肺への癌転移を調査するための永久的な窓

要約

ここでは、肺の高解像度の生体内イメージングを可能にするマウス胸郭用の永久に留置された光学窓の外科的移植のためのプロトコルを提示する。ウィンドウの永続性は、肺の動的細胞プロセス、特に播種された腫瘍細胞の転移進行など、ゆっくりと進化している細胞プロセスの研究に適しています。

要約

転移は、がん関連死亡率の90%を占め、原発性腫瘍から骨、脳、肺などの二次部位への癌細胞の全身的な広がりを伴う。広範囲に研究されているが、このプロセスの機械主義的な詳細は十分に理解されていない。コンピュータ断層撮影(CT)、陽電子放出断層撮影(PET)、磁気共鳴画像法(MRI)を含む一般的なイメージングモダリティは、様々な程度の総可視化を提供しますが、それぞれが個々の腫瘍細胞のダイナミクスを検出するために必要な時間的および空間的解像度を欠いています。これに対処するために、一般的な転移部位の生体内イメージングに関する多数の技術が説明されている。これらの部位のうち、肺は生命を維持する上での繊細さと重要な役割のために、生体内画像へのアクセスに特に困難であることが証明されている。インタクトな肺の単一細胞内生体イメージングにはいくつかのアプローチが以前に記載されているが、すべて非常に侵襲性および末期の手順を伴い、可能な限り最大のイメージング期間を6〜12時間に制限する。ここで説明する、肺の高解像度イメージングのための低侵襲胸部光学窓(WHRIL)の恒久的な移植のための改良された技術である。マイクロカートグラフィーに適応したアプローチと組み合わせることで、革新的な光学窓は、複数のイメージングセッションにわたって単一細胞解像度で無傷の肺の連続的なインビタルイメージングを容易にし、数週間にわたる。イメージングデータを収集できる前例のない時間を考えると、WHRILは、転移性の進行と肺内の多数の追加の生物学的プロセスの基礎となる動的メカニズムの加速的発見を促進することができます。

概要

死亡の90%を占める、転移は癌関連死亡率の主な原因^である1。臨床的に観察された転移(骨、肝臓、肺、脳⁾²の主要部位の中で、肺は、生体内顕微鏡による 生体内 イメージングに特に挑戦的であることが証明されている。これは、肺が永久的な動きの繊細な器官であるためです。肺の連続運動は、胸腔内心臓運動によってさらに複合され、正確な画像化に対する実質的な障壁を表す。したがって、高解像性生体内光学画像化のためのモダリティに対する相対的なアクセス不能のために、肺内の癌増殖は、しばしばオカルトプロセス³とみなされてきた。

臨床現場では、コンピュータ断層撮影(CT)、陽電子放射断層撮影(PET)、磁気共鳴画像法(MRI)などの画像技術により、肺⁴などのインタクトな重要な器官の奥深くで可視化が可能になる。しかし、これらのモダリティは、グロス臓器の優れた見解を提供するが(多くの場合、臨床症状の発症前に病理を明らかにすることさえある)、転移の初期段階を進める個々の播種腫瘍細胞を検出するには不十分な分解能である。その結果、前述のモダリティが肺に転移の兆候を提供する時点で、転移性病巣はすでに十分に確立され増殖している。腫瘍微小環境は癌進行及び転移形成^5,6において極めて重要な役割を果たすため、生体内で転移性播種の最も早いステップを調査することに大きな関心がある。この関心は、原発性腫瘍が検出される前でさえ癌細胞が広まることの増加の評価によってさらに促進される^7,8そしてそれらがマクロ転移に成長する前に数十年から数十年休眠状態で生き残る証拠を増加させる^9.

以前は、単一細胞分解能での肺のイメージングは、必ずしも^{10、11、12、13}のex vivoまたは外植の調製を伴い、分析を単一の時点に制限していた。これらの調製物は有用な情報を提供するが、それらは無傷の循環系に接続された器官内の腫瘍細胞のダイナミクスに関する洞察を提供しない。

