ショウジョウバエ成人行動研究のための調整可能な高精細画像化システム

要約

このプロトコルは、単純な成人 ショウジョウバエ 行動観察室を作る方法、および比較的簡単で手頃な方法を通じて観察室で異なる種類のフルーツハエの形態または行動の高精細写真/ビデオを撮る方法を説明する。

要約

ショウジョウバエメラノガスター は、生物学的研究において非常に強力なモデルですが、写真やビデオ撮影には悪いモデルです。この論文では、ハエの挙動や形態を観察し、文書化するための、シンプルで効果的な方法について述べている。ハエは半透明の観測室c.aに置かれた。Ø15 x 5mm(中に食品なし)またはØ15 x 12 mm(中に8mmの高さの食品を含む)。紫外線(UV)/クリアフィルターで高い透過率をカバーした後、チャンバーを5-50倍ズームステレオ顕微鏡の下に置き、ミニ発光ダイオード(LED)ビデオライトを顕微鏡の両側に置いて、均一で柔らかく、明るく、ほぼ影のない光を得るためにチャンバを照らしました。その後、3~5倍光学ズームを搭載したコンパクトデジタルカメラを、1080Pの高精細または高解像度のビデオ(フレームレート≥30fps)で記録し、顕微鏡の接眼レンズにブラケットを介して接続し、接眼レンズを通して写真やビデオを撮影しました。ズームステレオ顕微鏡のズームノブを調整することで、ハエを追跡し、必要に応じてパノラマまたは詳細なクローズアップ画像を撮影することは非常に簡単でしたが、カメラは顕微鏡の下ですべてを記録しました。ハエはチャンバー内の任意の位置にとどまることができるので、観察され、すべての方向から記録することができます。撮影した写真やビデオは画質が良いです。この方法は、科学的研究と教育の両方に使用することができます。

概要

ショウジョウバエメラノガスター は、生物学的研究における優れたモデルです。しかし、カメラやビデオカメラには小さすぎて、複合顕微鏡^では大きすぎるため、写真撮影やビデオ撮影には悪いモデルです。文献に記載されている優れた研究にもかかわらず、ほとんどの研究は、記述されているハエの挙動を説明する明確で鋭い写真ではなく、ぼやけた不明瞭な画像のみを提供してきました。さらに、フライの行動は広範囲に研究されていますが(例えば、求愛と戦い)、これらの論文のほとんどは、読者に彼らの研究を説明するためにイラストを使用しています。

本稿では、シンプルで経済的なアプローチについて述べている。この方法を用いると、 ショウジョウバエ の様々な挙動を観察できるだけでなく、ステレオズーム顕微鏡下で観察できる細部もすべて鮮明に記録できます。もちろん、この方法は、彼らが睡眠または半睡眠状態に入るときのように、ハエの形態を記録するために使用することができ、静止モデルは、ユーザーがフィールド写真の拡張深さを得るために、異なる焦点面を持つ写真や写真のスタックを撮ることができます。これらの方法は、複雑な技術や高価な機器、あるいは優れた手作業のスキルなしで実現することができます。

この記事のビデオ コンポーネントは、ハエのいくつかの典型的な動作のビデオを示しています。これらのビデオを表示する目的は 2 つあります: 1 つは、キャプチャできる内容を視聴者に知らせ、この方法を使用して得られる画質を提示することです。もう一つは 、ショウジョウバエ に興味を持っている新入生に、これまでのところハエの行動を実際に観察する機会を持たなかったが、実際にハエの行動を理解する機会を持っていない(例えば、礼儀、戦いなど)、これらの明確なビデオを通して、イラストやぼやけた画像を通して。

補足ビデオ:フルーツフライの動作:このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

プロトコル

1. 観測・文書化システムの構築

注: フライ挙動の観測/文書化システムを構築するために必要な材料を 図 1に示し、完成したシステムを 図 2に示します。システムを構築するためのプロトコルとその使用方法を以下に説明します。

