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要約

マクロファージ由来の小細胞外小胞にPKH色素を標識し、髄腔内送達後の インビトロ および脊髄での取り込みを観察するプロトコルについて述べています。

要約

小細胞外小胞(sEV)は、全ての細胞によって分泌され、体液中に存在する50〜150nmの小胞である。sEVは、RNA、タンパク質、脂質などの生体分子をドナーからアクセプター細胞に移し、細胞間の主要なシグナル伝達メディエーターを作ります。中枢神経系(CNS)では、sEVは神経免疫相互作用を含む細胞間シグナル伝達を媒介することができる。sEV機能は 、in vitro と in vivoの両方のレシピエント細胞におけるラベル付きSEVの取り込み追跡によって研究することができます。本論文では、PKH膜色素を用いたRAW 264.7マクロファージ細胞のコンディション媒体からのsEVの標識について説明する。これは、Neuro-2a細胞と一次アストロサイトによって複数の時点で標識されたSEVの異なる濃度の取り込み を示しています。また、共焦点顕微鏡で可視化されたマウス脊髄ニューロン、アストロサイト、およびミクログリアでの脳内に送達されたsEVの取り込みも示されている。代表的な結果は、異なる細胞によるsEvの取り込みにおける時間依存的な変動を示し、脊髄へのsEv送達の成功を確認するのに役立つ。

概要

小細胞外小胞(sEV)は、50〜150nmのサイズ範囲を有するナノサイズの膜由来小胞である。それらはマルチ・シツル体(MVB)に由来し、MVBと原形質膜の融合時に細胞から放出される。sEVは、miRNA、mRNA、タンパク質、および生理活性脂質を含み、これらの分子は細胞間で細胞間通信の形で伝達される。sEVは、さまざまなエンドサイトー経路によってレシピエント細胞によって内部化することができ、そしてこのレシピエント細胞によるsEVの捕捉は、EVと標的細胞の両方の表面分子の認識によって媒介される1。

sEVは、アクセプター細胞の分子および表現型の変化を引き起こす能力、治療剤としての有用性、および貨物分子または薬理学的薬剤のキャリアとしての可能性のために関心を集めています。そのサイズが小さいため、sEvのイメージングとトラッキングは、特に 生体内 研究や臨床現場では困難です。したがって 、vitro および in vivo2でのバイオディストリビューションと追跡を支援するために、多くの方法が開発され、sEVを画像化しています。

sEV生体分布と標的細胞相互作用を研究する最も一般的な技術は、蛍光色素分子3、4、5、6、7でそれらを標識することを含む。EVは、最初は細胞を画像化するために一般的に使用された細胞膜色素で標識されました。これらの蛍光色素は、一般に、sEv上の目的とする脂質二重層またはタンパク質を染色する。いくつかの親油性染料は、DiR(1,1′-dioctadecyl-3,3,3′、3'テトラメチル酸トリカルボシアニンヨウ化物)、DiL(1、 1′-ジオクタデシル-3,3,3′,3',3'テトラメチル中カルボシアニン過塩素酸塩)およびDiD(1,1′ジオクタデシル-3,3,3,3-テトラメチルインドカルボシアニン4-クロロベンゼンスルホナテン酸塩)8,9,10,11.

PKH67やPKH26などの他の親油性染料は、蛍光性の高い極性ヘッド基と、任意の脂質構造に容易に補間し、長期の色素保持および安定な蛍光12をもたらす長い脂肪族炭化水素尾を有する。PKH色素はまた、VIVO13でEV特性の研究を可能にするEVにラベルを付けることができます。他の多くの色素は、脂質標識染料14およびカルボキシフルオレセインジアセテートスクシニミジルエステル(CFDA-SE)15、16およびカルセインアセトキシメチル(AM)エステル17のような細胞透過性染料を含む、蛍光顕微鏡およびフローサイトメトリーを用いてエキソソームを観察するために使用されてきた。