イメージングにおける最近の技術の進歩により、12時間^14、15、16までの期間にわたって単一細胞分解能で無傷の肺の生体内可視化が可能^になった。これは、機械的換気、胸部の切除、真空支援肺固定化を含むプロトコルを使用してマウスモデルで達成された。しかし、生理学的に無傷の肺の最初の単一細胞分解能画像を提供したにもかかわらず、この技術は非常に侵襲性および末端であり、それによって、インデックス手順を超えてさらなるイメージングセッションを排除する。この制限は、従って、12時間を超える転移ステップの研究への応用を妨げる、例えば、休止状態および成長^14、15、16の再開始などである。さらに、このイメージング手法を用いて観察された細胞行動のパターンは、真空による圧力差が血流の転換を引き起こす可能性があることを考えると、慎重に解釈されなければならない。

これらの制限を克服するために、肺の高解像度イメージングのための低侵襲窓(WHRIL)が最近開発され、機械的換気^を必要とせずに、数日間から数週間にわたって連続画像化を促進する。この技術は、正常な肺機能の保存のための密閉胸腔を有する「透明な胸部」の作成を伴う。この手順は十分に許容され、ベースラインの活動と機能を意味のある変更なしにマウスが回復することを可能にする。それぞれのイメージングセッションで全く同じ肺領域を確実に局地化するために、マイクロカートグラフィとして知られる技術をこの窓¹⁸に適用した。この窓を通して、肺の血管床に到着し、内皮を横切り、細胞分裂を受け、微小転移に成長する細胞の画像を捕捉することが可能であった。

ここでは、WHRILの移植のための改善された外科プロトコルの詳細な説明を提示し、同時にその再現性と品質を高めながら手術を簡素化する。このプロトコルは転移の根底にある動的プロセスの調査を可能にするように設計されたが、この技術は肺生物学および病理学の多数のプロセスの調査に代わり適用されるかもしれない。

プロトコル

このプロトコルに記載されているすべての手順は、アルバート・アインシュタイン医科大学の施設動物ケアおよび使用委員会の事前承認を含む脊椎動物の使用に関するガイドラインおよび規制に従って行われています。

1. 窓のパッシベーション

1. 光学窓枠(補足図2)を、酵素活性洗剤の1%(w/v)溶液で洗い上げ
2. ガラス瓶の中に、光窓フレームを70°Cで30分間水酸化ナトリウム溶液5%(w/v)に沈めます。
3. 脱イオン水で窓枠を取り出して洗います。
4. 新しいガラス瓶の中に、光学窓枠を55°Cで10分間クエン酸溶液7%(w/v)に沈めます。
5. 再度、脱イオン水で窓枠を取り出して洗います。
6. ステップ 1.2 を繰り返します。その後、脱イオン水で窓枠を取り出して洗います。

2. 手術の準備

1. フードまたはラミナーフローキャビネットで手術を行います。手術分野の汚染を避けるために、それぞれ準備、手術、および回復のための明確な分離された領域を確保する。
2. 手術の前に、オートクレーブ内のすべての手術器具を殺菌する。後続の手順が計画されている場合は、ホットビーズ滅菌器を使用して器具を再殺菌します。この外科的処置のために、先端のみの技術が使用される。
3. 加熱された外科ビーズとビーズの滅菌器に電源を入れ。
4. 麻酔室で5%イオブルランでマウスを麻酔します。
5. 毛髪を除去するには、左上胸部切開部位に脱毛クリームをたっぷり塗布する。20s以下の後、湿らせたティッシュペーパーを使用して髪と脱毛クリームをしっかりと拭き取ります。必要に応じて繰り返し、手術部位からすべての毛髪を取り除きます。
6. 2-0 シルク縫合を使用して、22 G カテーテルの基部で結び目を結び、2 インチの長い尾を残します ( 図 1Aを参照)。