1. fly behavior observation cハンバー (FBOC) を作成します。
   1. サイズ径(Ø)15mm×20mmのFBOCを作るために、半 透明(透明ではない) 小さな容器を入手してください。FBOCを作るためにサイズ~Ø17 mm x 22mmの半透明のペットボトルキャップを使用するか、5 mLピペットチップの厚い端から〜17mmの部分を切ってFBOCを作ります。
   2. 1%の寒天をFBOCに注ぎ、深さを調整します。食品をFBOCに入れる必要がある場合(食品の調製方法については参照)、寒天を注ぎ、12mmの深さを得る。食べ物をFBOCに入れる必要がない場合は、寒天を5mmの深さまで注ぎ、フルーツフライの行方をより簡単に追跡します。
   3. FBOCを作るためにピペットチップを使用する場合は、カットオフピペットチップセクションをØ35 mmまたはØ60 mmペトリ皿に入れます。1%寒天ゲルをペトリ皿に5mmの厚さに注ぎ、寒天が固化するのを待ち、FBOCの底部を密封します。次に、所望の厚さにFBOCに寒天ゲルを注ぎます。
2. 60 mm x 60 mm x 15 mm のエチルアミンフォームシートの中央に、FBOC と同じ直径のエチルアミンフォームシートの中央に約 10 mm の深さの穴をボーリングして、FBOC ベースを作ります。穴に FBOC を挿入します。
   注:FBOCベースは、FBOCを安定させ、転倒を防ぎ、観察とビデオ撮影中にハエを追跡するためにFBOCの動きを容易にします。
3. 必要に応じて、酵母培地^2、人工食餌^3、または純粋なスクロース/グルコース(ゲル化剤として1%寒天を使用)で、観察の目的に応じてフライフードを作ります。
   1. ハエが餌を与えているかどうかを視覚的に判断し、ハエとその環境とのコントラストを高めるには、食品に食品染料( 材料表を参照)を加え、最終的な濃度12.5mg/100mLにします。
      注:ハエの腹部は、餌を与えた直後に色を変えます。
   2. 準備した食べ物をペトリ皿に8mmの高さに注ぎます。固化後、カミソリの刃を使用して、サイズ8mm x 4mm x 8mmの食品を切り取り、プラスチック片(キャンディラッパーなど)に置きます。
   3. 図 3に示すように、四角形のピラミッドまたは四角形の錐体ピラミッドに食品をカットして、ハエがランダムに餌を上げる時に、異なる角度からハエの挙動を観察し、記録できるようにします。食品の下のプラスチックを使用して、食品中の染料がFBOCで寒天に拡散するのを防ぎます。ピンセットを使用して、FBOCの中央に食品を配置します。
4. いくつかの行動観察では、ハエが事前に飢えているかどうかを確認してください。1%寒天ゲル(1g寒天/100mL水、プロピオン酸600μL)を清潔な空のボトルに1〜2cmの厚さに注ぎ、室温で1〜2時間置きます。ボトルにハエを移し、≥36時間25 °Cに置きます。
   注:ハエは寒天ゲルから水を吸収することができるので、時間^4、5に水を追加する必要はありません。
5. 1つ以上のハエを吸引器を使用してFBOCに移します。アスピレーターを使用することが困難である場合は、砕氷中のハエを冷やして不活性化し、アイスパックでソートし^、前述の6のようにFBOCに移します。
   注:凍結の使用は非常にハエの移動を容易にします。冷たいハエは_、CO2で麻酔をしたハエよりもはるかに速く、1分以内に意識を取り戻すことができます。寒さはハエの挙動に有害な影響を及ぼす可能性があるが、例えば、ハエの交尾遅延時間が5分⁷ 分から40分⁸分に増加し、ハエの行動(求愛行動など)は変わらない。したがって、冷やす方法は、一般的な観察(例えば、実験を教える)およびビデオ撮影のためにハエを移すために使用され得る。しかし、観測が科学的な報告書で使用される場合は、ハエを麻酔にさらさないことは強く推奨されます。
