝集塊を分解するステップ3^、8、11を含む。第4のステップは、分析、生細胞数、顕微鏡観察、蛍光測定、分子転帰、および/またはマトリックス成分評価^8、9を含み得る。データの評価は、実験の結果に関する情報を提供します。4つのうち、サンプリングは、選択されたバイオフィルム収穫および/または分解技術が100%効果的であり、しばしば検証なしで行われると想定しているため、最も見過ごされがちなステップです¹¹。

細菌のプランクトン懸濁液は、しばしば均質であると考えられ、分析の前に単純なボルテックスを必要とする。しかし、バイオフィルムは、微生物(原核生物および/または真核生物)、エキソ多糖類、タンパク質、脂質、細胞外DNA、および宿主細胞で構成される複雑なコミュニティです¹²。表面からバイオフィルムを適切に採取し、それを均質な単一細胞懸濁液に分解するためには、従来のプランクトン微生物学的培養方法を超えるステップが必要である。広範な文献レビュー(この刊行物には含まれていない情報)は、除去および脱凝集技術の選択が、バイオフィルム中に存在する種、バイオフィルムが付着している表面(非多孔質または多孔質)、成長表面への接近性(容易に除去可能なクーポンまたはバイオフィルムが成長している装置の物理的破壊)を含む多くの要因に依存することを実証した。 表面形状(面積および形状)、成長表面上のバイオフィルムの密度、および利用可能な実験装置。

バイオフィルムが表面から回収されると、得られる細胞懸濁液は異種である。この不均一な懸濁液を正確に列挙しようとする場合、個々の細胞に分解されなければならない。生存プレート数は、コロニー形成単位が1つの細菌に由来すると仮定する。バイオフィルムの凝集体が増殖培地上に置かれると、個々の細胞を区別することは不可能であり、不正確な推定につながる可能性がある。例えば、消毒剤有効性試験中に、処置が対照と比較して表面からバイオフィルムを非常に効果的に除去する場合、対数の減少は対照と比較して人為的に大きく見える可能性がある。一方、バイオフィルムを表面に固定する化学消毒剤は、対照と比較して、対数減少が低いように見えます¹¹。このタイプのシナリオは、実験データの偏った解釈につながる可能性があります。

出版の準備として、文献のレビューは、バイオフィルムを収穫および分解するための一般的なアプローチが、掻き取り、スワビング、超音波処理、ボルテックスまたはこれらの組み合わせを含むと判断した。掻き取りは、滅菌スティック、ヘラまたは他のツールを用いて表面からバイオフィルムを物理的に除去することと定義される。スワビングとは、綿の先端のスティックまたは他の固定吸収材料を用いて表面からバイオフィルムを除去することを指す。超音波処理は、水を介して分布する超音波を介して表面からのバイオフィルムの破壊を指す。ボルテックスとは、チューブ内のサンプルの液体渦を達成するためのミキサーの使用を指します。均質化は、回転ブレードを使用して、回収されたバイオフィルム凝集塊を単一の細胞懸濁液に剪断する。本稿では、硬質/非多孔質と多孔質の2つの異なる表面タイプに対する3つの収穫および分解方法を提示する。

研究者が出版物の方法セクションに含めるべき推奨される最低限の情報のリストが提供されています。この情報を含めることで、他の研究者が自分の研究を再現できることを願っています。完璧な収穫および分解方法がないため、技術を確認する方法に関する推奨事項も提供されます。

この記事では、一般的な成長表面からバイオフィルムを収穫および分解する3つの一般的な方法が示されています。この情報により、研究者はバイオフィルム試験法の全体的な精度とバイアスをよりよく理解することができます。記載されている方法は次のとおりです:(1)CDCバイオフィルムリアクター内の高流体せん断下でポリカーボネートクーポン(硬質非多孔質表面)上に成長させた 緑膿菌 バイオフィルムを採取し、バイオフィルムの採取および解凝集を達成するためにボルテックスおよび超音波処理の5つのステップの組み合わせに続いて解凝集する(2)A P. 低流体せん断下でドリップフローリアクター内のホウケイ酸ガラスクーポン(硬質非多孔質表面)上に成長したバイオフィルムを回収し、掻き取りおよび均質化を用いて解凝集させる(3)シリコーンチューブ(多孔質表面)で成長させた 大腸菌 バイオフィルムを採取し、掻き取りを用いて解凝集させ、続いて超音波処理およびボルテックス処理を行う。

