オンコ分解性ヘルペスシンプレックスウイルスの増殖、精製、滴定

要約

本稿では、前臨床用の単純ヘルペスウイルスの増殖、精製、滴定の簡単な方法について述べる。

要約

腫瘍分解性ヘルペス単純ヘルペスウイルス(oHSV)などの腫瘍分解ウイルス(OV)は、がん免疫療法の分野で急速に成長している治療戦略です。oHSVを含むOVは、抗腫瘍免疫を誘導しながら、癌細胞(健康/正常細胞を温見する)で選択的に複製し、殺す。これらのユニークな特性のために、oHSVベースの治療戦略は、FDA承認タリモジーンラヘルパレベック(T-Vec)を含む、前臨床的および臨床的に癌の治療のためにますます使用されています。成長、精製、滴定は、実験的研究に活用する前に、oHSVを含むあらゆるOVに不可欠な3つの実験室技術です。本論文では、Vero細胞でoHSVを増幅する簡単なステップバイステップの方法について述べている。oHSVが増殖するにつれて、ベロ細胞に細胞パシー効果(CPE)を生み出す。感染細胞の90〜100%がCPEを示すと、それらは穏やかに収穫され、ベンゾナーゼおよび塩化マグネシウム_(MgCl2)で処理され、濾過され、スクロース勾配法を用いて精製を行う。精製後、感染性oHSV(プラーク形成単位またはPPFとして指定される)の数は、Vero細胞における「プラークアッセイ」によって決定される。本明細書に記載されたプロトコルは、細胞培養および生体内動物実験におけるインビトロ研究のための高い対値oHSVストックを調製するために使用することができる。

概要

腫瘍分解ウイルス(OV)は、がん免疫療法の新しいユニークな形態です。OVは、抗^{腫瘍免疫を}誘導しながら腫瘍細胞(正常/健康細胞を温かく温かみ⁾¹に選択的に複製およびライゼする。単純ヘルペスウイルス(oHSV)は、すべてのOVの中で最も広範に研究されたウイルスの一つです。それは、タリモジーン・ラヘルパレプベック(T-VEC)が進行黒色腫³の治療のために米国でFDAの承認を受けた最初で唯一のOVである、診療所で最も遠いです。T-VECに加えて、他の多くの遺伝子組み換えoHSVは、異なる癌タイプ^{3、4、5、6、7、8}で前臨床的および臨床的にテストされている。現在の高度な組換えDNAバイオテクノロジーは、治療トランスジーン^3、5にコードする新しいoHSVをエンジニアリングする可能性をさらに高め....

プロトコル

1) oHSVの成長

注:oHSVと協力する前に、機関バイオセーフティ委員会の承認を確認してください。この研究は、承認されたIBCプロトコルNo.18007の下で行われました。BSL2の注意を維持する:すべてのピペット、先端、チューブ、およびウイルスに接触する他の材料を漂白する。手がBSL2細胞培養フードを離れる前に70%イソプロピルアルコールとスプレー手袋。ウイルスを扱った後は、常に石鹸水で手を洗ってください。

1. 1日目に、20-150 cm² フラスコの低通路ベロ細胞を、通常のベロ細胞培地で10^個の細胞 /フラスコの密度を7~8×10個の細胞/フラスコに播種する。
   注:ベロ培地は、ダルベッコの修飾ワシ培地(DMEM)に10%熱不活性化胎児子牛血清(IFCS)を加えることによって調製されます。
2. 0日目(細胞は80-90%コンフルエント)、ベロ細胞にoHSV接種を加える。
   1. ウイルス接種の準備
      1. ウイルス増幅のために0.01(MOIはウイルスの複製能力によって0.01から0.1まで変化する可能性がある)の多重度(MOI)を使用してください。20 フラスコのウイルス (mL) の量を計算するには、式 (1) を使用します。
         20フラスコのウイルス量(mL)=必要なウイルス量(pfu)/ウイルスストックの力量(pfu/mL)(....

結果

図 1 は、oHSV の成長、精製、および滴定に関連する重要なステップを表す図 1に、プロトコル全体の簡単な概要を示しています。ベロ細胞のCPEは、HSV感染後の4時間の早い時期に検出することができる^。図2は、oHSV感染後の3つの異なる時点におけるベロ細胞におけるCPEを示す。CPE のレベルは時間の経過とともに増加します。このプ?.......

ディスカッション

プロトコルは、低通路ベロ細胞におけるoHSVの増殖から始まる。Vero細胞単層の合流率は、増殖細胞がVero細胞20へのoHSVの侵入を減少させることができるタイトな線維構造を開発することができるので、ウイルス接種時に^〜80%であるべきである。90〜100%CPEが観察されると、培養上清が除去され、細胞が収穫され、VB/上清(ステップ1.4.6を参照)に再懸濁され、スナップ凍結、後で精.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.7 mL centrifuge tubes	Sigma	CLS3620
15 mL polypropylene centrifuge tubes	Falcon	352097
5 mL polypropylene tubes	Falcon	352063
50 mL polypropylene centrifuge tubes	Falcon	352098
6-well cell culture plates	Falcon	353046
Benzonase Nuclease	Sigma	E8263-25KU
Cell scraper	Fisher Scientific	179693
Dimethyl sulfoxide	Sigma	D2650-100ML
Dulbecco’s Modified Eagle Medium	Corning	MT-10-013-CV
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline	Corning	MT-21-031-CV
Fetal Bovine Serum	Hyclone	SH3007003
Giemsa Stain	Sigma	G3032
Glutaraldehyde	Fisher Scientific	50-262-23
Glycerol	Sigma	G5516
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS)	Corning	MT-21-021-CV
High-Glucose Dulbecco’s Phosphate-buffered Saline	Sigma	D4031
Human immune globulin	Gamastan	NDC 13533-335-12
Magnesium chloride	Fisher Chemical	M33-500
Media Sterilization filter, 250 mL	Nalgene, Fisher Scientific	09-740-25E
Media Sterilization filter, 500 mL	Nalgene, Fisher Scientific	09-740-25C
Neutral Red solution	Sigma	N4638
Paraformaldehyde	Fisher scientific	15710S
Plate rocker	Fisher	88861043
Potassium Ferricyanide	Sigma	P8131
Potassium Ferrocyanide	Sigma	P9387
Sodium chloride	Fisher Chemical	S271-3
Sorvall ST 16R Centrifuge	ThermoFisher Scientific	75004381
Sorvall ST 21R Centrifuge	ThermoFisher Scientific	75002446
Sterile Microcentrifuge Tubes with Screw Caps	Fisher Scientific	02-681-371
Sucrose	Fisher Scientific	BP220-1
Syringe Filter, 0.45 PVDF	MilliporeSigma	SLHV033RS
Syringe Filter, 0.8 MCE	MilliporeSigma	SLAA033SS
Syringe filter, 5 µm PVDF	MilliporeSigma	SLSV025LS
T150 culture flask	Falcon	355001
Tris-HCl	MP Biomedicals LLC	816116
Ultrasonic water bath	Branson	CPX-952-116R
X-gal	Corning	46-101-RF