CNSにおける異なる細胞間のsEV媒介性クロストークの研究は、神経炎症性および神経変性疾患の病因に関する重要な洞察を提供した。例えば、ニューロンからのsEVは、β-アミロイドペプチドおよびリン酸化タウタンパク質を広め、アルツハイマー病19の病因を助けることができる。さらに、赤血球由来のEVは、大量のα-シヌクレインを含み、血液脳関門を越え、パーキンソン病変20に寄与する。sEVが生理学的障壁21 を横断し、生体分子を標的細胞に移す能力は、治療薬をCNS22に送達するための便利なツールとなる。

脊髄内の無数のCNS細胞によるsEV取り込みの視覚化は、様々な細胞源からの外因的に投与されたSEvの治療上の利点の評価と共に、機械学的研究を可能にする。本論文では、マクロファージ由来のsEvにラベルを付け、ニューロン、ミクログリア、アストロサイトによる腰椎脊髄における インビトロ および インビボで の取り込みを画像化し、可視化によるsEV送達を定性的に確認する方法論を説明する。

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プロトコル

注:すべての手順は、実験動物のケアと使用のためのNIHガイドに従って行われ、ドレクセル大学医学部の施設動物ケア&使用委員会によって承認されました。時限妊娠CD-1マウスは、アストロサイシン培養のために使用され、すべてのダムは含浸後15日後に受け取られた。12週齢のC57BL/6マウスを 生体内 取り込み実験に使用した。

1. RAW 264.7 マクロファージ細胞からのsEvの分離

  1. 10%のエキソソーム枯渇ウウシ胎児血清(FBS)および1%ペニシリンストレプトマイシン(ペンストレップ)を含むDMEMエキソソーム枯渇培地中の75cm2フラスコの培養生264.7細胞を24〜48時間培養する。
  2. 300 mL のコンディション中ミディアムと遠心分離機を 300 × g で 4 °C で 10 分間収集します。
  3. 上清と遠心分離機を2,000×gで20分間4°Cで回収します。
  4. 上清を遠心管に移し、遠心分離機を4°Cで12,000×gで35分間移動します。
  5. 上清を収集し、0.22 μmのシリンジフィルターを通してフィルターを取ります。
  6. 超遠心チューブと遠心分離機に、4°Cで110,000×gで80分間移します。
  7. 上清(エキソソーム枯渇培地)を保存し、1xリン酸緩衝生理食塩水(PBS)の2mLでペレットを再懸濁し、遠心分離機を110,000×gで4°Cで1時間保存します。
  8. ナノ粒子追跡解析(NTA)および透過電子顕微鏡(TEM)またはウェスタンブロッティング用の放射性免疫沈降アッセイ(RIPA)バッファーを使用して、さらに特性評価のためにPBSの100 μLでペレットを再懸濁します。

