骨髄由来肥満細胞培養用結晶性ナノセルロース埋め込みアガロースバイオマテリアルインクの製造

要約

このプロトコルは、細胞の生存率および細胞表面受容体の表現型発現の観点から、マウス骨髄由来肥満細胞を有する結晶性ナノセルロース(CNC)/アガロース複合ヒドロゲル生体材料インクの生体適合性を迅速に評価する方法を強調している。

要約

3次元(3D)バイオプリンティングは、パターンに堆積したヒドロゲルベースの複合材料(または生体材料インク)を利用し、細胞が堆積する基質を形成します。多くの生体材料インクは原発細胞に対して細胞毒性を持つ可能性があるため、高価な3D組織工学プロセスで使用する前に、これらのヒドロゲル複合体の生体適合性を決定する必要があります。バイオプリンティングを含む一部の3D培養法では、細胞を3Dマトリックスに埋め込む必要があり、機械的損傷を引き起すことなく生存率とバイオマーカー発現の変化について細胞を抽出して分析することが困難です。本プロトコルは、細胞生存率およびバイオマーカー発現に関するフローサイトメトリックアッセイを用いて、24ウェル培養系に作製された結晶性ナノセルロース(CNC)埋め込みアガロース複合体の生体適合性を評価する方法である概念実証として説明する。

CNC/アガロース/D-マンニトールマトリックスへの18時間の曝露後、BMMCの生存率は、ヨウ化プロピジウム(PI)透過性によって測定されるように変化しなかった。しかし、 CNC/アガロース/D-マンニトール 基質上で培養されたBMMCsは、高親和性IgE受容体(FcεRI)および幹細胞因子受容体(Kit;) の発現をわずかに増加するように見えた。CD117)は、これはバイオインク複合体中のCNCの量に依存しているようには見えないが。BMMCsの生存率は、3D押出バイオプリンターを用いてフィブリラーナノセルロース(FNC)とアルギン酸ナトリウムで構成された市販の生体材料インクから製造されたヒドロゲル足場への経時暴露後にも評価された。6-48時間の期間にわたって、FNC/アルギン酸基質は、フローサイトメトリーおよびマイクロタイターアッセイ(XTTおよび乳酸脱水素酵素)によって決定されるBMMCsの生存率に悪影響を及ぼさなかった。このプロトコルは、マスト細胞を用いたポストプリントシード用の3Dスキャフォールドとして、その有用性のためのバイオマテリアルインキ候補の生化学的適合性を迅速にスクリーニングする効率的な方法を記述する。

概要

最近の3D培養システムと3Dバイオプリンティングへの関心は、ヒドロゲルおよびヒドロゲル複合材料に注目されています。これらの複合材料は、粘性でありながら多孔質のバイオミメティクスとして機能し、生物学的組織に匹敵する重量で最大99%の水分含有量で構成することができます^1,2,3。ヒドロゲル複合材料のこれらの特徴は、それによって、その生存率および機能に影響を与えることなく細胞の増殖を可能にする。そのような複合材料の1つは、ヒドロゲル複合材料の強化材料として使用されてきた結晶性ナノセルロース(CNC)、生体材料インプラントの開発における細胞足場、および2次元(2D)および3Dインビトロ^{細胞培養4,5}です。ほとんどの場合、CNCからなるマトリックスは、ヒト角膜上皮細胞⁶、腸上皮細胞⁷、ヒト骨髄由来間葉系幹細胞⁸、またはニューロン様細胞⁹に対してあからさやかに細胞毒性を有しない。しかし、ヒト骨髄由来間葉系幹細胞の代謝活性および増殖は、木材ベースのナノセルロース複合体の粘度の増加との相関性が低下し、マトリックスの組成が細胞機能に及ぼす有害な影響について注意深く試験しなければならないことを示唆^{している8}。

同様に、CNCは、3D免疫細胞培養システム^10,11において重大な影響を及ぼす可能性がある、内在化時にマクロファージにおいて炎症反応を誘発する可能性がある。実際、CNCが他の免疫細胞応答、特に肥満細胞によって開始されるアレルギー性炎症反応にどのように影響を与えるかについて、利用可能なデータはほとんどありません。マスト細胞は、アレルゲンに対する炎症反応を活性化する役割を担う高親和性IgE受容体FceRIを発現するグラニュール化白血球である。それらの増殖および分化は、チロシン受容体、キットに結合する幹細胞因子(SCF)に依存している。マスト細胞は、循環に入り、その後、すべてのヒト組織に遍在的に分散するために末梢移動する骨髄前駆細胞に由来する¹²。マスト細胞は3D組織環境で機能するため、in vitro 3D組織モデルで免疫学的プロセスを研究するための理想的な免疫細胞候補です。しかし、現在までに、肥満細胞を含むインビトロ3D組織モデルは存在しない。

肥満細胞の高感度性と、外部刺激に対する炎症反応を引き出す傾向があるため、3Dマトリックス構成成分と3D足場にマスト細胞を導入するバイオプリンティング法を慎重に検討することが必要である。組織構築物は、バイオインクと生体材料インクの2つの大きなカテゴリーからバイオファブリケートすることができます。この違いは、バイオインクが細胞を含むヒドロゲル複合材料であるのに対し、生体材料インクはGrollららによって定義される細胞を欠くヒドロゲル複合体であるという事実^{にあります。}したがって、バイオインクで印刷された3Dコンストラクトにはヒドロゲルマトリックス内にあらかじめ埋め込まれた細胞が含まれていますが、生体材料インクで印刷された3Dコンストラクトはポストプリンティングの細胞で播種する必要があります。ヒドロゲルベースのバイオインク/生体材料インクからの培養スキャフォールドのバイオファブリケーションは、最も一般的に、ニューマチックまたは機械的に駆動されるピストン¹⁴を介して圧力下でマイクロスケールノズルを介してバイオインク/生体材料インクを押し出す押出3Dバイオプリンタを使用して行われます。押出バイオプリンターは、「ボトムアップ」アプローチで互いに順次積み重ねられる2D断面パターンでバイオインキを堆積させることによって、3D足場を作製する。

