ショウジョウバエの行動研究のための手頃な価格で効率的な「自家製」プラットフォーム、および幼虫のミトコンドリア呼吸器測定のための付随するプロトコル

要約

私たちは、「メイカーカルチャー」の心を持つ人なら誰でも、必要な機器の多くを3Dプリントすることにより、 Drosophila melanogasterの無数の行動パラメーターを定量的に分析するためのflylabの構築を開始するためのプロトコルを提供します。また、幼虫を使用して行動データとミトコンドリア代謝データを組み合わせる高解像度の呼吸器測定プロトコルについても説明します。

要約

ヒトの病気、行動、および基本的な生物学の研究のためのモデル生物としての ショウジョウバエ の有用性は疑う余地がありません。 ショウジョウバエ の研究は実用的ではありますが、発展途上国では人気がありません。これは、おそらく、このような小さな昆虫を使用して実験室を設立し、関連する実験を行うことは困難であり、高価で特殊な装置が必要であるという誤った考えによるものです。ここでは、必要な機器の多くを3Dプリントすることにより、 D.melanogasterの無数の行動パラメータを定量的に分析するための手頃な価格のフライラボを構築する方法について説明します。一般的なハエのメンテナンスや、成虫や幼虫を用いた行動実験を行うためのバイアルラック、求愛アリーナ、運動アッセイ装置などを社内に構築するためのプロトコールを提供しています。また、高分解能オキシグラフなどのより高度なシステムを使用して、幼虫サンプル中のミトコンドリア酸素消費量を測定し、ミトコンドリア代替オキシダーゼ(AOX)の異種性発現による幼虫の行動変化との関連を示す方法に関するプロトコルも提供しています。AOXは、幼虫の活動とミトコンドリアの漏れ呼吸を増加させ、低温での発育を促進しますが、これは酵素の熱発生の役割と一致しています。これらのプロトコルが、特に発展途上国の研究者に刺激を与え、 ショウジョウバエ を使用して行動とミトコンドリア代謝データを簡単に組み合わせるようになり、人間の生理機能や病状を調節する可能性のある遺伝子や環境条件に関する情報につながることを願っています。

概要

ショウジョウバエ・メラノガスターは、100年以上前に潜在的に強力なモデル生物として科学界に紹介されました。その可能性は、遺伝学、進化学、発生生物学、神経生物学、分子生物学、細胞生物学など、生物科学および生物医学のいくつかの分野でしっかりと検証されています。その結果、遺伝、突然変異誘発、自然免疫、概日リズム、嗅覚、発達の理解に大きく貢献した10人のショウジョウバエ研究者に、6つのノーベル医学・生理学賞が授与されました¹。おそらくもっと重要なことは、PubMedですばやく検索すると、「ショウジョウバエモデル」という検索語を使用して過去5年間に約600の出版物が明らかになるため、D.melanogasterは人間の生物学と疾患の新しいモデルを提供することをやめていません(2021年2月現在2件)。米国では、ショウジョウバエが生物医学界で広く普及しているモデル生物であり、2015年にNIHが授与したR01研究賞の約2.2%がショウジョウバエの研究者に割り当てられました³。一方、ブラジルでは、サンパウロ州のすべての科学分野の研究のための最も重要な資金提供機関であるサンパウロ研究財団(FAPESP)のウェブサイトで現在資金提供を受けているプロジェクトを検索したところ、ショウジョウバエ^を研究4の主な対象とする助成金とフェローシップはわずか24件しか見つかりませんでした。現在FAPESPが資金提供している13205のプロジェクトすべて(2021年2月現在、^5つ)を考慮すると、これらの24のショウジョウバエプロジェクトは、プロジェクト全体の0.2%未満に相当し、NIHのそれよりも約12倍低くなっています。ショウジョウバエを生態学的および/または進化の観点から研究することを目的とした資金提供を受けたプロジェクトを取り除き、残りのプロジェクトがこの生物を健康と病気における人間の生物学的プロセスを理解するためのモデルとして使用すると仮定すると、その比率は衝撃的な~0.1%に減少します。

実際、ブラジル/サンパウロでのショウジョウバエの研究が資金提供されたプロジェクトの数ほど重要ではないように見える理由を明らかにするためには、適切な調査が必要です。ショウジョウバエの培養^{は高価ではなく6,7,8}、脊椎動物とは異なり、実験には生命倫理委員会からの許可が必要ない^9,10ため、比較的簡単です。しかし、ブラジルでは遺伝子組み換えフライラインを扱うための承認^{が必要であり、遺伝子}組み換え生物を含むすべての仕事に固有の官僚主義の層が追加されています。しかし、だからといって、興味を持った研究者がフライラボを始めるのを防ぐことはできないでしょう。私たちは、モデルのパワーに関する誤った情報、およびフライラボのセットアップと有意義な実験の実行に関連する予想される高コストに関する誤った情報が、この決定の重要な要素であると推測しています。ほとんどの科学機器および消耗品については、一般的な飛行のメンテナンスおよび行動分析を行うための適切な装置を、北米、ヨーロッパ、および/または他の場所からブラジルに輸入する必要がありますが、これは高価で非常に時間のかかるプロセス^です12,13。