2. SEVの特徴付け

  1. ナノ粒子追跡解析(NTA)
    注:RAW 264.7細胞からの精製されたSEVのサイズ分布と粒子数/濃度をNTAで測定しました。
    1. フィルター処理されたPBSでsEvを希釈して、最適な追跡のために視野ごとに20〜60個の小胞を得る。
    2. 一定の流量のシリンジポンプを使用して、希釈したサンプルをフローセルに導入します。
    3. 30 s の 3-5 ビデオを撮影します。シャッタースピードとゲインを設定し、カメラの設定を手動で絞り込んで、表示可能で追跡および解析できる小胞の最大数を設定します。
    4. 各記録間でサンプルを進めて、複製測定を行います。NTA取得後の設定を最適化し、サンプル間の設定を一定に保ちます。
    5. NTAソフトウェアを使用して各ビデオを分析し、小胞の平均サイズと濃度を取得します。
    6. 一貫性を保つ、同一のシステム設定ですべてのNTA測定を実行します。
  2. ウェスタンブロット
    1. メーカーの指示に従ってタンパク質アッセイキットを使用して、sEV、細胞ライゼ、エキソソーム枯渇培地中のタンパク質総量を定量化します。
    2. 細胞ライセート調製のために、生264.7細胞を75cm2フラスコで80〜90%コンフルエントになるまで培養する。0.25%のトリプシンで細胞を10〜15分間取り外し、培養培地でトリプシンを中和し、400×gで5分間回転させて細胞をペレット化します。新鮮な成長培地で細胞を再懸濁します。
    3. ヘモサイトメーターを使用して細胞を数え、1×106細胞を別のチューブに移します。上記と同じ遠心分離条件を使用してPBSで細胞を2回洗浄し、最終的なスピンから細胞ペレットに50μLのリシスバッファー(プロテアーゼ阻害剤カクテルを加えたRIPAバッファー)を加えます。
    4. 細胞を渦を起させ、20分間氷の上に置きます。混合物を4°Cで30分間10,000×gで遠心分離し、上清(すなわち、ライセート)を新鮮なマイクロ遠心チューブに集め、使用するまで−80°Cに保ちます。
    5. エキソソームで枯渇した培地2 mLを、3 kDaカットオフ遠心フィルターを使用して100 μLに濃縮してから、タンパク質の量を定量化します。sevとリシスバッファーを1:1比、渦を30 sで混合し、氷上で15分間インキュベートしてタンパク質の量を定量化します。
    6. sEVのタンパク質(2 μg)、RAW 264.7細胞リセート、エキソソーム枯渇培地をサンプルバッファーを減らして混合します。
    7. 95°Cで5分間サンプルを変性させ、5分間氷の上に置き、10,000×gで2分間回転 させます。サンプルを12%トリスグリシンプロテインゲルにロードし、125 Vで45分間ゲルを実行します。
    8. 25Vで25時間、ポリビニリデンジフッ化物(PVDF)膜にタンパク質を移します。
    9. 転写後、ブロックバッファー( 材料表を参照)を使用して、PVDF膜を室温で1時間ブロックします。
    10. 一次抗体を一晩4°Cでシェーカーにインキュベートします。
      注:使用された一次抗体は、抗CD81(1:1,000)、抗α-1,3/1,6-マンノシルトランスフェラーゼ(ALG-2)相互作用タンパク質X(Alix)(1:1,000)、抗カルネキシン(1:1,000)、抗グリセアルデヒド3-デアス水素(GAP)でした。
    11. ブロット3 x 15分を1xトリス緩衝生理食い、0.1%トゥイーン20(TBST)で洗浄し、ヤギ抗マウスIgG-わさびペルオキシダーゼ(HRP)またはロバ抗ウサギIgG-HRPコンジュゲート二次抗体(1:10,000)で室温でインキュベートします。
    12. ブロットを1x TBSTで3 x 15分洗い、HRP基質を使用してタンパク質を検出します。
    13. ウェスタンブロットイメージャーを使用して、強化された化学発光によってブロットを分析します。
  3. 透過型電子顕微鏡(TEM)
    1. 0.1 Mリン酸緩衝液(PB)に2%パラホルムアルデヒド(PFA)でそれらを再懸濁させることによってsEVを修正します。2 x 15 s の渦。
    2. きれいなパラフィルムに10 μLのsEV懸濁液を置きます。カーボンコーティングされたフォームバーグリッドを、コーティングされた側がサスペンションに向けてドロップに浮かべる。乾燥した環境で20分間膜を吸収させます。
    3. PBの滴下にグリッド(膜側を下)を置き、3 x 2分間洗浄します。
    4. グリッドを5分間1%グルタルアルデヒドの50 μLに移します。
    5. 100 μLの蒸留水で8 x 2分間洗浄します。
    6. 2分間、1%のウラニル酢酸の滴にグリッドを配置することにより、サンプルを対比します。
    7. パラフィルムで覆われた氷皿に2%メチルセルロース溶液を2%のメチルセルロース溶液と0.2%の酢酸の50 μLでサンプルを埋め込みます。
    8. ステンレス鋼のループを使用してグリッドを保持し、フィルターペーパーで余分な流体を除去します。
    9. ループに残った状態で10分間グリッドをエアドライします。
    10. 透過型電子顕微鏡で80kVで観察します。