押出バイオプリンティングと互換性を持つためには、ヒドロゲルベースのバイオインク/バイオマテリアルインクはチキソトロピック(せん断薄化)特性を有する必要があり、それによってバイオインク/生体材料インクの構成ヒドロゲルポリマーは、せん断応力を受けるとマイクロチャネルノズルを通る流体のように流れるが、シアストレスの除去時に粘性のゲル様状態に戻る必要がある^。.含水率が高いため、3Dバイオプリント構造のアーキテクチャと構造的完全性を維持するために、ヒドロゲルベースのバイオインク/生体材料インクのポリマーを物理的または共有的に架橋する必要があります。細胞を含むバイオインクの場合、細胞は架橋プロセス中に直接化学ストレスを受ける。バイオインクヒドロゲルマトリックス内にカプセル化された細胞を押し出すプロセスは、細胞を剪断応力にさせ、生存率の低下および/または細胞死につながる可能性があります。3D組織モデルがバイオプリントされると、ヒドロゲルマトリックス自体によって引き出される細胞毒性のレベルと、押出および架橋プロセスをそれぞれ区別することは困難です。これは、細胞がヒドロゲルマトリックス内に事前に埋め込まれている3D足場の文脈では特に困難であり、その後の分析のために細胞を除去することは困難であり、肥満細胞の生存率に有害である。

マスト細胞を含む3D組織構築物を生成するためのより穏やかなアプローチは、細胞培養懸濁液からプレプリントされた多孔質生体材料インク3D足場に細胞を播種することを含み、肥満細胞が循環から末梢組織に移行する先天的な能力を活用する。この細胞播種アプローチの利点は、(i)マスト細胞がそれぞれ押出および架橋プロセスからせん断および化学的ストレスを受けず、(ii)細胞を分析のために穏やかに洗浄することによって3D足場から容易に除去することができる。2Dヒドロゲルディスクとは対照的に、3Dバイオプリントされた多孔質ヒドロゲル足場上のマスト細胞の細胞生存率を播種および分析する追加の利点は、3Dバイオプリントヒドロゲル足場が 生体組織の 微小地形特徴を再現することです。このアプローチは、高価な3D組織工学実験への投資に先立ち、マスト細胞および他の免疫学的細胞に対するバイオインクヒドロゲルマトリックス候補の潜在的に壊滅的な細胞毒性効果を決定するための、適切で迅速かつ費用対効果の高いアプローチです。

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プロトコル

注:このプロトコルは、(1)マウス骨髄の分離とマウス骨髄由来マスト細胞(BMMCs)の分化、(2)24ウェルシステムでCNC/アガロース/D-マンニトールヒドロゲル基質の製造および基質上のBMMCsの培養、(1)の5つのセクションで構成されています。 (3)CNC/アガロース/D-マンニトールヒドロゲル基材からのBMMCsの除去と、フローサイトメトリーを用いた生存率とバイオマーカー発現の解析 (4)市販のフィブリラーナノセルロース(FNC)/アルギン酸ナトリウム複合生体材料インクからのヒドロゲル足場の3Dバイオプリンティング、および(5)FNC/ナトリウムアルギン酸ヒドロゲル足場上のBMMC培養およびフローサイトメトリー、XTT、および乳酸脱水素酵素(LDH)マイクロサーセイを用いた生存率の分析。

1. BMMC文化の生成

注:イソファラン麻酔後の_CO2 窒息によりマウスを安楽死させた。脛骨と大腿骨を単離し、骨髄全体を収穫した。すべての動物研究は、アルバータ大学の健康科学動物ケアおよび使用委員会の承認を得て、カナダ動物ケアガイドラインと政策評議会に従って行われました。

1. 表1に示したサプリメントを示された最終濃度に添加して、完全なRPMI-1640培養培地を調製する。NaOHを使用して培地のpHを7.4-7.6に調整し、単独使用のボトルトップフィルター(0.2 μmの細孔サイズ)を使用してフィルター滅菌し、4°Cで最大2ヶ月間暗闇の中で保存します。
2. 地元の大学動物管理委員会の議定書と手順に従ってマウスから大腿骨を入手する。
   注:この研究では、大腿骨はC57BL/ 6マウスから単離されましたが、研究に関連する場合は任意の株を使用することができます。
3. はさみを使用して、股関節から皮膚と筋肉を取り除き、股関節のソケットから少しひねり出して大腿骨をそっと引っ張ります(図1)。大腿骨の頭を壊さないように注意してください。はさみを使用して、内側のファベーリャで大腿骨から脛骨を切り取ります。踵骨のすぐ上を切って足を取り除き、捨てます。
4. メスを使用して、大腿骨と脛骨の部分から皮膚や軟骨を除去します。はさみを使用して、大腿骨と脛骨の両端にきれいなカットを行い、中の赤い骨髄を露出させる。必要に応じて、この時点でフィブラを除去するが、骨髄の洗浄中に脛骨の操作に役立つ可能性があることに注意してください。
5. 5 mL ルアーロックシリンジを備えた26G針を用意し、上述の完全な培地を約5 mL充填します。
   注:この時点で、添加剤を使用しない不完全なRPMIも試薬を節約するために使用することができます。
6. 大腿骨または脛骨を鉗子で保持し、針を骨の一端に挿入し、注射器を軽く押します。50 mL の滅菌状の円錐形チューブに骨を保持し、約 5 mL の培地を骨に静かに注入し、圧力を加えます。骨髄の破片が薄い赤いリボンとして骨の反対側に落ちて円錐形のチューブに落ちるのを観察してください。
7. 吸気をスピンダウンし、完全な培地で再懸濁するか、または完全なRPMI-1640培地の50 mLを含むT175 ^cm2 滅菌組織培養フラスコに直接移します。30 ng/mLマウス組換えインターロイキン(IL)-3で完全なRPMI-1640培地で吸引を維持します。
8. 1日後、軽顕微鏡で培養を観察する。培養は、様々な形状と大きさの細胞の異種集団と骨髄のさらに大きな部分で構成されます。上記のように完全なRPMI-1640培地を用いて3〜5日毎に15mLの新鮮な培地を添加することにより細胞培養を送り、細胞密度が1×¹⁰⁶ 細胞/mLを超えないようにした。週に1回、室温で5分間200× g で細胞をスピンダウンし、新鮮な完全なRPMI-1640培地で再懸濁し、新鮮なT175フラスコで培地の50mLに1:4を分割します。
9. 4週間後、下記のようにフローサイトメトリーによりCD117(Kit)およびFceRI受容体の表面発現を測定することにより細胞純度を測定する(セクション3.2)。
   注:4週間後、細胞の99%はCD117(キット)とFcεRIの2倍陽性でなければなりません。
10. 4週間後以降、完全なRPMI-1640培地で20 ng/mLのIL-3でBMMCsを維持します。約6週間で、細胞は分裂を停止し、分割を必要としません。培養物を3~5日おきに、1週間に1回遠心分離してペレット化し、新鮮な完全RPMI-1640培地で再中断します。