プロトコル

1. ボルテックスと超音波処理

1. 成熟した緑膿菌ATCC 15442バイオフィルムをASTM規格E25622に従って成長させる。
2. 48時間の成長期間の終わりに、ASTM規格E28718に従ってバイオフィルムおよびサンプルクーポンを処理する準備をし^{てください}
3. オートクレーブ処理されたスプラッシュガードを、火炎滅菌された鉗子を使用して滅菌された50mL円錐形チューブに無菌的に挿入します。治療を受けるすべてのチューブについて繰り返します。コントロールクーポン用のチューブにはスプラッシュガードは必要ありません。
4. 無作為に選択されたロッドをCDCバイオフィルムリアクターから無菌的に除去する。クーポンをすすぎ、ロッドを30mLの滅菌緩衝水に静かに浸漬して、緩く付着した細胞を除去する。
5. ロッドをベンチトップと平行に保持し、空の滅菌された50mL円錐形チューブの上に、火炎滅菌アレンレンチを使用して、止めネジを緩めてバイオフィルムコーティングされたクーポンをチューブに落とします。希望数のクーポンについて繰り返します。スプラッシュガードを取り外し、滅菌のために別の容器に入れます。
6. 5 mLの血清学的ピペットを用いて、液体がチューブの壁の内側を流れ落ちるように、4 mLの処理または対照をチューブにゆっくりとピペットする。
7. クーポンの下の気泡が変位するようにチューブの底を静かにタップします。各追加の間に 30 ~ 60 秒かかります。
8. 指定された接触時間の終わりに、処置(または対照)と同じ順序でチューブに中和剤36mLのピペットが加えられた。
   注:併用処理と中和剤の最終体積は、バイオフィルム対数密度を正確に決定するために重要です。
9. 各チューブを30 ± 5秒の最高設定で渦巻きます。完全な渦が達成されていることを確認します。
   注:破損が発生する可能性のあるガラスバイアルにステンレススチールなどの重いクーポンをボルテックスする場合は注意が必要です。
10. 実際のサンプルを処理する前に、バスあたりのチューブの最適な数と試験チューブラック内の配置を決定します。複数のサンプルを処理する場合は、超音波処理浴内の水温が21 ± 2 ^oCであることを確認してください。
11. 浴中の水位がチューブ内の液体レベルに等しくなるように、脱気超音波装置に懸濁されたチューブラックにチューブを置きます。45 kHzで超音波処理, 100% パワーとノーマル機能 30 ± 5 秒.渦と超音波処理サイクルを繰り返し、最終的な渦(合計5サイクル)で終了します。
    注:採取および分解されたバイオフィルムを有するこれらのチューブは、¹⁰⁰または0希釈である。
12. サンプルを緩衝水で段階的に希釈する。適当な播種法を用いてR2A寒天上に平板する。36±2 ^°Cで24時間インキュベートする。使用しためっき方法に適宜コロニーをカウントし、データを記録する。

2. 削り取りと均質化

1. 成熟した緑膿菌ATCC 15442バイオフィルムをASTM規格E264713に従って増殖させる。
2. サンプリングボード、ビーカー内の95%エタノール、アルコールバーナー、止血剤、クーポン除去ツール、滅菌希釈水付きビーカー、クーポンをすすぐための希釈チューブを含むようにサンプリングステーションを設定します。
3. ポンプの電源を切ります。チャンネルカバーを取り外し、滅菌クーポン取り外しツールと止血剤を使用してクーポンを取り除き、バイオフィルムを乱さないように注意してください。
4. クーポンを、45 mL の滅菌希釈水 (50 mL 遠沈管に収容されている) に液体の動きで静かに浸漬してすすいでください。すぐにモーションを逆にしてクーポンを削除します。
5. クーポンを45mLの滅菌希釈水を入れたビーカーに入れます。バイオフィルムで覆われたクーポン表面を、滅菌ヘラまたはスクレーパーを使用して、下方向に約15秒間こすります。ヘラまたはスクレーパーをビーカーでかき混ぜてすすいでください。掻き取りとすすぎのプロセスを3〜4回繰り返し、クーポン表面を完全に覆うようにします。
6. クーポンを滅菌ビーカーの上に60°の角度で保持し、クーポンの表面上に1mLの滅菌希釈水をピペッティングして、クーポンをすすぎます。合計5回のすすぎを繰り返します。ビーカー内の最終容量は50mLである。
   注:併用処理と中和剤の最終体積は、バイオフィルム対数密度を正確に決定するために重要です。
7. クーポンが取り外されたら、各チャンネルカバーを交換してください。
8. バイオセーフティキャビネットで作業し、掻き取ったバイオフィルムサンプルを均質化します。滅菌ホモジナイザープローブをホモジナイザーに取り付け、プローブチップを液体に入れ、ホモジナイザーをオンにして20,500rpmまでランプします。
9. サンプルを30秒間均質化します。RPMの電源を切り、ホモジナイザーの電源を切ります。
10. 上記のように、9 mL の滅菌希釈ブランクを 20,500 rpm で 30 秒間ホモジナイズすることにより、バイオフィルムサンプル間のプローブを消毒します。70%エタノールの9mLチューブを30秒間ホモジナイズし、プローブを取り外してエタノールチューブに1分間放置する。2つの追加の希釈ブランクを均質化する。
    注:使い捨てホモジナイザープローブを各サンプルに使用することができます。
11. サンプルを緩衝水で段階的に希釈する。適当な播種法を用いてR2A寒天上に平板する。プレートを36±^2oCで24時間インキュベートし、使用したプレーティング方法に適宜コロニーをカウントし、データを記録する。