3. sEVのラベリング

  1. 20 μgのsEVを1 mLの希釈液バッファーまたは同じ量のPBSで1 mLの希釈して、希釈液バッファーの1 mLで色素制御を行います。
  2. PKH67またはPKH26染料3μLを1mLの希釈液バッファーで希釈し、ピペットで混合します。
  3. 希釈したSEVに希釈したPKH染料を加え、ピペットで混ぜます。暗い温度で5分間インキュベートします。染料コントロールの場合は、ステップ3.1から希釈したPBSと希釈した色素を混合します。
  4. PBSに1%のウシ血清アルブミン(BSA)の2mLを、色素とsEVミックスを用いたチューブに加え、色素を過剰に吸収するコントロールチューブに添加します。
  5. 遠心分離機は4°Cで110,000×gで1時間用いた。 上清を捨て、2mLのPBSでペレットを再懸濁し、遠心分離機を4°Cで110,000×gで1時間停止する。 PBSで洗浄を繰り返し、PBSの等容数でラベル付きのsEVまたは色素制御を再中断します。
  6. ブラッドフォード法により総タンパク質の量を定量化します。

4. 神経-2a細胞によるSEVの取り込み

  1. 12ウェルプレートに18mmのカバーリップを入れ、10ウェル×10個 のニューロ2a細胞を各ウェルに10%FBSと1%のペンストレップを含む完全なDMEM培地の合計1mLで10個のニューロ-2a細胞を入れます。
  2. 細胞の合流率が80〜90%の場合、培地をDMEMエキソソーム枯渇培地に変更します。線量と時間依存の取り込みのために1、4、24時間の各ウェルに1、5、または10μgの標識されたSEVを加えるか、等量の色素制御を加えます。

5. 主要な占星術文化

  1. 出生後4日に低体温症を誘発して4人の出生後の子犬を麻酔する。
  2. 氷冷ハンクのバランス塩溶液(HBSS)を含む60mmペトリ皿に脳を集め、10 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-ピペラジネタンスルホン酸(HEPES)を補います。
  3. 両方の皮質葉を解剖し、髄液を取り除く。殺菌された刃でティッシュをミンチする。
  4. 組織をパパイン/デオキシリボヌクレアーゼI解離緩衝液を含む15mL円錐管に移し、37°Cで20分間インキュベートする。 5分ごとに旋回します。
    注:4つのマウスコルチスの場合、HBSSの7.5 U/mLパパインの9 mLは、少なくとも30分間37°Cで活性化され、0.22 μmのシリンジフィルターを通して濾過され、デオキシリボヌクレアーゼIと混合して0.1mg/mLの最終濃度にします。
  5. 上清を吸引し、5 mLの完全なDMEMを加えて酵素活性を不活性化する。慎重に5 mLガラス血清ピペットと炎で磨かれたパスツールピペットで組織を解体するためにトリチュレート。
  6. 細胞懸濁液を40μmの細胞ストレーナーに通し、4°Cで5分間250×gで遠心分離します。 培地を吸引し、完全なDMEMの10mLで細胞を75cm2フラスコに播種する。清澄培地は、めっき後4時間で新鮮なDMEM培地の15mLに交換してください。
  7. 14日間のインビトロの後、フラスコを軌道シェーカーに移し、ミクログリアとオリゴデンドロサイトを320rpmで6時間取り外します。
  8. 残りのアストロサイトを、細胞解離酵素(材料表)の5 mLを用いて、37°Cで10分間トリプシン化する。 5 mLの完全なDMEMを加えて酵素作用を不活性化し、4°Cで5分間250×gで細胞をペレット化します。
  9. 完全な DMEM でセルを再中断します。シード5×12mm #1.5のカバーリップに10個の4 個の細胞を24ウェルプレートに入れます。

6. アストロサイトによるSEVの取り込み

  1. アストロサイトが80-90%の合流率に達したら、培地をDMEMエキソソーム枯渇培地に変更します。
  2. ラベルなしのラベル付きのsEV、等量の色素制御、またはPBSを細胞に1μg加えます。sEV処理後1時間24時間染色用の細胞を使用してください。