最近、3Dプリンターがより手頃な価格になり、発展途上国のショウジョウバエの研究者を含む誰もが利用できるようになると、特殊な装置を輸入する代替手段が登場しました。3Dプリンティング技術は、過去10年間、企業が製造した製品だけに頼るのではなく、自給自足の考えに基づく「メーカー文化」のメンバーによって広く使用されてきた¹⁴。このような考えは、世界中の学術研究機関に常に存在していたので、3Dプリンターが多くの場所で標準的な実験装置になったことは驚くべきことではない^15,16。長年にわたり、フライバイアルラック、嵌合アリーナ、クライミング装置などのデバイスを3Dプリントしてきましたが、これはブランド名の同等品の数分の一のコストです。自家製の実験装置の印刷と組み立てのコスト削減は、古典的に€100.00未満で構築することができ、遺伝的に扱いやすいゼブラフィッシュ、ショウジョウバエ、線虫¹⁵の洗練された光および熱遺伝学的刺激を使用できる光と蛍光顕微鏡として機能するFlyPiによって表されます。ここでは、ショウジョウバエの研究者になることに興味がある人(または自分の既存のフライラボを拡大すること)に関心のある人のために、必要な材料の多くを3Dプリントするための一連のプロトコルを提供します。時間を投資し、少しの専門知識を開発することで、読者はここで紹介するプロトコルを最適化して、自分の研究ニーズにより適した装置を印刷することさえできます。

ただし、フライラボは「安価な」機器だけの場所ではなく、特に行動分析を根本的な代謝現象に関連付けることを意図している場合に限ります。また、ショウジョウバエの行動パターンの調節におけるミトコンドリアの役割にも関心があり、これらの細胞小器官は、生成物が酸化的リン酸化(OXPHOS)に収束するいくつかの代謝経路を通じて、ほとんどの組織でATPの大量生産に関与しています。ミトコンドリアの酸素消費量を解析してミトコンドリアの代謝を理解するには、オキシグラフが必要ですが、これはより洗練された機器ですが、残念ながらまだ3Dプリントできません。OXPHOSは、細胞内で起こる一連のエクセルゴニック酸化還元反応に依存するため、実質的に全ての細胞プロセスに影響を与えるため^17,18、ミトコンドリアに供給される酸化性基質に基づく酸素消費率は、オルガネラの機能が特定の行動の原因であるか結果であるかを明らかにするのに役立つかもしれない。したがって、ここでは、公開されたプロトコルの大部分が成体サンプルの分析に焦点を当てていることを認識しているため、幼虫サンプルのミトコンドリア酸素消費量を測定するためのプロトコルも提供しています。Ciona intestinalis alternative oxidase (AOX) のトランスジェニック発現によって誘発されるミトコンドリア呼吸の変化が、寒冷ストレス下での幼虫の移動性の増加につながることを示しています。AOXは、ミトコンドリア膜電位(ΔΨm)およびATP産生19,20,21に寄与することなく、OXPHOS複合体IIIおよびIV(CIIIおよびCIV)の活性をバイパスできる非プロトンポンピング末端オキシダーゼであるため、これは熱発生によるものである可能性が最も高い。 ショウジョウバエや脊椎動物を含む昆虫は、自然にAOX21,22,23を保有していませんが、無数のモデルシステム24,25,26,27,28,29での発現は、一般的なミトコンドリア呼吸ストレスの状態、特にCIIIおよび/またはCIVによって引き起こされる場合の治療可能性を示すことに成功していますオーバーロード。AOXは、アンチマイシンA²⁴およびシアン化物^24,25の毒性レベルに対する耐性を付与し、ミトコンドリア機能不全24,25,30,31,32に関連する多様な表現型を緩和します。AOXの発現が幼虫の行動とミトコンドリア機能を変化させるという事実は、後生動物の細胞と組織の代謝と生理学におけるこの酵素の役割についてのより詳細な研究を正当化する^33,34。

この記事により、ブラジルなどの発展途上国の科学コミュニティ内で、 D. melanogaster が提示する優れた遺伝ツールセットと、行動分析のための効率的で手頃な価格の自家製装置を組み合わせることで、大きなトランスレーショナルインパクトを持つ興味深い生物学的プロセスに関する比較的高速な基礎研究データを生成できるという認識を高めるのに役立つことを願っています。 臨床研究における将来の治療研究を支援します。このような共同体の理想を発展させることは、ドロソフィリスト、医学研究者、生物学および生物医学に大きな利益をもたらすでしょう。最も重要なことは、公的資金を人間の病気を理解し治療するために、より翻訳的に適用できるため、社会全体に利益をもたらすことです。

フライラボの装置を3Dプリントするためにここで提供するプロトコルは、³⁵で入手可能なPrusa I3 DIYモデルに基づいて、RepRap 3Dプリンターで使用するように設計されています。印刷の原料には1.75mmの白色ポリ乳酸(PLA)フィラメント(SUNLU)、モデル設計にはTinkercadプラットフォーム³⁶ 、プリンターに座標を提供するために必要なステップであるSTLからGコードへの変換にはRepetier-Hostソフトウェア³⁷ を使用しています。読者が代替の機器、材料、ソフトウェアを使用したい場合は、プロトコルのさらなる最適化が必要です。

プロトコル

1. 3Dモデル設計

注:3Dプリントのワークフローには、次の3つの基本的なステップがあります:(1)3Dモデリング。(2)モデルをスライシングソフトウェアにインポートします。(3)正しいフィラメントを選択し、プリンターを構成し、最後に印刷します。小さなフライバイアルラック/トレイをモデル化するための基本的なプロトコルを以下に示します。このラックは、直径約2.5cm、高さ約9.8cmの標準的なフライバイアルと一緒に使用します。新しいモデル設計の場合、Tinkercadソフトウェアが提供するツールを使用すると、自分のニーズに応じてさまざまな形状、サイズ、厚さのピースを作成することで、3次元構造を簡単に処理できます。3Dプリンティングの領域に初めて足を踏み入れるドロソフリストにとって、以下のプロトコルに従うことは、たとえその詳細であっても、まだ難しい場合があるため、最良の結果を得るためにソフトウェアに精通することを強くお勧めします。

