秋ミミミズ、スポドプテラ・フルギペルダにおける超活性ピギーバツトランスポザーゼ媒介性生殖細胞変容

要約

秋のミズ、 スポドプテラ・フルギペルダでの生殖細胞系列変換に成功し、多動 性ピギーババトランス ポザーゼのmRNAを用いて達成した。

要約

トランスポーザブル要素を用いた昆虫ゲノムへの遺伝貨物の安定的な挿入は、機能的ゲノム研究と遺伝的害虫管理戦略の開発のための強力なツールです。昆虫変換で最も使用されるトランスポーザ要素はピギーバクであり、ピギーバク系生殖細胞系列変換はモデル昆虫で正常に行われている。しかし、この技術を農業害虫を含む非モデル昆虫に採用することは依然として困難です。本論文は、多動性ピギーバツトランスポザーゼ(hyPBase)を用いた世界的な農業害虫、秋のミズ(FAW)、スポドプテラ・フルギペルダの生殖細胞系列転換について報告する。

この研究では、hyPBase mRNAを生成し、胚マイクロインジェクションでヘルパープラスミドの代わりに使用した。この変化は、トランスジェニックFAWの生成に成功しました。さらに、トランスジェニック動物のスクリーニング方法、トランスジーン挿入のPCRベースの迅速な検出、および熱非対称インターレースPCR(TAIL-PCR)ベースの統合部位の決定、および、インテグレーション部位の決定についても説明する。したがって、この論文は、FAWおよび他の鱗翅目昆虫における ピギーバックベースのトランスジェネシスを促進するトランスジェニックFAWを産生するプロトコルを提示する。

概要

秋のミミズ(FAW)、スポドプテラフルギペルダは、アメリカの熱帯および亜熱帯地域に自生しています。現在、これは世界100カ国以上で壊滅的な昆虫草食動物^です。FAW幼虫は、いくつかの重要な主食作物²を含む350以上の宿主植物を供給する。FAW成人の強い移住能力は、アメリカ大陸から他の場所への最近の急速な広がりに貢献^{しています1,}2 .その結果、この昆虫は現在、国際的に食料安全保障を脅かしています。新しい技術を適用すると、FAWの高度な研究を容易にし、この害虫を管理するための新しい戦略を提供することができます。

昆虫生殖細胞系列の形質転換は遺伝子機能を研究し、遺伝子制御^3,4で使用するトランスジェニック昆虫を生成するために用いられている。昆虫の遺伝的変換を達成するために使用される様々な方法の中で、ピギーバクト元素ベースの方法は、最も使用される方法⁵です。しかし、転位率が低いため、非モデル昆虫のトランスジェネシスを行うことは依然として困難です。最近、ピギーバクトランスポザーゼ(hyPBase)の多動バージョンが^6,7を開発した。生殖細胞系の形質転換は、最近⁸号機で達成されたが、これは鱗翅目昆虫にhyPBaseを使用した最初の報告である。本報告では、トランスジェニックFAWの生成におけるhyPBase mRNAの採用に関する詳細な情報が記載されている。ここで説明する方法は、他の鱗翅目昆虫の形質転換を達成するために適用することができる。

プロトコル

1. ハイプベースmRNAの インビトロ 合成

注:hyPBaseシーケンスの完全なコーディングシーケンスを合成し、pTD1-Cas9ベクターに挿入しました( 材料表を参照)、hyPBase発現カセット、T7プロモーターを含むpTD1-hyPBaseコンストラクトを生成します:ポリヘドリン-5' UTR:hyPBase:ポリヘドリン-3' UTR:ポリ(A)。pTD1-hyPBase コンストラクトの完全なシーケンスは 、補足資料に用意されています。