7. 免疫蛍光

  1. 細胞をPBS 3xで洗い、室温で10分間PBで4%PFAで固定します。
  2. 固定細胞をPBで3 x 5分洗い、0.1%トリトンX-100をPBで10〜15分間透過させ、PB 3 x 5分で洗浄します。
  3. 室温で1時間PBで5%正常ヤギ血清(NGS)を有する細胞をブロックする。
  4. 一次抗体で細胞をインキュベートする:微小管関連タンパク質2(MAP2A、1:500)のニューロ-2a細胞またはグリア細動酸性タンパク質(GFAP、1:500)の一次アストロサイトの一次アストロサイトの新鮮な5%NGS/PBの一晩穏やかな揺れを伴う。
  5. PBで3 x 10分を洗浄し、5%NGSでフルオロフォア共役二次抗体(ヤギアンチマウスIgG1、アレクサフルオール594;またはヤギアンチマウスIgG H&L、アレクサフルーター488)を追加し、ロッカーの室温で2時間インキュベートします。
  6. 3 x 10分をPBで洗浄し、1 μg/mLの核染色4',6-ジミディノ-2フェニリンドール(DAPI)を室温で10分間インキュベートします。PBで細胞を再び3倍洗います。
  7. アンチフェードマウントメディアを使用して、カバーリップを#1スライドに取り付けます。暗闇の中で一晩乾燥させ、共焦点顕微鏡でイメージングするまで4°Cで準備されたガラススライドを保管します。

8. インビボ の取り込み

  1. 5 μgの非標識または標識されたsEVを10 μLのPBSに再懸濁し、または等容積(10 μL)の色素制御(セクション3で作成)をC57BL/6マウスに注入します。
  2. sEvの6時間および18時間後に、ケタミンの100mg/kg体重および10mg/kg体重のキラジンの腹腔内注射によってマウスを深く麻酔する。
  3. 血液を洗い流すために0.9%生理食音でマウスの心内灌流を行い、続いて作りたての氷冷4%PFA/PBを行う。
  4. 脊髄を解剖し、4°Cで4%PFA/PBに24時間固定する。PB中の30%スクロースで24時間または組織が沈むまで4°Cで組織を凍結保護します。免疫組織化学まで4°Cで組織を保管してください。

9. 免疫検査

  1. O.C T化合物にL4-L5脊髄を埋め込む。完全に固まるまでドライアイスで凍結します。
  2. クライオスタットを使用して30μm(脊髄の断面)で組織を切り離し、PBを含む24ウェルプレートにセクションを集める。PBで0.3%トリトンでセクション3 x 5分を洗います。
  3. 5%NGSを有する非特異的結合部位を0.3%のトリトン/PBで2時間室温でブロックする。
  4. 希薄な一次抗体:抗MAP2A(1:500)、GFAP(1:1,000)、Iba1(1:2,000)、0.3%トリトン/PBで5%NGSを有し、シェーカー上の4°Cで一晩4°Cで切片をインキュベートする。
  5. セクション3 x 5分を0.3%トリトン/PBで洗浄し、二次抗体(ロバアンチラビットIgGアレクサフルオール488、1:500、またはヤギアンチマウスIgGアレクサフルオール488、1:500)を室温で2時間NGS/PBで2時間追加します。
  6. PBで3 x 5分洗浄し、DAPIの1μg/mLで室温で10分間インキュベートします。PBで3×5分のセクションを洗います。
  7. 細かい絵筆を光顕微鏡で、清潔な粘着スライド(材料表)に取り付けます。
  8. 取り付け媒体でカバースリップを濡らします。室温で暗闇の中で一晩硬化します。
  9. それぞれのレーザーを用いて共焦点顕微鏡の下での画像。

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結果

遠心分離を介してRAW 264.7コンディショムドメディアからsEvを分離した後、NTAを使用して精製されたSEVの濃度およびサイズ分布を決定しました。RAW 264.7由来のsEVの平均平均サイズは140nmであり、ピーク粒子サイズは121.8nmであり、光散乱測定における最も検出可能な粒子が50〜150nmのエキソソームまたはsEvのサイズ範囲内に収まっていることを確認した(図1A)。細胞外小胞2018(...

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ディスカッション

このプロトコルでは、PKH色素によるsEVの標識と脊髄におけるそれらの取り込みの視覚化を示した。PKHの親油性蛍光色素は、フローサイトメトリーおよび蛍光顕微鏡による細胞の標識に広く用いられている3,5,6,12,24,25.比較的長い半減期と低い細胞...