2. CNC/アガロース/D-マン一体ヒドロゲル基材の製造とBMMC培養

1. ガラス瓶に0.2gのアガロース粉末をリン酸緩衝生理食塩水(PBS)(2%w/v)に加えて最終体積10mLに加え、100°Cで1分間沸騰させて溶解します。
2. 2.5 gのCNC粉末をPBSで最終体積10 mLに溶解し、25%w/v混合物を調製する。
3. 2gのCNC粉末をPBSに10 mLの最終体積に溶解し、20%w/v混合物を調製し、20%w/v混合物を連続して希釈して10、5、および2%w/v CNC混合物を調製する。
4. 25、20、10、5、および2%w/v CNC混合物を37°Cに10分間加熱します(図2A)。
5. ホットアガロース溶液に0.46gのD-マンイトールを加え(4.6%w/v)溶解します。
6. 混合した25、20、10、5、2%のCNC-PBS混合物をホットアガロース/D-マンニトール溶液と1:1比で混合し、最終的なCNC濃度を12.5、10、5、2.5、および1%w/vのヒドロゲル混合物に得る。
7. ステップ2.6で調製したソリューションの500 μL/wellを24ウェル培養プレートに4倍にして、室温で30分間放置して重合を容易にします(図2B)。
8. 1.1×の密度で¹⁰⁶ 細胞/mLの密度でBMMC懸濁液の1000 μLをマイクロピペットでヒドロゲル基板の上に慎重に重ね、ピペットの先端でゲルに触れないようにすることで、ゲル表面に損傷を与え、粒子を生成します。
9. 37°Cで18時間、滅菌インキュベーター(5%_CO2、加湿雰囲気)でヒドロゲル基板上のBMMCsをインキュベートします。