1. Tinkercad online³⁸ にサインインします(図1A)。プラットフォームにアクセスするには、個人情報を使用した事前登録が必要です(無料)。
2. [ Create a new Project ] をクリックして新しいデザインを開始し、ウィンドウの右上隅にあるプロジェクトの名前を適宜変更します。 Enter キーを押して、プロジェクトのワークプレーンに移動します (図 1B)。
3. ワークプレーンの寸法が 200 mm x 200 mm の正しいかどうかを確認するには、マウスの左ボタンで右下隅の [グリッド編集 ]( 図 1B の赤い四角)をクリックします。ポップアップウィンドウ(図1C)で、「Units」がミリメートルで、「Presets」がデフォルトであることを確認します。「Width」と「Length」フィールドに200.00を入力し、 Update Grid をクリックして変更を保存します。
4. スナップグリッドが1.0 mm(図1Bの赤い四角)に設定されているかどうかを確認します。そうでない場合は、ドロップダウンメニューをクリックして1.0mmを選択します。
5. 右側の[基本形状]メニュー( 図 1B の青い四角形 2)で、塗りつぶされたボックスを選択し、ワークプレーンの中央にドラッグします。
6. マウスの左ボタンでワークプレーン内のボックスの任意の場所をクリックすると、そのエッジと頂点が表示されます。任意の頂点(赤に変わります)をクリックすると、ボックスの寸法( 図1Dの赤い四角形)が表示されます。各寸法をマウスの左ボタンでクリックし、長さ(L)に130 mm、幅(W)に130 mm、高さ(H)に40 mmと入力します。ボックスをワークプレーンの中央にドラッグして、ボックスを中央に再配置します。
7. 画面の右上隅にあるツールルー ラー ( 図1Eの赤い四角1)をクリックします。 図 1E (赤い四角 2) に示すように、ボックスの左下の頂点をすぐにクリックして、3 次元デカルト座標系の初期点 (x = 0、y = 0、z = 0) を設定します。選択した頂点と座標の初期点との間の距離 ( 図 1F の赤い四角形) が表示されることに注意してください (図 1F の赤い四角形) ここで、"A"、"B"、および "C" はそれぞれ x、y、z 軸までの距離 (この場合は 0) を表します。
8. 次に、右側の [基本形状 ]メニュー( 図1Bの青い四角2)から空の(穴)ボックスを選択し、ワークプレーンにドラッグします。その寸法を 30 (L) x 30 (W) x 40 (H) mm に設定し、空のボックス ( 図 1G の赤い四角) の右下隅にある緑色の矢印の横にあるテキスト ボックスに「2.00」と入力して、ワークプレーンから 2 mm 持ち上げます。ボックスの左下隅にある緑色の矢印の横にあるテキスト ボックスに「2.00」と入力して、X 座標の始点から 2 mm 離れた塗りつぶしボックス内に空のボックスを配置します ( 図 1H の赤い四角形、 図 1G と比較してください)。
9. 空のボックスを選択したまま、キーボードの CtrL+D キーを押して "duplicate" コマンドを展開し、まったく同じ寸法の新しい空のボックスを作成します。新しい空のボックスを塗りつぶされたボックス内、最初の空のボックスの隣に配置するには、y 軸に沿った緑の矢印の横のテキスト ボックスに「34.00」と入力し、残りの 2 つの緑の矢印 ( 図 1I の赤い四角) の横のテキスト ボックスに「2.00」と入力します。
10. この手順を繰り返し、座標の初期点から正しい距離に調整して、ソリッドボックス全体が互いに2mm間隔の空のボックスで埋められます(図1J)。
11. すべてのボックス(塗りつぶされたボックスと空のボックス)を選択するには、マウスの左ボタンでクリックし、領域全体にドラッグします。キーボードの CtrL + G キーを押して「group」コマンドを展開し、ハエバイアル用の16個の空きスペースを持つ1つのボックスを作成します(図1K)。これがバイアルラックの最終設計です。
12. Tinkercadウィンドウの右上隅にある[エクスポート]をクリックします。表示されたウィンドウボックス(図1L)で、[含める]の横にある[デザイン内のすべて]を選択し、[ファイルタイプとして[3Dプリント用]の下の[STL]。デザインファイルに適切な名前を選択し、コンピューター内の適切な場所に保存します。

2. 3D印刷

注意: このセクションでは、手順1で作成したSTLファイルの使用方法と、3Dプリンターへの印刷指示を含むGコードファイルに変換する方法について説明します。これはスライスプロセスであり、Repetier-Hostソフトウェアを使用します。