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開示事項

著者らは開示する利益相反はない。

謝辞

この研究は、NIH NINDS R01NS102836とペンシルベニア州保健省ユニバーサル研究強化(CURE)からの助成金によって支えられ、シーナ・K・アジットに授与されました。ブラッドリー・ナッシュ博士の原稿の批判的な読み取りに感謝します。

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資料

NameCompanyCatalog NumberComments
Amicon Ultra 0.5 mL centrifugal filtersMilliporeSigmaZ677094
Anti-Alix AntibodyAbcamab1864291:1000
Anti-Calnexin AntibodyAbcamAb102861:1000
Anti-CD81 AntibodySanta Cruz Biotechnologysc-1660291:1000
Anti-GAPDH Monoclonal Antibody (14C10)Cell Signaling Technology21181:1000
Anti-Glial Fibrillary Acidic Protein AntibodySigma-AldrichMAB3601:500 for IF; 1:1000 for IHC
Anti-Iba1 AntibodyWako019-197411:2000
Anti-MAP2A AntibodySigma-AldrichMAB3781:500
Bovine Serum Albumin (BSA)VWR0332
Cell Strainer, 40 μmVWR15-1040-1
Centrifuge TubesThermo Scientific3118-005012,000 x g
Coverslip, 12-mm, #1.5Electron Microscopy Sciences72230-01
Coverslip, 18-mm, #1.5Electron Microscopy Sciences72222-01
DAPISigma-AldrichD9542-1MG1 µg/mL
DC Protein AssayBio-Rad500-0116
Deoxyribonuclease I (DNAse I)MilliporeSigmaD4513-1VL
Donkey Anti-Rabbit IgG H&L (HRP)Abcamab162841:10000
Donkey Anti-Rabbit IgG H&L, Alexa Fluor 488InvitrogenA-212061:500
Double Frosted Microscope Slides, #1Thermo Scientific12-552-5
DPBS without Calcium and MagnesiumCorning21-031-CV
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)Corning10-013-CV
Exosome-Depleted Fetal Bovine SerumGibcoA27208-01
Fetal Bovine Serum (FBS)Corning35-011-CV
FluorChem M imaging systemProteinSimple
FV3000 Confocal MicroscopeOlympus
Goat Anti-Mouse IgG H&L (HRP)Abcamab67891:10000
Goat Anti-Mouse IgG H&L, Alexa Fluor 488InvitrogenA-110011:500
Goat Anti-Mouse IgG1, Alexa Fluor 594InvitrogenA-211251:500
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS)VWR02-0121
HEPESGibco15630080
HRP SubstrateThermo Scientific34094
Intercept blocking buffer, TBSLI-COR Biosciences927-60001
Laemmli SDS Sample BufferAlfa AesarAAJ61337AC
Micro Cover Glass, #1VWR48404-454
Microm HM550Thermo Scientific
NanoSight NS300 systemMalvern Panalytical
NanoSight NTA 3.2 softwareMalvern Panalytical
Neuro-2a Cell LineATCCCCL-131
Normal Goat SerumVector LaboratoriesS-1000
O.C.T CompoundSakura Finetek4583
PapainWorthington Biochemical CorporationNC9597281
ParaformaldehydeElectron Microscopy Sciences19210
Penicillin-StreptomycinGibco15140122
PKH26Sigma-AldrichMINI26-1KT
PKH67Sigma-AldrichMINI67-1KT
Protease Inhibitor CocktailThermo Scientific1862209
PVDF Transfer MembraneMDISVFX8302XXXX101
RAW 267.4 Cell LineATCCTIB-71
RIPA BufferSigma-AldrichR0278
Sodium ChlorideAMRESCO0241-2.5KG
Superfrost Plus Gold SlidesThermo Scientific15-188-48adhesive slides
T-75 FlasksCorning431464U
Tecnai 12 Digital Transmission Electron MicroscopeFEI Company
TEM GridsElectron Microscopy SciencesFSF300-cu
Tris-Glycine Protein Gel, 12%InvitrogenXP00120BOX
Tris-Glycine SDS Running BufferInvitrogenLC26755
Tris-Glycine Transfer BufferInvitrogenLC3675
TrypLE ExpressGibco12605028cell dissociation enzyme
Triton X-100Acros Organics327371000
Trypsin, 0.25%Corning25-053-CL
Tween 20Sigma-AldrichP1379
Ultracentrifuge TubesBeckman344058110,000 x g

参考文献

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