6. ハエをFBOCに移した後、カメラがFBOC複合体を形成するための30〜40mmのUV/クリアフィルターでカバーします(図4)。観察のために、FBOC複合体を実体顕微鏡の下に置きます。
   注:鮮明で鮮明な画像を得るためには、高い光透過率(>98%)とフレアの低減を備えた高品質のUV/クリアフィルタを使用することを強くお勧めします。前に説明したいくつかの提案を参照してください^9,10;高価なフィルターを購入する必要はありませんが、ペトリ皿の蓋などのガラスでFBOCを覆うことは避けてください。
7. FBOC を照らします。ミニ LED ビデオライトを取り付けて、ホットシューマウントスタンドをフラッシュし、FBOC の左右に配置します (図 2)。LEDライトを点灯し、明るさを100%、色温度を5000-5600Kに設定します。
   注:調光可能な5600 K色温度のミニLEDビデオライトは、均一で明るく、ほぼ影のない照明を提供できます。ステレオ顕微鏡に付属のトップ光源を使用して、LEDリングライト照明器、または光ファイバー照明器は満足のいく結果を得られなかった。LEDビデオライトには連続電源(変圧器)を使用するのが最適です。
8. フライ挙動の観察とビデオ撮影
   1. LEDビデオライトをオンにし、FBOCの端が肉眼ではっきりと見えるまでステレオズーム顕微鏡を調整します。FBOC を視野の中心に移動します。
   2. ユニバーサル望遠鏡デジタルカメラアダプタのクランプをステレオ顕微鏡の接眼部に取り付け、カメラ取付ネジとカメラ固定ネジを交互に回してコンパクトなデジタルカメラをアダプタにしっかりと取り付けます(図2)。
   3. デジタルカメラの電源を入れ、カメラの液晶画面の明るい円形の視野の中央にFBOCエッジがはっきりと表示されるまで、水平/垂直微調整ノブを回します。モードダイヤルを 絞り込み優先オートモードにして、マルチセレクタで フォーカス を押し、[ マクロクローズアップ]を選択し 、[OK] ボタンを押します。ズームスイッチを広角端から望遠端に移動し、中央部がLCD画面全体に表示されるまで、円形の画像を拡大します。 ムービー録音 ボタンを押して録音を開始します(ボタンをもう一度押して録音を終了します)。
      注:画像が暗すぎるか明るすぎる場合は、コントロールダイヤルの側面を露出補正アイコン(図1)の近くで押し、カメラが提案する露出値(EV)を変更して目的の効果を得るようにダイヤルを回転させます。正の EV はイメージを明るくし、負の EV はイメージを暗くします。画像は、ビネットなしで、均一で明るくなければなりません。
   4. FBOCのハエがはっきりと見えるまで顕微鏡のフォーカスノブを回します。観察やビデオ録画に関心のあるフライの動作を選択します。ズームノブを回してズームイン/ズームアウトし、観察やビデオ録画に必要な倍率を達成します。
      注:この接眼眼を通して顕微鏡下で画像を撮影する方法は、接眼眼を用いたあらゆる顕微鏡に適用可能です。実験結果の写真を撮るには、JPEGよりもRAW画像ファイルが好ましいので、RAW形式で撮影できるカメラを使用します。カメラのLCDスクリーンをディスプレイとして使用してフルーツハエの挙動を観察し、ステレオズーム顕微鏡が少なくとも5〜50倍のズームを持っていることを確認します。