1. 補足ファイル1をダウンロードし、コンピューター内の適切な場所に保存します。これは、以下で使用するプリンタ設定を含む .rcp ファイルです。.rcp ファイルタイプの詳細については、³⁹ を参照してください。
2. ³⁷の指示に従って、コンピューターにすでにインストールされているはずのRepetier-Hostソフトウェアを開きます。キーボードのCtrL + Oキーを押して、プロトコル1で作成したコンピューターでSTLファイルを開きます。
3. 開いたら、設計されたバイアルラックをクリックし、キーボードのRキーを押して、画面の右側にある編集メニューを開きます(図2Aの赤い四角1)。[オブジェクトの配置]タブの[オブジェクトの中央配置]ボタン(図2Aの赤い四角2で示されている[オブジェクトの中央配置]ボタンをクリックして、オブジェクトを印刷テーブルの中央に配置します。
4. [オブジェクトの配置] タブの横にある [スライサー] タブ (図 2B の赤い四角 1) をクリックし、下の [構成] ボタン (図 2B の赤い四角 2) をクリックします。左側に新しいウィンドウが開き、速度、層の厚さ、ホルダーなどのプリンターパラメーターを定義できることに注意してください(詳細については、以下のディスカッションを参照してください)。
5. [インポート] ボタン (図 2E の赤い四角形 3) をクリックし、ファイルから [補足ファイル 1] を選択して、Enter キーを押します。この .rcp ファイル (手順 2.1 でダウンロード) は、このバイアル ラック用に最適化したプリンターの自動構成のパラメーターを提供することに注意してください。
6. 印刷パラメータの設定を完了するには、右側のメニュー(図2Eの赤い四角4)で「サポートタイプ」に「なし」を選択します。これは、この作品の印刷には曲げやその他の変形を防ぐためのサポートが必要ないからです。Infill Density(図2Eの赤い四角形5)で、20%を選択してソリッド構造を作成します(これらのパラメータの詳細については、以下の説明を参照してください)。
7. 画面の右上隅にある[CuraEngineでスライス]をクリックしてスライスプログラムを実行し、プリンターがピースを印刷するために必要な情報を含むGコードを生成します。右側のメニュー([スライサー]タブの横)の[印刷プレビュー]タブの下に、印刷ジョブの完了に必要な時間と材料の量に関する情報が表示されます(図2Fの赤い四角1)。
8. [SDプリント用に保存]をクリックして、GコードファイルをSDカードに保存します(図2Fの赤い四角2)。Gコードには、プリンターが適切に機能するために、設計されたピースの3D座標がレイヤーにスライスされていることに注意してください。
9. SDカードをRepRap 3Dプリンターに挿入し、プリンター画面に表示される情報に従ってSDカードから印刷を選択します。
10. バイアルラックのGコードファイルを選択します。プリンターは自動的にウォームアップし、デザインされた作品の印刷を開始しますが、これには数時間かかることに注意してください。ラック(図3A)は、印刷ジョブの完了後すぐに使用できる状態になっているはずです。

3. 行動分析装置

注:プロトコル1および2で説明されている手順は、必要なラボ機器のいくつかを印刷するために、適切な調整で繰り返すことができます。しかし、新しい作品の設計は、Tinkercadの初心者ユーザーにとっては困難で時間がかかるかもしれないことを認識しているため、すべてのモデルを設計する方法についての段階的なプロトコルを提供する代わりに、STLファイルとして作成したいくつかの設計モデルをダウンロードできるようにしています( 補足ファイル2-11を参照)。

1. 小さな漏斗のモデル(図3B)の補足ファイル2をダウンロードし、フライラボで日常的に使用され、ハエがこれらの容器の内壁を這い上がって逃げるのを防ぐことにより、成虫のハエを新しいバイアルまたはボトルに移すのを助けます。
2. エチレン酢酸ビニルフォームや、作りたての食品が入った新しい容器にハエを傾けるときにガラスバイアルやボトルをタップできる厚い綿マットを保持できるタッピングマットサポート(図3C)の補足ファイル3をダウンロードしてください。
3. Stalkerと名付けたカメラスタンドのモデル用の 補足ファイル4 と 補足ファイル5 をダウンロードします(図3D)。
   注意: この装置を使用すると、任意のカメラ(プロ、ウェブカメラ、携帯電話など)をベースの上に配置して、幼虫や成虫のハエが入ったシャーレを画像化したり、ビデオ録画したりできます。ストーカーは、ペトリ皿から常に同じ距離で水平に行われる動物の行動のイメージングを可能にし、例えば、記録を異なる日に行う必要がある場合や、記録の合間にカメラを別の目的に使用する必要がある場合に、実験測定にばらつきを持ち込むことを回避します。この装置は便利なモジュール式で、 補足ファイル4のベースと上部、 補足ファイル5の側面を印刷した後、簡単に組み立てることができます。底面の^1cm2 の正方形は、油性マーカーを使用して強調表示でき、個々の動物の移動距離を追跡するのに役立ちます。白いフィラメントを使用して装置(少なくともベース)を印刷し、追跡ソフトウェアが各ハエを識別するのに十分なコントラストが背景と動物の間にあるようにします。
4. Fly Motel(図3E)の印刷可能なデザインについては、補足ファイル6をダウンロードして、一度に10組の交配ペアのビデオ録画を容易にするように整理された10の求愛と交配アリーナ(部屋)があります。Fly Motelは、行動研究での使用についての詳細な説明が見つかる⁴⁰で公開されたデバイスに基づいていることに注意してください。装置には、3Dプリントされた部品に加えて、組み立てられた装置を安定させるために上部を下部に固定するための12本のネジ(3 x 8 mm)、アクリル板(60 x 60 x 3 mm)、およびジッパータイトが必要です。フライモーテルの構造はより複雑なため、必要な部品とドライバーがすべて揃っているため、正しい組み立て方の説明ビデオ(補足ファイル7)も提供しています。
5. 成虫のハエを用いた記憶アッセイに使用されるT-Mazeのモデル(図3F)の補足ファイル8をダウンロードしてください。T迷路がどのようにしてハエに反発的な匂い刺激を光屈性行動と関連付けさせるかについての詳細な説明は、元の出版物⁴¹にあります。また、この装置は、どの研究室でも一般的に見られる2本の半透明の15mLコニカルチューブを使用しており、中央ピースの両側にある2cm幅の円形の開口部に取り付けられています。T-Mazeのプリントにはサポートが必要であることに注意してください(詳細については、図2の凡例を参照してください)。上記の手順2.1-2.6に従って、サポートタイプ(図2Eの赤い四角4)に「すべての場所」を選択します。
6. 急速反復ネガティブジオタキシス(RING)アッセイ用の装置(図3G)の印刷可能な部分の設計については、補足ファイル9および補足ファイル10をダウンロードし、複数の遺伝子型または環境条件の成虫のハエで同時にクライミングアッセイを実行し、より標準化された高^{スループットの方法で}結果を生成するために使用される.RING装置もモジュール式で、3Dプリントされた部品に加えて、オンラインや金物店で簡単に購入できる他の部品が必要です:Φ8 x 300 mm整流シャフト2本、Φ8 mmリニアベアリング4本、輪ゴム(またはひもの一部)、ベース用の240 x 60 x 20 mmの木材、 プリントパーツをウッドベースに固定するための8本の木製ネジ(8mm)。補足をダウンロードする File 11 すべての部品を印刷または購入した後のデバイスの組み立て方法の説明。RING装置の使用方法の詳細な説明は、元の出版物⁴²にある。

