タンパク質チオール酸化の多重化定量のための同重体タンデム質量タグ標識と組み合わせた樹脂支援キャプチャ(英語)

要約

タンパク質チオール酸化は、通常の生理学的および病態生理学的条件下で重要な意味を持ちます。レジンアシストキャプチャー、アイソバリック標識、質量分析を利用して、タンパク質の可逆的に酸化されたシステイン残基の部位特異的同定と定量を可能にする定量的レドックスプロテオミクス法の詳細について説明します。

要約

タンパク質チオールの可逆的酸化修飾は、最近、細胞機能の重要なメディエーターとして浮上しています。ここでは、タンデム質量タグ(TMT)同重体標識および液体クロマトグラフィー-タンデム質量分析(LC-MS/MS)と組み合わせて、酸化タンパク質チオールのマルチプレックス確率法をプロテオームレベルで定量できる、樹脂支援捕捉(RAC)を利用した定量的レドックスプロテオミクス法の詳細な手順について説明します。酸化システイン残基に関する部位特異的な定量情報は、そのような修飾の機能的影響に関するさらなる洞察を提供します。

このワークフローは、培養細胞(哺乳類、原核生物など)や組織全体(心臓、肺、筋肉など)など、多くのサンプルタイプに適応でき、最初に溶解/ホモジナイズされ、人工酸化を防ぐために遊離チオールがアルキル化されます。酸化されたタンパク質チオールは、チオール親和性樹脂によって還元および捕捉されるため、タンパク質/ペプチドを追加で移すことなく、消化、標識、洗浄手順を実行できるため、ワークフローのステップが合理化および簡素化されます。最後に、標識ペプチドを溶出し、LC-MS/MSで分析して、プロテオーム全体にわたるチオール酸化に関連する包括的な化学量論的変化を明らかにします。この方法は、タンパク質チオール酸化に関連する生理学的および病態生理学的状態下での酸化還元依存性調節の役割の理解を大幅に向上させます。

概要

恒常性条件下では、細胞は活性酸素、窒素、または硫黄種を生成し、代謝やシグナル伝達^などのプロセスを促進するのに役立ちます^1,2,3、原核生物と真核生物の両方にまで及びます。これらの反応性種の生理学的レベルは、「ユーストレス」としても知られる適切な細胞機能に必要です^1,4。対照的に、酸化剤と抗酸化物質のバランスを崩す酸化剤の増加は、酸化ストレス、または「苦痛」¹を引き起こし、細胞の損傷につながる可能性があります。酸化剤は、タンパク質、DNA、RNA、脂質などのさまざまな生体分子を修飾することにより、生物学的経路にシグナルを伝達します。特に、タンパク質のシステイン残基は、システイン上のチオール基に起因して酸化を起こしやすい反応性の高い部位であり、異なる種類の酸化剤に対して反応性を示す⁵。これにより、ニトロシル化(SNO)、グルタチオニル化(SSG)、スルフェニル化(SOH)、ペルスルフィド化(SSH)、ポリスルフィド化(SS_nH)、アシル化、ジスルフィドなど、システインに対するさまざまな可逆的レドックスベースの翻訳後修飾....

プロトコル

動物またはヒトのサンプル/組織に関連するプロトコルに記載されているすべての手順は、ヒトおよび動物の研究倫理委員会の制度的ガイドラインによって承認され、それに従いました。