3. フローサイトメトリクス解析

1. PI排除によるBMMC生存率のフローサイトメトリック解析
   1. BMMCsを含む培地をCNC/アガロース/D-マン一型の上部から慎重に取り出し、ゲルを避け、細胞を1.5 mLマイクロフュージチューブに移します。
   2. 300× g で0.5%w/vの牛血清アルブミンを含むPBS(pH 7.4)で2回、PBS-0.5%w/v BSAの180 μLで¹⁰⁶ 細胞/mL ×の最終密度まで再懸濁します。細胞を96ウェルの丸底プレートに移します。
      注:0.2 μmの細孔サイズのシリンジフィルターを使用して、すべてのPBS-0.5%w/v BSAソリューションを2回殺菌し、4°Cで保存します。
   3. PBS-0.5%w/v BSAの20μL、またはPBS-0.5%w/v BSAで調製した10x PI(100 μg/mL)を細胞に加え、最終濃度の10 μg/mLに、4°Cで1時間または暗の室温で15分間インキュベートします。アルゴンイオンレーザー(488-514 nm)とバンドパスフィルターを搭載したフローサイトメーターを用いて蛍光データを取得し、578nmで蛍光発光を検出できるようにします。室温で30μL/minの流量でサンプルあたり20,000個のイベントを獲得します。以下の説明に従ってデータを分析します(セクション3.2.7-3.2.10)。
2. キット(CD117)およびFcεRI表面受容体発現に関するBMMCsのフローサイトメトリック解析
   1. BMMCsを含む培地をCNC/アガロース/D-マン一型の上部から慎重に取り出し、ゲルを避け、細胞を1.5 mLマイクロフュージチューブに移します。
   2. 300× g で濾過したPBS-0.5%BSAで2回、室温で5分間洗浄し、0.5%w/v BSA(1.5×¹⁰⁶ 細胞/mL)を含むPBSの180 μLで再懸濁します。再懸濁セルを96ウェルの丸底プレートに移します。
   3. 細胞に20μLの10倍の抗体作業溶液を加えて、それぞれ0.06 μg/mLのCD117(c-Kit)-フィコエリスリン(PE)と0.06 μg/mLのFcεRIα-allophycyanan(APC)を達成します。
      注:10x抗体の働く解決はフィルター殺菌されたPBS-0.5%w/v BSAで準備されなければならない。
   4. ラットIgG2b κアイソタイプコントロールPEまたはアルメニアハムスターIgGアイソタイプコントロールAPCのいずれかを含む10xアイソタイプ制御作動溶液の20μLを追加して、ステップ3.2.3で抗体-フルオロフォアコンジュゲートのいずれでも染色されていない細胞を含む細胞を含むウェルを分離します。
      注:アイソタイプコントロール、ラットIgG2bκアイソタイプコントロールPEおよびアルメニアハムスターIgGアイソタイプコントロールAPCは、BMMCへの抗体の非特異的な付着を制御するのに役立ちます。BMMCsは高レベルのFcRを発現しないため、アイソタイプ対照抗体で検出される高いバックグラウンド蛍光はまれである。フィルター滅菌されたPBS-0.5%w/v BSAで10xアイソタイプ制御の働く解決を準備する。
   5. 暗闇の中で4°Cで1時間96ウェルの丸底プレートをインキュベートします。
   6. 各ウェルに200μLの新鮮なPBS-0.5%w/v BSAバッファーを加え、遠心分離機を300× g で室温で5分間洗浄します。もう一度洗浄を繰り返します。細胞ペレットに触れることなく、上清を慎重に除去します。細胞ペレットが邪魔されないように、いくつかの上清を残します。
   7. 洗浄後、細胞を0.5%w/v BSAの0.5%、0.2μmの細孔サイズシリンジフィルターで2回無菌濾過したPBS(pH 7.4)の0.05%w/vナトリウムアジドで細胞を再懸濁します。ステップ3.1.3で上に概説したように、フローサイトメーターを使用してPEおよびAPC検出器チャネルの蛍光データを取得する。
   8. 「.fcs」という拡張子を持つフローサイトメトリックデータファイルを表示および分析できるソフトウェアを使用してデータを分析します。
   9. Y 軸に沿って X 軸と側面散布 (SSC) に沿って前方散布 (FSC) をプロットし、FSC 範囲 log10 1.5-5.0 および SSC 範囲の _log10 0.5-5.0 と、未処理のセルと未染色セルの SSC 範囲を持つゲートをプロットして解析を開始します。
      注: これは、低い FSC および SSC 値を持つセルデブリが解析から排除されるようにするのに役立ちます。マスト細胞は、単球やリンパ球などの他の免疫学的細胞型と比較すると、通常は非常に顆粒度(高SSC)細胞および大きな(高FSC)細胞である。
   10. 次に、色素、抗体、またはアイソタイプコントロールで染色された未処理サンプルのFSC対SSCドットプロットおよびヒストグラムプロファイルを生成し、使用される特定の抗体蛍光色素の発光スペクトルに従ってPEまたはAPCチャネルで平均蛍光強度(MFI)を得る。異なるCNC/アガロース/D-マンニトール基質でインキュベートされ、対応するアイソタイプコントロール、抗体、または色素で染色されたすべてのBMMCサンプルに同じゲートとパラメータのセットを適用します。MFI を取得します。
       注: 基本的に、未処理の染色サンプルのFSCとSSCドットプロットは、染色手順が細胞サイズ(FSCで測定)または粒度(SSCで測定)を変更しないように、ステップ3.2.9で得られる未処理/未染色サンプルと区別できないようにする必要があります(図3A(i)、(ii))。
   11. 4つの独立した実験から各サンプルの平均MFIと平均(SEM)の標準誤差を計算し、続いて統計分析ソフトウェアパッケージを使用してグラフを生成します。
   12. フローサイトメトリックデータ解析ソフトウェアでヒストグラムオーバーレイを準備します(図3B、4A(ii)、B(ii))。

4.3D FNC/ナトリウムアルギン酸ヒドロゲル基質のバイオプリンティング

注:この研究で使用される3Dバイオプリンターは、2つの独立した温度制御プリントヘッドを装備した空気圧押出システムです。ヒドロゲル足場を3Dバイオプリントするために使用される生体材料インクは、(a)コラーゲンと形態学的に類似した高水和性フィブリラーナノセルロース(FNC)、(b)アルギン酸ナトリウム、および(c)D-マンニトールで処方される。滅菌式のルアーロック円錐型バイオプリンティングノズル(22、25、または27G)を取り付けることができる3mLカートリッジに無菌ヒドロゲル懸濁液として供給されます。