1. インビトロ合成のためのテンプレートの調製
   1. 前方プライマー、5'-atgcgggtgtgaaatgcacagatg-3'、および逆プライマー5'-タガッカッグカグッタタグ3'、高忠実度ポリメラーゼ、およびpTD1-hyPBaseプラスミドを使用して、hyPBase発現カセットを増幅するPCR反応を実行します。
      注:PCR反応(最終体積50 μL)には、5.0 μLの10x反応バッファーが含まれています。 4.0 μLの10 mMデオキシヌクレオシド三リン酸(dNTP)、プラスミド1.0 μL(50 μg/μL)、1.0 μLの高忠実度ポリメラーゼ、1.0 μLそれぞれ10μM前方および逆プライマー、および33μLのヌクレアーゼを含まない水。設定は、3分間95°C、10sの98°C、15sの60°C、2分間68°Cの35サイクルの初期インキュベーションを行った。
   2. 新鮮なトリス酢酸エチレン酢酸(TAE)バッファーで120Vの1%アガロースゲルでPCR産物を30分間チェックし、ゲル抽出キットで製品を精製します。
      注: PCR 製品の精製キットは使用しないでください。pTD1-hyPBaseプラスミドの微量であっても、 インビトロ 合成の効率が著しく低下する。
2. 商用キットを用いたhyPBase mRNAのインビトロ合成
   1. 凍結した試薬を完全に解凍し、酵素と2倍のNTP/CAP溶液を氷上に保ち、解凍した10倍の反応バッファーを室温にしておきます。
   2. 2x NTP/CAP溶液:10 μLを加えて、室温で反応を組み立てます。10x反応バッファー:2 μL;テンプレートDNA:0.1-0.2 μg;酵素ミックス:2 μL;ヌクレアーゼフリー水を20μLにする。
   3. 混合物を上下に軽くピペット化して試薬を十分に混ぜ、37°Cで2〜4時間インキュベートします。
3. 塩化リチウム沈殿による合成mRNAの回収
   1. 30 μLのLiCl沈殿液を加え、チューブをフリックして十分に混ぜ合わせ、-20°Cで30分間≥。
   2. 4°Cで最大速度で15分間遠心分離機を使用し、上清を慎重に取り除きます。
   3. ペレットを1mLの70%エタノールで1回洗い、再遠心分離機を使用し、上清を慎重に取り除きます。
   4. ペレットを室温で1〜2分間乾燥させ、20~40 μLのヌクレアーゼを含まない水でペレットを再懸濁します。
   5. mRNA溶液を1μLのヌクレアーゼフリー水で希釈します。2 μLを取ってmRNA濃度を決定し、8 μLを使用して、新鮮なTAEバッファーで100 Vの1%アガロースゲルのmRNA品質を40分間チェックします。
   6. アリコートmRNA溶液を、-70°Cで1年間冷凍保存する。
      注:mRNAペレットを完全に乾燥させないでください。水に溶かすのが難しいかもしれません。

2. マイクロインジェクション

1. 卵のコレクション
   1. 12匹のオスの子犬と12匹の雌の子犬を15cm x 15cm x 10 cmの箱に入れます。箱をペーパータオルで覆います。大人に餌を与える箱の中に10%のスクロース溶液を入れます。
   2. 2日目のポストエローションでは、一晩で強烈な光に成人をさらします。
   3. 3日目のポストエローションでは、大人をステップ2.1.2から暗い場所に移します。卵位後2時間以内に胚を収集する。
   4. 新鮮な卵を氷の上のペトリ皿に入れておいたペーパータオルに水を加えます。細かいブラシで卵をグラススライドにそっと移し、グラススライドの上に一つずつ揃えます。マイクロインジェクションの前に氷の上に整列した卵でガラススライドを保ちます。
2. マイクロインジェクションのセットアップ
   1. トランスジェニック強化緑色蛍光タンパク質(EGFP)発現プラスミド(200 ng/μL)、pBac:hr5ie1-EGFP-SV40、hyPBase mRNA(200 ng/μL)、無菌蒸留水を卵に注入し、自動マイクロインジェクターの補償圧力を使用します( 材料表を参照)。
   2. 注入した卵は27±1°C、60±10%の相対湿度で孵化するまで保管してください。
   3. 孵化した幼虫を人工食で食べ、初期の3^番目 のインスターステージ(約6mmの長さ、体の色が黒くなる)で各幼虫を1つの小さなカップに移します。

3. 蛍光スクリーニングと遺伝子交差

1. 子犬を収集し、35 cm x 35 cm x 35 cmケージに~150匹の雌の子犬と~150匹のオスの子犬を入れます。卵を集めるために、紙タオル(約30cm x 15cm)を数枚かけてケージに入れます。
2. 毎日卵と一緒にペーパータオルを集め、卵を孵化するまで27±1°C、60±10%の相対湿度に保ちます。
3. 新生児の幼虫を固定化するために5分間4°Cに保ち、氷冷プレートに移します。
4. 蛍光体顕微鏡で固定化された新生児幼虫をスクリーニングします。EGFP陽性新生児を選択し、27±1°Cで〜2週間でプパルステージに上げ、腹側腹部のセグメントでの表現型の違いに応じて性別によって分離します。
   注:女性の子犬は、8番目の腹部セグメントにスリットのような生殖器の開口部を有し、性器開口部に向かって曲がる9番目と10番目のセグメントの頭蓋マージンを有する。雄の子犬の生殖器の開口部は、9番目の腹部のセグメントにわずかな上昇を有する。
5. EGFP陽性の子犬と異性の野生型の子犬を男性に入れる:ケージ内の女性比1:1。Sibは、以下の世代を生産するためにEGFP発現大人を横断する。