3.スクレイピング、ボルテックス、超音波処理

1. 成熟 した大腸菌 ATCC 53498バイオフィルムをシリコーンカテーテルチューブで成長させる¹⁰。
2. サンプリング材料を準備します:リンスチューブ、滅菌遠心分離チューブ、空の滅菌ペトリ皿、火炎滅菌されたステンレス鋼の止血剤およびはさみ、タイマー、および定規。
3. ポンプを一時停止した状態で、70%エタノールを使用してチューブの外側を清掃します。コネクタに取り付けられた領域を避けて端から 2 cm を測定し、チューブにマークを付けて切断位置を決定します。
4. 火炎滅菌はさみで、2cmマークのチューブを切断し、空の滅菌ペトリ皿にセグメントを置きます。チューブを70%エタノールで拭き取り、遠位端を廃チューブに再接続します。
5. チューブセグメントをすすぎ、プランクトン細胞を除去した。火炎滅菌鉗子を使用して、チューブセグメントを20mLの滅菌希釈水に静かに浸漬し、直ちに除去する。セグメントを10mLの中和剤に入れる。
6. 火炎滅菌された鉗子で、チューブセグメントを保持し、チューブのすべての内側領域が削られるまで滅菌木製アプリケータースティックでこすります。時折、スティックを10 mLの中和剤ですすぎ、セグメントをサンプルチューブに戻します。削り取られたチューブセグメントは、¹⁰⁰ または0希釈です。
   注:併用処理と中和剤の最終体積は、バイオフィルム対数密度を正確に決定するために重要です。
7. 各チューブを30 ± 5秒の最高設定で渦巻きます。浴中の水位がチューブ内の液体レベルに等しくなるように超音波処理機に懸濁されたチューブラックにチューブを置きます。45 kHzで超音波処理, 100% パワーとノーマル機能 30 ± 5 秒.渦と超音波処理サイクルを繰り返し、最終的な渦で終わります。
   注:採取および分解されたバイオフィルムを備えたこのチューブは、¹⁰⁰ 希釈液である。
8. サンプルを緩衝水で段階的に希釈する。適切なメッキ方法を用いてトリプシン大豆寒天上にプレートする。
9. プレートを36±2 ^°Cで24時間インキュベートする。使用するめっき方法に適宜コロニーをカウントし、データを記録し、算術平均を算出する。

結果

収穫方法の検証・確認
私たちの研究室で行われたいくつかの研究は、シングルチューブ法(ASTM E2871)⁸を使用して、バイオフィルムリアクター(ASTM E2562)²で成長したバイオフィルムを効果的に収穫するボルテックスと超音波処理の能力を調べました。

緑膿菌ATCC 15442バイオフィルムを、ホウケイ酸ガラスクーポン上でAS...

ディスカッション

収穫および分解方法に関する最小情報
科学界全体で再現可能なバイオフィルムデータを作成するには、バイオフィルム法の成長、治療、サンプリング、分析の各ステップについて、著者ができるだけ多くの詳細を含めることが不可欠です。バイオフィルム法の標準化は、研究者が特定の方法および関連する修正を参照することを可能にするので、この努力を助けてきた。しか?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
50 mL conical vials	Thermo Scientific	339652
100 mL glass beakers	Fisher Scientific	FB102100
5 mL serological pipettes	Fisher Scientific	13-678-12D	For adding treatment to vials containing coupons.
50 mL serological pipettes	Fisher Scientific	13-678-14C	For adding neutralizer to vials at the end of treatment contact time.
Applicator sticks	Puritan	807
Hemostats	Fisher Scientific	16-100-115
Metal spatula	Fisher Scientific	14-373
PTFE policemen	Saint-Gobain	06369-04
S 10 N - 10 G - ST Dispersing tool	IKA	4446700	For homogenization of biofilm samples.
Scissors	Fisher Scientific	08-951-20
Silicone Foley catheter, size 16 French	Medline Industries	DYND11502
Silicone tubing, size 16	Cole-Parmer	EW96400-16
Splash Guards	BioSurface Technologies, Inc.	CBR 2232
T 10 basic ULTRA-TURRAX Disperser	IKA	3737001	For homogenization of biofilm samples.
Tubing connectors	Cole-Parmer	EW02023-86
Ultrasonic Cleaner	Elma	TI-H15
Vortex-Genie 2	Scientific Industries	SI-0236
Vortex-Genie 2 Vertical 50 mL Tube Holder	Scientific Industries	SI-V506