1. このプロトコルはプリントヘッドと共に使用し、室温で印刷し、室温は20〜25 °Cです。
2. ヒドロゲル複合材料の安定性を維持するために、生体材料インクカートリッジを4°Cに保管してください。3Dバイオプリンティングを開始する前に、冷蔵庫からカートリッジ(3 mL)を取り出し、室温まで平衡化します。
3. インクレディブル+ 3Dバイオプリンターへのバイオインクカートリッジの取り付け
   1. 3 mL 生体材料インクカートリッジ(図5B(i))から青色のエンドキャップを取り外し、Bioinkカートリッジのluer-lockエンドに滅菌22G(青)の円錐型バイオプリンティングノズルを貼り付けます。
      注: カートリッジを取り付けて、その後のキャリブレーション手順を実行する前に、目的の円錐形バイオプリンティングノズルをバイオインクカートリッジに貼り付ける必要があります。
   2. プリントヘッド1(PH1、左)のエア圧供給チューブをカートリッジの反対側の端に接続し、取り付けた円錐形バイオプリンティングノズルを取り付けたカートリッジをPH1の垂直スロットに挿入します(図5A(ii))。
   3. プリントヘッドの下に円錐形のバイオプリンティングノズルを伸ばして、カートリッジをPH1にしっかりと取り付けます。指で締まるまで時計回りにPH1のネジを締めて、Bioinkカートリッジを所定の位置に固定します。3Dバイオプリンティングは、PH2を空のままにして実行できることに注意してください。
4. 3Dバイオプリンターのx-y-z軸のキャリブレーション
   1. 3Dバイオプリンターの電源を入れ、USB 2.0ケーブルを介して3Dバイオプリンターに接続されたPCでバイオプリンターソフトウェアを起動します。
   2. ソフトウェアで、 CONNECT ボタンをクリックして、ソフトウェアを3Dバイオプリンターと同期させます。
      メモ:プリントヘッドの紫外線発光ダイオードライトがオンとオフを繰り返し、HEPAフィルタファンが再びサイクルすると、同期は成功します。このソフトウェアは、次の手順で概説されているように、バイオプリンターの軸と開始点のキャリブレーションをホーミングする前に、3Dバイオプリンターと同期する必要があります。
   3. 3Dバイオプリンターのメインコントロールメニューの4つのオプションを観察する:(i) バイオプリントを準備する、(ii) バイオプリント、(iii) ユーティリティメニュー、および(iv) ステータススクリーン。[ BIOPRINT の準備] オプションを選択し、下にスクロールして [HOME AXES ] オプションを選択します。
      注:3Dバイオプリンターは、プリントヘッドアセンブリを左方向に動かして、 それぞれy軸と x軸をキャリブレーションします。その後、プリントヘッドが左端の位置に一時停止すると、プリントヘッド1に設置された円錐型バイオプリントノズルに合わせて Z軸キャリブレーションスイッチ(プリントベッド上)が接触するまで、プリントヘッドがプリントベッドを上げます。
   4. x-y-z 軸のキャリブレーションが正常に行われた後、プリントベッドのわずかな低下とプリントヘッドの位置をプリントベッドの中心点より上に移動します(図 5A(i))。
5. 24ウェルプレートでのバイオプリンティング用バイオプリンターの開始点キャリブレーション
   1. 密閉プラスチックラッピングから滅菌24ウェル培養プレートを取り出し、プレートの下側にあるウェルD1の中心点のドットを永久的なマーカーでマークします。プレートカバーを取り外し、プリントベッドの左前角に位置するウェルD1でプリントベッドに24ウェル培養プレートを置きます。
   2. メインコントロールメニューで、 ユーティリティメニューを 選択し、 軸の移動を選択します。PH1の円錐型バイオプリンティングノズルがウェルD1の下にマークされたドットの上に直接来るまで、プリントヘッドを x軸と y軸に沿って1mmずつ動かします。必要に応じて、プリントヘッドを0.1 mmずつ動かして、円錐形バイオプリンティングノズルの位置を細かく調整します。
   3. 3Dバイオプリンターのコントロールパネル画面に示されているように、ウェルD1の中心を直接上にしたときの円錐バイオプリンティングノズルの x座標と y座標を記録します。
      注: ここで使用する INKREDIBLE+ 3D バイオプリンターの場合、x 座標と y 座標は次のようになります。これらの座標は、24ウェルプレートでのバイオプリンティングのためのウェルD1の中心の出発点として機能します。
   4. 次に、プリントヘッド1に設置された円錐型バイオプリンティングノズルにウェルD1の底部がほぼ接触するまで、プリント盤を1mmずつ上げます。必要に応じて、プリントベッドの動きを0.1mmずつ微調整します(図5A(ii))。次に、 ユーティリティメニューから 「Z-AXISキャリブレーション 」オプションを選択し、「 Store Zキャリブレーション 」オプションを選択して確認します。
   5. メインメニューに戻り、 生物プリントの準備 オプションを選択します。スクロールダウンして、[ CALIBRATE Z ]オプションを選択します。