4. 幼虫移動性アッセイ

注:このプロトコルは、もともとNicholsら⁴²に基づいて最適化されており、寒冷ストレス下でのショウジョウバエの発症に対するAOX発現の影響を研究しています。Saari et ^al.34によると、AOX発現幼虫および対照幼虫の例としてそれぞれ使用された3xtubAOX²⁵およびw¹¹¹⁸系統を、標準食^餌24で12°Cで培養した。このプロトコルは、関心のある環境条件下で培養された、あらゆる遺伝的条件の幼虫サンプルの移動性を分析するために推奨されます。

1. 2%寒天プレートは、脱イオン水で同量の寒天を沸騰させ、Φ90×15mmのシャーレに注ぎ、室温で固化させて調製します。最終容量が各20 mLのプレートには、0.4 gの寒天を使用します。
2. 培養バイアル/フラスコの側面から徘徊するL3幼虫を丸い先端の鉗子またはブラシを使用して慎重に収集し、個体を脱イオン水を入れたΦ90 x 15 mmのペトリ皿に10秒未満置き、体に付着した食物粒子をすすぎます。
3. 個々の幼虫をアガロースの入った皿に移し、動物が順応するまで5分間待ちます。
4. 個々の幼虫が入った皿を方眼紙(0.2 cm² グリッド)の上に置き、寒天の上を移動する動物が1分間交差する線の数を数えます。交差する各線は 2 mm の距離を表します。同じ個体でこの手順を10〜15回繰り返して、テクニカルレプリケートを取得します。
5. 異なるチューブ/フラスコから少なくとも8〜10人の個体でステップ4.4を繰り返し、異なる時間に培養して、同じラインの生物学的複製を取得します。
6. 手順4.4と4.5を繰り返して、他のフライライン(または分析するラインの数だけ)のデータを取得します。
7. ステップ4.4〜4.6で使用したのと同じ個々の幼虫を使用して、個々の幼虫と一緒に寒天皿を実体顕微鏡の下に置き、体壁の蠕動収縮の数を1分間数えることにより、体の動きに関する追加データを取得できます。分析したフライライン間の平均移動度を推定するための技術的および生物学的な複製を取得します。
8. 統計的検定を適用して、これらの幼虫の移動度パラメーターの値が対象線間で異なる確率を計算します。ここでは2つの行からのデータのみを比較しているため、スチューデントのt検定が適用される場合があります。

5. 幼虫ホモジネートを用いたミトコンドリア呼吸測定

注:以下のプロトコルは、12°Cで培養したAOX発現ライン3xtubAOX およびコントロール w¹¹¹⁸の幼虫ホモジネートからのミトコンドリア酸素消費量を測定するために最適化されていますが、遺伝的および環境条件の幼虫サンプルにも使用することをお勧めします。このような実験を行うことは、この記事で提供する他のすべてのプロトコルとは異なり、ラボが高解像度オキシグラフを取得するためにかなりの初期投資を行う必要があるため、「自家製」フライラボの「手頃な価格」の目標として含めるべきではないことを認識しています。このプロトコルは、Oroboros InstrumentsのOxygraph-2k(O2k)およびDatLabソフトウェアとともに使用されるため、読者が代替機器を使用したい場合は、さらに最適化が必要です。