4. トランスジェニック挿入の PCR 検出

1. 野生型およびEGFP陽性の個々の幼虫から、メーカーの指示に従って任意の市販のゲノムDNA抽出キットを使用してゲノムDNAを抽出します。
2. ゲノムDNAをテンプレートとして使用してPCR反応を行う;ie1プロモーター領域にある前方プライマー、5'-acgtacgcttc-3'逆プライマー、5'-aagcactgcacgccgtcag-3'変換ベクトルのEGFP領域に位置する。
3. 各PCR反応(最終体積40μL)を設定し、ポリメラーゼ混合物20μL、ゲノムDNA1.0μL(40μg/μL)、1.0 μLそれぞれ10μM順および逆プライマー、17μLのヌクレアーゼを含まない水を含みます。初期インキュベートは3分間95°C、20sは95°C、20sは56°C、40s設定では68°Cの初期インキュベーションを行います。
4. 120 Vの1%アガロースゲルでPCR産物を30分間チェックします。

5. トランスジェニック挿入部位の決定

1. EGFP陽性昆虫中の遺伝子導入の統合部位を決定するためのテンプレートとしてゲノムDNAを用いて高効率TAIL-PCRを行う。
   1. PCR反応は、他の場所で説明した手順⁹に従って行う。
      1. P1:5'-アカグガクトクタコカチカクチャク-3'、P2:5'-tcacgggctagccgactg-3'、およびP3:5'-アクトクトガクカクガッコッグcgct-3'の3つのプライマーを使用してください。
2. 最終的な PCR 製品をシーケンスして、統合サイトを決定します。

結果

ハイPBase含有T7プロモーターの発現のための構築物:ポリヘドリン-5'UTR:hyPBase:ポリ(A)シグナルを生成し、体外でhyPBase mRNAを合成するために〜2.2kbのPCR断片として増幅した(図1B)。次いで、hyPBase mRNAを製造し、アガロースゲル電気泳動を行った。予想サイズのmRNA(約1.1kbバンド)を1%アガロースゲルで検出した(図1C)。

ディスカッション

転位率が低く、トランスジェニック成分を新鮮な胚に送達するのが難しいため、多くの非モデル昆虫、特に順番による生殖細胞質変態の成功が制限されます。生殖細胞系列の変換速度を高めるために、最も広く使用されているピギーババトランスポザーゼ(hyPBase)の多動バージョンが^7,10を開発した。現在までに、鱗翅目昆虫における生殖細胞?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5" Dental Cotton Rolls	PlastCare USA	8542025591	REARING
1 oz Souffle Cup Lids	DART	PL1N
1 oz Souffle Cups	DART	P100N	REARING
48 oz Plastic Deli Containers	Genpack	AD48	REARING
Add-on Filter Set (Green)	NightSea LLC	SFA-BLFS-GR	SCREENING
Borosilicate Glass	Sutter Instruments	BF100-50-10	INJECTION
Borosilicate Glass	SUTTER INSTRUMENT	BF-100-50-10
Dissecting Scope	Nikon	SMZ745T	SCREENING
Featherweight Forceps	BioQuip	4750	REARING
Gutter Guard	ThermWell Products	VX620	REARING
Inverted Microscope	Olympus	IX71	INJECTION
Microinjector	Narishige	IM-300	INJECTION
Micropipette Puller	Sutter Instruments	P-1000	INJECTION
Microscope Slides	VWR	16004-22	INJECTION
NightSea Full System	NightSea LLC	SFA-RB-DIM	SCREENING
Nitrogen Gas	AWG/Scott-Gross	NI 225	INJECTION
Paper Towels	Bounty	43217-45074	REARING
Spodoptera frugiperda Artificial Diet	Southland Products, Inc	N/A [Request Species/Quantity]	REARING
Spodoptera frugiperda Eggs	Benzon Research, Inc	N/A [Request Species/Quantity]	REARING
Taq MasterMix			polymerase mixture