2. 飛行行動の観察とビデオ撮影のためのプロトコル

1. ハエの準備
   1. ハエを湿度60%、明暗サイクル12時間で25°Cでコーンミール培地で培養します。観察のために孵化から6日以内にハエを集める(求愛と戦闘行動を除く)。
      注:ここでは、培地は1000mLの水、コーンミール粉105g、スクロース75g、寒天15g、酵母粉末40g、10%メチルパラベン(95%エタノール中のw/v)の28mL、プロピオン酸6.25mLで構成されていました。
2. 冷え込みによる麻酔から意識を取り戻す
   1. 前述のようにハエを冷やします。⁶ ショ ウジョウバエ をアイスボックスからピンセットを使用してFBOCに移します。ビデオで、非アクティブから通常の姿勢まで、フライのプロセスを記録します。
3. 睡眠、授乳、排泄、社会的行動を飛ぶ
   1. スターブは36時間飛ぶ。4-6フルーツハエをステンドフードでFBOCに移します。動画で飛行動作を観察し、記録します。
      注:5分以上動かないままのハエは、スリープ動作¹¹を表示します。ショウジョウバエは、食べ物や垂直FBOC壁で眠ることができます(身体は観察室の壁に垂直です)。睡眠中は体が動かないが、腹部は起伏を見ることができる。餌挙動は、ハエがプロボシスを伸ばし、絶えず吸いながら食べ物の上を移動し、腹部が青くなると現れます。グループ給餌やその他の活動の間、フルーツハエは、他のフルーツハエの体に友好的に触れるのに足を伸ばします。これは社会的な行動です。
4. フライグルーミングの動作
   1. ⁶のようにハエを冷やす。冷凍ハエを寒天粉末に投げ、寒天粉末で覆うためにロールします。ハエをFBOCに移します。グルーミングの動作を観察し、記録します。
      注:フルーツフライが凍結から意識を取り戻すと、それはすぐにその体から寒天粉末を振り払い、その足^12、13でその体のすべての部分をきれいにします。また、授乳、求愛、その他の行動の間に、グルーミングの動作を見ることができます。
5. 求愛と戦闘行動を飛ばす
   1. 前に説明したように、雌とオスのハエを収集^{する 7}.ハエの求愛行動を観察するには、メスのハエとオスのハエをFBOCに入れ、6つの求愛(成功と失敗)の行動を観察し、記録します。
   2. ハエの戦闘行動を観察するには、FBOCに2人の雄を配置します。お互いに押し合い、押し合う行動を観察し、記録します。
6. フライ産卵行動
   1. 前に説明したように雌のハエを準備^{する 5}.4人のメスハエを食べ物と一緒にFBOCに移します。

結果

鮮明で鮮明な画像を撮るためのUVフィルターを通して撮影
実験室でのUVフィルターと普通のガラスの違いを観察するために簡単な実験を行います。フライ培養バイアルを取り、ストッパーを取り外し、ステレオ解剖顕微鏡の下に置き、UVフィルターとペトリ皿の蓋で(交互に)覆います。この2つのケースで撮影した写真を図5に示します。UVフィルターを通し?...

ディスカッション

光は写真とビデオ撮影の中心にあり、高品質の画像¹⁶を得るための決定的な要因です。ここでは、調整可能な明るさと色温度を持つ2つのLEDビデオライトを照明器として使用し、FBOCを作るために半透明の材料を選択しました。両側のLEDライトパネルは十分な明るさを提供し、半透明の材料は軟化し、散乱した光、最終的に不愉快な露出過多または露出不足の領域を生成するこ...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
compact camera, Nikon P310	Nikon		3-5x optical zoom, cam record 1080 P HD video
ethylamine foam			60 mm x 60 mm x 15 mm
Food Blue No 1		CAS 3844-45-9
mini LED lights and transformer	GODOX	LED-P120	have 5000-5600 K color temperature
small container (e.g. bottle cap)			about Ø 15 mm x 20 mm
UV / Clear filter			high-quality UV/Clear filter with high transmittance, 30-40 mm
zoom stereo microscope			5-50x zoom