1. O2kの電源を入れ、オキシグラフに接続されているコンピューターでDatLabソフトウェアを起動します。アッセイチャンバー内の磁気バーが自動的に攪拌を開始します。エタノール貯蔵溶液をチャンバーから取り出します。
2. チャンバーを100%エタノールで少なくとも3回、超純水で3回洗浄します。
3. DatLabでは、 ウィンドウO2kコントロール が自動的に開きます。 [ブロック温度 [°C]に 12 °C (または 2 から 47 °C の範囲の推奨温度) を入力し、[ OK] を押します。
4. 2 つ目のウィンドウである [実験の編集] が自動的に開きます。チャンバー A と B に追加される内容に応じて、サンプル名を Sample フィールドに入力し、 Save を押します。
5. 各チャンバーに1800 μLのアッセイバッファー(120 mM KCl、5 mM KH₂PO₄、3 mM Hepes、1 mM EGTA、1 mM MgCl₂、2% BSA、pH 7.4)を各チャンバーに添加し、外気との酸素交換を可能としながら部分的に閉じます。酸素濃度と酸素フラックス信号が安定するまで待ち、少なくとも10分間は変動が最小限に抑えられます。このステップでは、実験当日に外気を使用して装置を校正します(実験の校正の詳細については、以下の手順6.3および6.4を参照してください)。
6. エアキャリブレーションステップでは、一対の鉗子または小さな絵筆を使用して、適切な遺伝子型の20匹のさまよう幼虫を培養チューブ/フラスコから慎重に収集することにより、サンプル調製を開始します。
7. 各幼虫を脱イオン水または 1x PBS (137 mM NaCl、2.7 mM KCl、8 mM Na₂HPO₄ および 2 mM KH₂PO₄) で迅速かつ完全にすすぎ、500 μL の氷冷分離バッファー (250 mM スクロース、5 mM Tris HCl、 2 mM EGTA、pH 7.4)
8. 幼虫全体を5回のストロークでホモジナイズし、ホモジネートを氷上の1.5mLの微量遠心チューブに注ぎます。
9. ガラス製ホモジナイザーに300 μLのアイソレーションバッファーを加え、残りの幼虫組織をさらに3回のストロークで浸軟させ、ホモジネートを氷上の同じ微量遠心チューブに再度注ぎます。
10. ガラスホモジナイザーに200 μLのアイソレーションバッファーを加え、2回のストロークで残留幼虫組織をさらに浸軟させ、ホモジネートを氷上の同じ微量遠心チューブに再度注ぎます。
11. チューブを2回穏やかに反転させて最終的なホモジネート(~1 mL)を混合し、2番目のサンプルが処理されるまで氷上に保ちます。
12. 手順5.6〜5.11を繰り返して、他の遺伝子型の幼虫ホモジネートを取得します。
13. オキシグラフチャンバーAとBを開き、各ホモジネートの200 μLを各チャンバーのアッセイバッファーに移します(この時点で正確に12°Cである必要があります)。チャンバーを完全に閉じ、酸素濃度と酸素フラックス信号が約10分間安定するまで待ちます。
14. 2 Mピルビン酸溶液、2 Mプロリン溶液(チャンバー内の最終濃度 = 各5 mM)、および0.4 Mリンゴ酸溶液(1.5 mM)7.5 μLを各チャンバーに5 μL添加して、酸素消費量の測定を開始します。信号が安定するまで少なくとも5分かかります。この時点で、ミトコンドリアには酸化性基質が充填され、トリカルボン酸(TCA)サイクル反応が開始されることに注意してください。酸素消費シグナルの増加は、アンカップリングタンパク質の機能によるもの(または他のアンカップリング現象によるもの)によるものであり、一般的なアンカップリング呼吸(アデニル酸エステルの非存在下でのリーク呼吸とも呼ばれる、 LN_{-詳細については}代表的な結果を参照)の計算に使用できます。
15. 0.5 M ADP(1 mM)の溶液を各チャンバーに4 μL加え、信号が安定するまで少なくとも5分間待ちます。通常、酸素消費シグナルの大幅な増加がすぐに観察され、これは酸化的リン酸化(OXPHOS)呼吸を表しています。このOXPHOS呼吸の大部分は、複合体I(CI)によって引き起こされます。
16. 0.05 MアンチマイシンA(0.05 mM)の溶液を各チャンバーに2 μL加えてCIIIを阻害し、シグナルが安定するまで少なくとも5分間待ちます。ピルビン酸、プロリン、リンゴ酸を添加する前に見られた基礎レベルまでの酸素消費信号の減少は、 w¹¹¹⁸ コントロールサンプルで観察されるべきです。AOXを発現する幼虫のミトコンドリア呼吸は、電子をAOXに向けることができるようになったため、アンチマイシンAに対して部分的に耐性を持つことになります。全OXPHOS呼吸の約40%はCIII阻害後も残るべきであり、これはすべてAOXによってのみサポートされるべきです。.
17. 0.1 Mガレートプロピルガレート(0.2 mM)の溶液を各チャンバーに4 μL加えてAOXを阻害し、シグナルが安定するまで少なくとも15分間待ちます。AOXを発現する幼虫サンプルの酸素消費レベルは、ピルビン酸、プロリン、リンゴ酸を添加する前に見られる基礎レベルまで減少するはずです。この減少は、観察された抗マイシンA抵抗性呼吸がAOX機能によるものであることを証明しています。
18. 各チャンバーに0.01 Mロテノン(0.005 mM)を1 μL添加してCIを阻害し、シグナルが安定するまで少なくとも5分間待って、ミトコンドリア呼吸とは無関係にサンプルの酸素消費シグナルを取得します。このシグナルは通常、ピルビン酸、プロリン、リンゴ酸を添加する前に観察されたシグナルと同じくらい低いです。
19. 実験を保存し、DatLabソフトウェアを閉じます。