      メモ:3Dバイオプリンタは、Z軸キャリブレーションを正常に実行すると、プリントベッドを下げます(図5A(iii))。
6. 正しい開始点座標を使用して 24 ウェルプレート G コード ファイルを更新する
   1. 提供された24ウェルプレート幾何コード(Gコード)ファイルをバイオプリンターソフトウェア(補足ファイル1)で開きます。
      注: この 24 ウェル G コード ファイルは、各ウェルに 2 層 5 x 5 x 1 mm の直線構造を印刷するコードを記述します (図 5C(i)、(iii) )。提供されたGコードファイルは、任意の3Dバイオプリンティングソフトウェアで使用することができます。
   2. G コード ファイルの 1 行目が G0 X-50.0 Y-33.5 と書かれています。D1の中心位置ウェル。行 1 の x 座標 と y 座標を、ステップ 4.5.3 で取得した値で更新します。 D1の中心位置ウェル。ファイルを新しい名前で保存します。
      注:この手順は、使用されている特定の3DバイオプリンタのXY座標に基づいて、出力が井戸D1の中心で開始されるようにGコードファイルを較正するのに役立ちます。この方法は、押し出し 3D バイオプリンターで印刷するための 24 ウェルプレート G コード ファイルを校正するために使用できます。本研究の目的のために、24ウェルプレートの左半分、すなわち、ウェルA1-3、B1-3、C1-3、およびD1-3のみが印刷された。3 x 4 グリッドでの 2 層 5 x 5 x 1 mm の直線構造の印刷をエンコードする別の G コード ファイルも提供されています (補足ファイル 2、図 5C(ii))。
7. プリントヘッド1(PH1)の押出圧力の調整
   1. 空気圧ポンプがINKREDIBLE+ 3Dバイオプリンターの後部空気取り口にしっかりと接続されていることを確認し、空気圧ポンプをオンにします。
   2. INKREDIBLE+ 3Dバイオプリンターの右側にある前方制御ノブを引き出します。
      メモ:フォワードコントロールノブはPH1の圧力を調整し、リアコントロールノブはPH2の圧力を調整します。
   3. バイオプリンターの前面にあるPH1とPH2のデジタル圧力計を観察し、それぞれ0kPa近くを読みます。PH1の左ゲージに示された圧力が12 kPaに達するまで、前方制御ノブを時計回りにゆっくりと回転させます(図5A(iii))。
   4. 折り紙または防水の一部を、取り付けたカートリッジの印刷ノズルの下にシールフィルムを置き、印刷ノズルに触れないように注意してください。
   5. 3Dバイオプリンターのメインコントロールメニューから、 BIOPRINTを準備するを選択します。
   6. [ PH1 をオンにする] に移動して選択します。生体材料インクが印刷ノズルから押し出しを開始することに注意してください。必要に応じて、生体材料インクが連続フィラメントに押し出されるまでコントロールノブを時計回りに回転させることで押出圧を高め、新しい圧力設定を記録します。生体材料インクの無駄遣いを避けるために迅速に作業します。
   7. [OFF OFF PH1] を選択して生体材料インクの押し出しを停止し、押し出された生体材料インクを含むティッシュペーパーまたはフィルムをプリントベッドから取り出し、バイオプリンターのドアを閉じます。
      注:3Dバイオプリンタは、Gコードファイルの指示に従って、印刷中にPH1に空気圧供給を自動的にオンにします。
8. 24ウェルプレート形式の直流ヒドロゲル基板の3Dバイオプリンティング
   1. 3Dバイオプリンターのメインコントロールメニューから、 ユーティリティメニューを選択します。ナビゲーションし、印刷用の3DバイオプリンターにGコードファイルを送信するバイオプリンターソフトウェアを許可する 無効SD PRINTを選択します。
   2. バイオプリンターソフトウェアの LOAD ボタンをクリックし、ステップ 4.6.2 で保存された更新された 24 ウェルプレート G コード ファイルを選択します。
   3. ソフトウェアの右側のコントロールパネルで、 PRINT PREVIEW タブを選択し、 プリント ボタンをクリックして、D1でバイオプリントを開始します。
      注:3 x 4 グリッドウェルプレートGコードファイルを使用する場合、バイオプリンティングは、24 ウェルプレート(図5C(ii)D)のウェル A3 で終了します。
   4. 直流構造のバイオプリンティングが完了したら、蓋で24ウェルプレートを覆い、クラスIIのバイオセーフティキャビネットに移動します。
   5. 各直線構造を無菌50 mM _CaCl2 溶液(図5B(ii)))の2滴に浸し、室温で5分間インキュベートします。
      注:これは、アルギン酸ポリマー鎖を^Ca2+ イオンとイオン的に架橋し、直流構造が構造的完全性を維持できるようにする役割を果たします。
   6. _CaCl2溶液を各構成体から慎重に吸引し、1xPBS(pH 7.4)の1mLに1回リンスして過剰な_CaCl2を除去する(図5D)。
   7. バイオプリントヒドロゲル構築物の脱水を防ぐために、BMMCsが構築物に播種される準備が整うまで、新鮮な1x PBSで3Dバイオプリント直行構造を維持します(図5D)。