1. サンプルの均質化/溶解

1. 凍結組織サンプル
   1. 凍結組織(~30 mg)を、あらかじめ冷やしたカミソリの刃と鉗子を使用してドライアイス上でスライドさせてガラス顕微鏡上でミンチします。ミンチ組織を700 μLのバッファーA( 表1を参照)を含むプレチルド5 mL丸底ポリスチレンチューブに移し、光から保護された氷上で30分間インキュベートします。
   2. 30秒間、またはハンドヘルド組織ホモジナイザーで完全に均質になるまで組織を破壊します。サンプルを氷の上に置き、泡をさらに10分間鎮静させます。
      注意: ドライアイスの上に置かれたアルミニウム天板は、組織の初期処理/ミンチのための安定した作業面とプラットフォームを提供します。
2. あるいは、100 mm培養皿中の接着細胞培養物を出発材料として使用します。
   1. 細胞を氷上に保ち、血清学的ピペットを使用して、100 mM NEMを含む10 mLの氷冷PBSで細胞を2回すすぎます。
   2. 1 mLの冷ホモジナイズ/溶解バッファーを加え、硬質セルスクレーパーで激しく掻き取って細胞を溶解します。マイクロピペットを使用してラ....

結果

プロトコルの完了は、以前に酸化されたシステイン含有ペプチドの非常に特異的な濃縮をもたらし、多くの場合、>95%の特異性を有する27,35,36。しかしながら、プロトコルのいくつかの重要なステップは、特別な注意を必要とする、例えば、人工酸化および人工的に酸化されたチオールの非特異的濃縮を禁止するサンプル溶.......

ディスカッション

樹脂支援捕捉は、システイン残基の酸化的修飾の研究のために、様々なサンプルタイプおよび生物学的系にわたって利用されている²⁵、^29、30。この方法では、SDS-PAGEおよびウェスタンブロット分析を使用したタンパク質およびペプチド、ならびに質量分析を使用した個々のシステイン部位を含む、複数のレベルおよび読み?.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-(Pyridyldithio)ethylamine hydrochloride	Med Chem Express	HY-101794	Reagent for in-house resin synthesis
2.0 mL LoBind centrifuge tubes	Eppendorf	22431048
5.0 mL LoBind centrifuge tubes	Eppendorf	30108310
5.0 mL round bottom tubes	Falcon	352054
Acetone	Fisher Scientific	A949-1
Acetonitrile	Sigma Aldrich	34998
Activated Thiol–Sepharose 4B	Sigma Aldrich	T8512	Potential replacement for thiol-affinity resin
Amicon Ultra 0.5 mL centrifugal filter	Millipore Sigma	UFC5010BK
Ammonium bicarbonate	Sigma Aldrich	09830
Bicinchonicic acid (BCA)	Thermo Scientific	23227	Protein Assay Reagent
Centrifuge	Eppendorf	5810R
Centrifuge	Eppendorf	5415R
Dithiothreitol (DTT)	Thermo Scientific	20291
EDTA	Sigma Aldrich	E5134
HEPES buffer	Sigma Aldrich	H4034
Homogenizer	BioSpec Products	985370
Iodoacetimide (IAA)	Sigma Aldrich	I1149
N-ethylmaleimide	Sigma Aldrich	4259
NHS-Activated Sepharose 4 Fast Flow	Cytiva	17-0906-01	Reagent for in-house resin synthesis
QIAvac 24 Plus vacuum manifold	Qiagen	19413
Sodium chloride	Sigma Aldrich	S3014
Sodium dodecyl sulfate (SDS)	Sigma Aldrich	L6026
Sonicator	Branson	1510R-MT
Spin columns	Thermo Scientific	69705
Strata C18-E reverse phase columns	Phenomenex	8B-S001-DAK	Peptide desalting
Thermomixer	Eppendorf	5355
Thiopropyl Sepharose 6B	GE Healthcare	17-0420-01	Thiol-affinity resin; *Production of Thiopropyl Sepharose 6B resin has been discontinued by the manufacturer (see protocol for details).
TMT isobaric labels (16 plex)	Thermo Scientific	A44522	Peptide labeling reagent; available in multiple formats
Triethylammonium bicarbonate buffer (TEAB)	Sigma Aldrich	T7408
Trifluoroacetic acid (TFA)	Sigma Aldrich	T6508
Triton X-100	Sigma Aldrich	T8787
Trypsin	Promega	V5820
Urea	Sigma Aldrich	U5378
Vacufuge Plus speedvac	Eppendorf	22820001	vacuum concentrator
Vortex mixer	Scientific Industries	SI-0236