6. ミトコンドリア呼吸器計測データ処理

注:酸素消費量の値は、決定された期間における酸素フラックス信号の平均として取得され、サンプル中の全タンパク質1mgあたり1秒あたりに消費されるpmol O₂ として表されます。値はまず、実験温度(空気飽和度と呼ばれる)に基づいて、実験当日にアッセイバッファーで利用可能な最大酸素濃度と、アッセイバッファーにNa₂S₂O₄ を添加することによって各チャンバーで事前に決定される最小酸素濃度に対して参照されます( ⁴³ ゼロ酸素校正を取得するためのメーカーのガイドラインの場合)。この値は、各チャンバーのアッセイバッファーに添加された幼虫ホモジネート中の全タンパク質量によっても正規化されます。

1. Bradford法⁴⁴を使用して、各サンプルの総タンパク質濃度を測定します。保存した実験をDatLabソフトウェアで再度開き、トップメニューの[実験]を押してから、[編集]を押します。開いたウィンドウで、[単位]セクションで[mg]を選択し、[量]セクションに、各チャンバーに添加したサンプルの200 μLに含まれるタンパク質量を入力します。濃度は、チャンバーの総容量が2mLであることを考慮して、ソフトウェアによって自動的に計算されます。[保存]ボタンを押します。
2. トップメニューの グラフ を押し、プロットを選択します。開いたウィンドウで、両方のグラフ(1と2、それぞれチャンバーAとBを参照)の 質量あたりのフラックス を選択します。 [OK]を押します。実験結果は、サンプルのタンパク質濃度(pmol O₂/s/mg 総タンパク質)によって正規化されます。
3. メインの実験結果ページの各グラフ(1および2)の右上隅にある「 O₂ Concentration」をクリックします。x 軸に沿って、チャンバーにサンプルを添加する前に、酸素濃度とフラックス信号が非常に安定している時間範囲を特定します。
   1. コンピューターのキーボードのShiftキーを押したまま、選択した最初の時間をマウスの左ボタンでクリックし、時間軸に沿ってカーソルをドラッグして目的の領域を選択し、マウスボタンを離します。この手順は、各グラフに対して個別に行います。
   2. グラフの下部にある選択した領域の青いバーをダブルクリックし、「air」と入力して、酸素空気飽和度の計算に使用される選択した領域であることを示します。
4. 上部のメニューバーにある 「キャリブレーション 」をクリックし、「 A:酸素、O₂ 」を選択してチャンバーAをキャリブレーションします。開いたウィンドウで、 O₂ Calib が選択されていることを確認します(黄色)。
   1. ゼロキャリブレーションの場合は、Copy from fileをクリックし、以前にゼロ酸素キャリブレーションを実行したファイルを選択します(メーカーのガイドラインについては⁴³を参照してください)。
   2. エアキャリブレーションの場合は、[Select Mark] 列で [Air] を選択します。[キャリブレーション]をクリックしてクリップボードにコピーします。
5. 上部のメニューバーにある 「キャリブレーション 」をクリックし、「 B:酸素」、「O₂ 」を選択し、手順6.4を繰り返してチャンバーBをキャリブレーションします。
6. メインの実験結果ページの各グラフ(1および2)の右上隅で、 質量あたりのO₂ フラックスをクリックします。酸素消費信号の目的の安定した領域を選択するには、キーボードのShiftキーを押したまま、マウスの左ボタンでクリックし、カーソルを時間軸に沿ってドラッグします。ピルビン酸/プロリン/リンゴ酸とADPの添加間で選択された安定領域は LN_{を表します。}ADPとアンチマイシンA、OXPHOSの間;アンチマイシンAと没食子酸プロピルの間(CIII阻害時)、アンチマイシンA抵抗性呼吸;没食子酸プロピルとロテノンの間(CIII + AOX阻害時)、残留呼吸;ロテノン後(CI + CIII + AOX阻害時)、残存する非ミトコンドリア呼吸。グラフの下部にある選択した領域の赤いバーをダブルクリックし、適切なラベルを入力します。
7. 上部のメニューバーにある [マーク ]をクリックし、[ 統計]をクリックします。開いたウィンドウの [表示 ]タブで、[ 質量あたりの O₂ 流束]を除くすべてのオプションのチェックを外します。同じウィンドウの 「選択 」タブで、チャンバーAを選択して、最初のサンプルの呼吸データを取得します。 [クリップボードにコピー ]をクリックして、データをスプレッドシートに貼り付けます。この手順を繰り返して、チャンバーBの2番目のサンプルのデータを取得します。
8. スプレッドシートで、すべての呼吸値を残存する非ミトコンドリア呼吸(ロテノン加算後のデータ)で減算します。複数の実験反復から平均を計算し、必要に応じてデータをプロットします。

結果

プロトコル1および2のステップに従うことで、簡単なフライバイアルラックを設計し、モデルのSTLファイルをスライスプログラムを通じて実行し、3Dプリンターの座標を生成することができるはずです。図3Aは、設計の隣にモデルの印刷されたユニットを示しています。また、ステップ1では、Tinkercadプラットフォームで利用可能な基本的な形状?...