5. 3Dバイオプリント直鎖足場と生存率試験におけるBMMCsのインキュベーション

1. 3Dバイオプリント直鎖ヒドロゲル足場におけるBMMCsのインキュベーション
   1. BMMCsの種子アリコートは、3Dバイオプリント直鎖足場上の4つの異なる期間(例えば、6、18、24、および48時間)で、すべての治療が同時に終了するようにする。未処理のコントロールと同じ期間、三重に三重にシードされたBMMCsを使用します。
   2. 無菌でT175 ^cm2 培養フラスコから無菌50 mL円錐管にBMMCsを移し、200× g でBMMCsを室温で5分間ペレットします。
   3. IL-3の20 ng/mLを含む新鮮な完全RPMI培地のペレットを50mLに再懸濁し、マシトメーターを用いてトリパンブルー染色BMMCsのアリコートを数えて生細胞密度を計算する。
   4. ステップ5.1.3で計算した細胞密度に基づいて、106個の細胞/mLの最終密度でBMMC懸濁液の6mLアリコートを調製^× 。
   5. 48時間インキュベーションセットアップの場合、3Dバイオプリント直鎖式ヒドロゲル足場を含むウェルA1-3からPBSを吸引し、ピペット1mLのBMMC(1×¹⁰⁶ 細胞/mL)懸濁液を各ウェルに浸す。また、ピペット1mLのBMMC(1×¹⁰⁶ 細胞/mL)は、未治療のコントロールとして機能するバイオプリント構造なしでA4-6のウェルに懸濁液を含む。24、18、および6時間の処理期間に対してBMMCでの播種に適切な時間が達するまで脱水を防ぐために、添加剤なしでRPMIにバイオプリント足場(B1-3、C1-3、D1-3)を含む残りのウェルをインキュベートします。24、18、および6時間のタイムポイントのBMMCsで播種するための適切な時間に達するまで、PBSの1 mLでバイオプリント足場(B4-6、C4-6、D4-6)のない井戸を充填します。
   6. 24ウェルプレートを37°Cで5%_CO2 加湿雰囲気でインキュベートします。
   7. 24時間インキュベーションの設定については、ウェルB1-6から既存の培地/緩衝液を吸引し、BMMCの1mL(1×¹⁰⁶ 細胞/mL)懸濁液をこれらのウェルに浸す。プレートをインキュベーターに戻します。
   8. 18時間のインキュベーション設定については、既存の培養培地/緩衝液をウェルC1-6から吸引し、BMMCの1mL(1×¹⁰⁶ 細胞/mL)懸濁液をこれらのウェルに浸す。プレートをインキュベーターに戻します。
   9. 6時間インキュベーションの設定については、既存の培養培地/緩衝液をウェルD1-6から吸引し、BMMCの1mL(1×¹⁰⁶ 細胞/mL)懸濁液をこれらのウェルに浸す。プレートをインキュベーターに戻します。
   10. インキュベーション終了の場合、(i)PI染色および分析のための24ウェルプレートの各ウェルからサンプルを分配し、(ii)XTT細胞生存アッセイ、および(iii)LDH放出アッセイを行います。したがって、ラウンドボトム96ウェルプレートと必要な1.5 mLマイクロフュージチューブがインキュベーションの終点の前に十分にラベル付けされていることを確認してください。
2. XTT代謝アッセイ用細胞サンプリング
   1. 各ウェル内の培養培地中のBMMCsを徹底的に再中断し、3Dバイオプリントヒドロゲル足場を損傷および断片化しないように注意する。
   2. 均質なBMMC懸濁液の40μLを各ウェルから無菌で無菌1.5 mLマイクロフュージチューブに移し、760 μLの新鮮な完全RPMI培地(最終体積= 800 μL)を含み、渦を短時間混合します。
   3. 希釈されたBMMC懸濁液の100 μLを3重に塗布し、マイクロプレート分光光度計で吸光度測定( 材料表を参照)を記録するのに適した平底96ウェルマイクロティタープレートに塗布します。
   4. マルチチャネルマイクロピペットを使用して、BMMC細胞懸濁液を含む各ウェルにXTT作業溶液の50 μLを分配します。
      注:XTT試薬5 mLと100 μLの電子結合試薬を混合して、XTTの動作溶液を調製してください。これらの成分は-20°Cから37°Cの水浴で使用前に解凍してください。
   5. 96ウェルプレートを37°Cで5%_CO2 の加湿雰囲気で24時間インキュベートします。
   6. インキュベーターの最後に、インキュベーターから96ウェルプレートを取り出し、室温まで冷却します。650 nmの背景減算で450 nmのマイクロプレート分光光度計に吸光度値を記録します。
3. 乳酸脱水素酵素(LDH)アッセイの上清サンプリング
   1. 残りのBMMC懸濁液(960 μL)を24ウェルプレートの各ウェルからミクロフュージチューブに移し、細胞を室温で5分間200× g でペレットします。
   2. ピペットは、各マイクロフュージチューブから96ウェルマイクロチターフラットボトムプレートに細胞培養上清の3つの100 μLアリコート。各マイクロフュージチューブから残った上澄み物を捨て、セクション5.4.1-5.4.8でPIでさらに染色するためにBMMCペレットを保持します。
   3. 上清の各100 μLアリコートにLDH作業溶液のピペット50 μL。
      注:LDHアッセイ試薬の調製については 、補足ファイル3 を参照してください。
   4. 室温で暗闇の中で1時間インキュベートする。
   5. 各ウェルに1M酢酸のピペット50μLを反応を停止する。
   6. 680 nmの背景減算で490 nmのマイクロプレート分光光度計に吸光度値を記録します。
4. ヨウ化プロピジウム(PI)排除によるBMMC生存率のフロー細胞量分析
   1. BMMCペレットをフローウォッシュバッファー(0.5%w/v BSAを含むPBS[pH 7.4])、セルを室温で5分間300× g でペレット化します。
   2. フローウォッシュバッファで洗浄ステップをもう一度繰り返します。
   3. フロー洗浄バッファーの400 μLで各BMMCペレットを再懸濁します。
      注:バイオプリントヒドロゲル基板にインキュベートされた12個のBMMCサンプル(三重化の4つの時点)と12個のBMMCサンプルがバイオプリント構造なしで井戸にインキュベートされる(3重化の4つの時間ポイント)の合計で24の再中断されたBMMCサンプルがあります。
   4. ラウンドボトム96ウェルマイクロタイタープレートで、ピペット20 μLのフロー洗浄バッファーをウェルA1-12およびB1-12に洗浄します。同じマイクロタイタープレートで、ピペット20 μLの10x PI染色液(フロー洗浄バッファ内の100 μg/mL PI)をウェルC1-12およびD1-12に入れます。
   5. バイオプリントヒドロゲル基板上でインキュベートされた12個のBMMCサンプルの180 μLをウェル A1-12 (ウェルあたり1サンプル)に分配します。バイオプリントヒドロゲル基板を使用せずにインキュベートされた12個のBMMCサンプルの180 μLをウェル B1-12 (ウェルあたり1サンプル)に分配します。各治療条件の未染色コントロールとしてウェルA1-12およびB1-12に分配されたBMMCサンプルを使用してください(合計24コントロール)。
   6. バイオプリントコンストラクトでインキュベートされた12個のBMMCサンプルの180 μLをウェル C1-12 (ウェルあたり1サンプル)に分配します。バイオプリント構造なしでインキュベートされた12個のBMMCサンプルの180 μLをウェル D1-12 (ウェルあたり1サンプル)に分配します。
      注:ウェルC1-12およびD1-12のBMMCサンプルは、10 μg/mL(合計24染色サンプル)の最終的な有効PI濃度で染色されます。
   7. プレートを4°Cで1時間、または暗闇の中で室温で15分間インキュベートします。
   8. インキュベーション期間の終わりに、前にセクション3.1に記載されているように、フローサイトメーター上のマイクロティタープレートから直接サンプルを分析します。

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結果

生体材料インクまたは培養基質の最も重要な特徴の1つは、生体適合性です。主として、基質は細胞死を誘発してはならない。細胞の生存率と壊死を定量化するいくつかのマイクロタイターベースおよびフローサイトメトリック法があります。しかし、これらの方法は、ヒドロゲルマトリックス内に埋め込まれた細胞を分析するのに適していません。このプロトコルにおいて、上記の制限は、...

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ディスカッション

3Dバイオミメティック組織の製造には、細胞外マトリックスの成分を模倣するバイオインクと細胞内 組織 の生理学的類似体を作り出すバイオインクの合併が成功する必要があります。これは、生理学的バイオミメティック組織を作製する際に、原細胞の使用を必要とし、形質転換されていない細胞である。しかし、マスト細胞のような一次免疫学的細胞は、特に生体インクマトリック...

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資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
A
Acetic Acid (glacial)	Sigma Aldrich	AX0074-6
Agarose (OmniPur)	EMD Millipore Corporation	2125-500GM
Armenian Hamster IgG Isotype Control, APC (Clone: eBio299Arm)	Thermo Fisher Scientific	17-4888-82
B
b-Mercaptoethanol	Fisher Scientific	O3446I-100
b-Nicotinamide adenine dinucleotide sodium salt (NAD)	Sigma Aldrich	N0632-5G
BD 5 mL Syringe (Luer-Lok Tip)	BD	309646
BD PrecisionGlide Needle 26G x 1/2 in	BD	305111
BioLite 24 Well Multidish	Thermo Fisher Scientific	930-186
BioLite 96 Well Multidish	Thermo Fisher Scientific	130-188
BioLite 175 cm2 Flask Vented	Thermo Fisher Scientific	130-191
Biosafety Cabinet Class II	Microzone Corp., Canada	BK-2-6-B3
BSA, Fraction V (OmniPur)	EMD Millipore Corporation	2930-100GM
C
C57BL/6 mice	The Jackson Laboratory	000664
CD117 (c-Kit) Monoclonal Antibody, PE (Clone: 2B8)	Thermo Fisher Scientific	12-1171-82
CELLINK BIOINK (3 x 3 mL Cartridge)	CELLINK LLC	IK1020000303
CELLINK CaCl2 Crosslinking Agent - Sterile Bottle 1 x 60 mL	CELLINK LLC	CL1010006001
CELLINK Empty Cartridges 3cc with End and Tip Caps	CELLINK LLC	CSC0103000102
CELLINK HeartWare for PC	CELLINK LLC	Version 2.4.1
CELLINK INKREDIBLE+ 3D BIOPRINTER	CELLINK LLC	S-10003-001
CELLINK Sterile Standard Conical Bioprinting Nozzles 22G	CELLINK LLC	NZ4220005001
CELLINK Sterile Standard Conical Bioprinting Nozzles 25G	CELLINK LLC	NZ4250005001
CELLINK Sterile Standard Conical Bioprinting Nozzles 27G	CELLINK LLC	NZ4270005001
Cell Proliferation Kit II (XTT) (Roche)	Sigma Aldrich	11465015001
Centrifuge (Benchtop)	Eppendorf	5804R
Corning Costar 96 Well Clear Flat-Bottom Non-Treated PS Microplate	Sigma Aldrich	CLS3370
CO2 Incubator	Binder GmbH, Germany	9040-0113
CytoFLEX Flow Cytometer	Beckman Coulter	A00-1-1102
D
D-mannitol (MilliporeSigma Calbiochem)	Fisher Scientific	44-390-7100GM
F
Falcon 15 mL Polystyrene Conical Tubes, Sterile	Corning	352095
Falcon 50 mL Polystyrene Conical Tubes, Sterile	Corning	352070
FceR1 alpha Monoclonal Antibody, APC (Clone: MAR-1)	Thermo Fisher Scientific	17-5898-82
Fetal Bovine Serum (FBS), qualified, heat inactivated	Thermo Fisher Scientific	12484028
FlowJo Software	Becton Dickinson & Co. USA	Version 10.6.2
G
GraphPad Prism	GraphPad Software, LLC	Version 8.4.3
H
Hemacytometer (Improved Neubauer 0.1 mmm deep levy)	VWR	15170-208
HEPES Sodium Salt	Fisher Scientific	BP410-500
I
Iodonitrotetrazolium chloride (INT)	Sigma Aldrich	I10406-5G
L
L-Glutamine 200 mM (Gibco)	Thermo Fisher Scientific	25030-081
Lithium L-lactate	Sigma Aldrich	L2250-100G
M
MEM Non-Essential Amino Acids 100 mL 100x (Gibco)	Thermo Fisher Scientific	11140-050
1-Methoxy-5-methylphenazinium methyl sulfate (MPMS)	Sigma Aldrich	M8640
Microtubes (1.7 mL clear)	Axygen	MCT-175-C
Microtubes (2.0 mL clear)	Axygen	MCT-200-C
MilliQ Academic (for producing MilliQ ultrapure water)	Millipore	ZMQS60001
N
Nalgene Rapid-Flow 90 mm Filter Unit (0.2 mm Pore size, 500 mL)	Thermo Fisher Scientific	566-0020
Nalgene Syringe filter (0.2 mm PES, 25 mm)	Thermo Fisher Scientific	725-2520
P
Penicillin Streptomycin 100 mL (Gibco)	Thermo Fisher Scientific	15140-122
PBS pH 7.4, No Calcium/Magnesium, 500 mL (Gibco)	Thermo Fisher Scientific	10010-023
Propidium iodide, 1.0 mg/mL (Invitrogen)	Thermo Fisher Scientific	P3566
R
Rat IgG2b kappa Isotype Control, PE (Clone: eB149/10H5)	Thermo Fisher Scientific	12-4031-82
Recombinant Murine IL-3	PeproTech, Inc.	213-13
RPMI-1640 Medium 1X + 2.05 mM L-Glutamine (HyClone)	GE Healthcare	SH30027.01
S
Sarstedt 96 well round base PS transparent micro test plate (82.1582.001)	Fisher Scientific	NC9913213
Sodium Azide, 500 g	Fisher Scientific	BP922I-500
Sodium Pyruvate (100 mM) 100X (Gibco)	Thermo Fisher Scientific	11360-070
T
Tris Base (2-amino-2(hydroxymethyl)-1,3-propanediol)	Sigma Aldrich	252859
Trypan Blue solution (0.4%, for microscopy)	Sigma Aldrich	93595
V
VARIOSKAN LUX Microplate Spectrophotometer (Type: 3020)	Thermo Fisher Scientific	VLBL00D0