ディスカッション

ここで提供される3DプリントプロトコルとSTLファイルは、新しいフライラボのセットアップを容易にするか、「自家製」の機器を使用して、既存の ショウジョウバエ 行動施設の装置のレパートリーを増やすことを目的としています。3Dプリンティング戦略は、 ショウジョウバエ を人間の生物学を研究するためのモデル生物として使用する研究が過小評?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
3D Printer RapRep			A popular 3D-printer based on the Prusa I3 DIY mode, instructions available in https://www.instructables.com/Building-a-Prusa-I3-3D-Printer-Revisited/
3xtubAOX fly line	Howy Jacobs´s lab, Tampere University		Drosophila line expressing the AOX gene from C. intestinalis under the control of the constitutive α-tubulin promoter. 5 and 6 copies of this construct are present in males and females in homo/hemizigosity, respectively, one in each of the chromosomes X, 2 and 3.
Acrylic plate			60 x 60 x 3 mm
ADP	Sigma-Aldrich	A2754	Adenosine 5′-diphosphate sodium sal (CAS number 20398-34-9); ≥95%; molecular weight = 427.20 g/mol; solubility in water at 50 mg/ml
Antimycin-A	Sigma-Aldrich	A8674	Antimycin A from Streptomyces sp. (CAS number 1397-94-0); molecular weight ~ 548.63 g/mol; solubility in 95% ethanol at 50 mg/mL
Agar	Kasv	K25-611001	For bacteriologal use; powder; solidifying agent (12-20 g/L)
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A7030	Heat shock fraction, protease free, fatty acid free, essentially globulin free (CAS number 9048-46-8);pH 7; ≥98%; solubility in water 40g/ml
Deionized water
EGTA	Sigma-Aldrich	E4378	Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid (CAS number 67-42-5); ≥97%; molecular weight = 380.35g/mol
Ethanol 99.5%
Ethylene-vinyl acetate foam			Can be replaced with thick pieces of cotton
Graph paper			0.2 cm2 grid
Hepes	Sigma-Aldrich	H4034	4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid (CAS number 7365-45-9), BioPerformance Certified; ≥99,5% (titration), cell cultured tested; molecular weight =238.30g/mol
Homogenizer	Sartorius		Hand glass homogenizer (S), 1 mL; composed of a cylinder made of borosilicate glass plus plunger S; often used for simple sample preparation, e.g. crushing of tissue samples.
KCl	Amresco	0395-2	Potassium chloride (CAS number 7447-40-7); ≥99,0%; molecular weight = 74.55g/mol
KH2PO4	Sigma-Aldrich	P5379	Potassium phophate monobasic (CAS number 7778-77-0); ReagentPlus; molecular weight = 136.09g/mol
Linear bearings (LM8UU)			8 mm, any brand
Malate	Sigma-Aldrich	M1000	L-(-)-Malic acid (CAS number 97-67-6); ≥95-100%; molecular weight = 134.09 g/mol), solubility in water: 100 mg/mL. A solution is pH adjusted to approximately 7.0.
MgCl2	Amresco	0288-1KG	Magnesium chloride, hexahydrate (CAS number 7791-18-6); 99%-102%; molecular weight = 203.3g/mol
Microcentrifuge tubes			1.5mL; Graduated every 100µL, autoclavable
Na2HPO4	Amresco	0348-1KG	Sodium phosphate, dibasic, heptahydrate (CAS number 7782-85-6); 98-102%; molecular weight = 268.07 g/mol
NaCl	Honeywell	31434-1KG	Sodium chloride (CAS number 7647-14-5); ≥99,5%; molecular weight 58,44g/mol. For laboratory use only.
Oxigraph-O2k	Oroboros	10000-02	Series D-G; O2k-Core: includes O2k-Main Unit with stainless steel housing, O2k-Assembly Kit, two OroboPOS (polarographic oxygen sensors) and OroboPOS-Service Kit, DatLab software, the ISS-Integrated Suction System and the O2k-Titration Set.
Permanent marker			Preferably black
Petri dishes			90 X 15 mm dishes; commonly used for bacteriological culture
PLA 3D Printing Filament	Quantum3D Printing	http://quantum3dprinting.com/	High quality polylatic acid filament (PLA), strongly recomended, (1.0 kg Roll), any brand
Proline	Sigma-Aldrich	P0380	L-Proline (CAS number 147-85-3); powder; 99%; molecular weight = 115.13 g/mol
Propyl gallate	Sigma-Aldrich	P3130	Propyl gallate (CAS number 121-79-9); powder; ≥98%; molecular weight = 212.2 0g/mol; solubility in ethanol at 50 mg/ml
Pyruvate	Sigma-Aldrich	P2256	Sodium pyruvate (CAS number 113-24-6), ≥99%; molecular weight = 110.04 g/mol; solubility in water at 100 mg/mL
Rectified shafts			8 x 300 mm, any brand
Rotenone	Sigma-Aldrich	R8875	Rotetone (CAS number 83-79-4); ≥95%, molecular weight 394.42 g/mol
Rubber bands			Can be replaced with pieces of a string
Screwdriver			To assemble some of the 3D-printed apparatuses
Screews			M3 x 8 mm
SD Card			At least 32Mb in size; usually provided with 3D printers
Software Repetier Host	Hot-World GmbH & Co. KG	https://www.repetier.com/	Excellent slicing software, available free of cost
Software Tinkercad	Autodesk	https://www.tinkercad.com	3D model design software, available free of cost
Stereomicroscope	Leica	M-80	Stereomicroscope, zoom 7.5-60X + Leica cls 150 led light source
Sucrose	Merck	107,651,000	Sucrose for microbiology use (CAS number 57-50-1);
Tris	Amersham Biosciences	17-1321-01	Tris (hydroxymethyl)-aminomethane (CAS number 77-86-1); 99,8-100.1%; molecular weight 121.14 g/mol
Tweezer/forceps	Stark	ST08710	Histological tweezer, straight, round tip, 12 cm, AISI-410 stainless steel
w1118 fly line	Howy Jacobs´s lab, Tampere University		Drosophila line used as genetic background control for 3XtubAOX
Wood plate			240 x 60 x 20 mm
Zip tights			2 x 210 mm, any brand