3. 肺窓手術

1. 防腐石鹸を使って手を洗います。
2. 新しい手術を行う前に、新しい無菌手袋を着用してください。
3. 角膜乾燥やマウスの目の損傷を防ぐために、両眼に眼科軟膏を塗布してください。
4. 90 μLの無菌PBSでブプレノルフィンを10 μL(0.1 mg/kg)希釈し、術前の鎮痛を確実にするために皮下注射を行います。
5. シルク縫合糸で結ばれた22Gカテーテル¹⁵でマウスを挿管する。インフレ球根を使用して、電球スクイーズ時に両側の胸部上昇に基づいて挿管に成功したことを確認する。
6. 2-0 シルク縫合糸をマウスのスナッと結んで挿管カテーテルを固定します( 図1Bを参照)。
7. 加熱された外科用スタンドにマウスを置き、右横の褥瘡に置いて左胸郭を露出させます。
8. 挿管カテーテルに人工呼吸器を接続します。
9. 換気装置の制御され、安定した換気を保障し、イオブルオレアンを3%に下げる。手順の発症時および手順の期間を通して定期的に、つま先ピンチテストを行うことによって麻酔の妥当性を評価する。
10. 紙テープを使用して、前肢と後肢をそれぞれ加熱された外科段階に固定する。マウスの背中の長さにテープをもう 1 枚置くと、外科分野への露出を最大限に高めます ( 図 1Cを参照)。
11. 無菌性の維持のためにフードの下のすべての外科器具を開く。
12. マウスの皮膚に消毒剤の寛大な適用によって外科部位を殺菌する。
13. 鉗子を使用して、皮膚を持ち上げて~10mmの円形切開をし、胸骨の左に~7mm、肋骨下マージンより約7mm優れた(図1D)。
14. 主要な容器を慎重に特定する。容器の分割が必要な場合は、止まり止まりを維持するために電気焼灼ペンで両端を焼灼する。
15. 肋骨の上に柔らかい組織を物品化します。
16. 鉗子を使用して6^番目または7^番目の肋骨を高めます。鈍いマイクロ解剖ハサミの単一の刃を使用して、丸みを帯びた側を肺に向かって、6^番目と7^番目の肋骨の間の肋間筋を慎重に突き刺して胸腔内空間に入る(図1E)。
17. 欠陥時に圧縮空気キャニスターを繊細に排出し、肺を崩壊させ、胸壁から分離します。肺の肺損傷を防ぐために、短いバーストで圧縮空気を発射します。
18. 切削工具(補足図1)の上に生検パンチを置き、肋間切開を通して切削工具のベースを慎重に操縦する(図1F)。
19. 切削工具のベースを胸壁と平行になるように向けます。リブケージに5mmの円形の穴を開けます(図1G)。
    注:露出した肺組織が損傷の兆候なしにピンクであることを確認してください。
20. 5-0シルク縫合糸を使用して、穴から〜1mmの財布ひもステッチを作成し、周回して、肋骨とインターレースを行います(図1H)。
21. 円形の欠陥の端がウィンドウの溝の内側に揃うようにウィンドウフレームを配置します( 図 1Iを参照)。
22. 5-0シルク縫合糸をしっかりと結ぶことで、埋め込まれた窓をしっかりとロックします。
23. 1 mL シリンジにシアノアクリル酸ゲル接着剤を 100 μL に荷重します。
24. ~10~20sの圧縮空気を安定して流して肺を乾かす(図1J)。
25. 鉗子を使用して窓枠を外側の端でつかみ、静かに持ち上げて、窓枠の下面から肺を分離させます。
26. 光学窓枠の下面に沿ってシアノクリレート接着剤の薄い層を分配する(図1K)。
27. 呼吸器の正の終気圧(PEEP)を増加させ、肺を膨らまします。
28. 10~20sを保持し、穏やかで堅固な圧力をかけて、光窓枠を肺組織に取り付けます(図1L)。
29. 残りのシアノクリレートゲル接着剤の5mmの滴を長方形のカバースリップに分配する。
30. 真空ピックアップを使用して5 mmカバースリップをピックアップします。カバースリップの下面を接着剤に浸し、非常に薄い層だけが残るような長方形のカバースリップの側面に対して余分な接着剤を3回削り取ります(図1M)。
31. カバースリップを慎重に配置して、光窓フレームの中央に凹部の内側に収まり、肺組織の上に角度を持たなければなりません。人工呼吸器を短くクランプして、肺を超膨張させる陽圧を発生させる。回転運動を使用して、カバースリップを肺組織に平行に向けて、肺の表面とカバースリップの下面との間に直接割り当てを作成します。穏やかな圧力を維持し、シアノアクリル酸接着剤をセット(〜25s)にします。
32. 鉗子を使用して、カバースリップと真空ピックアップを分離します(図1N)。
33. 5-0シルク縫合糸を使用して、再び財布ひもステッチを作成し、今度は皮膚切開部のカットエッジから周回に1mm<。ロックノットでしっかりと結ぶ前に、窓枠の外縁の下に余分な皮膚をタックします。
34. カバースリップと窓枠の間に気密シールを確保するには、金属ガラスインターフェイスで少量の液体シアノアクリルを分配します( 図1Oを参照)。
35. 1 mL インシュリンシリンジに無菌の針を取り付けます。針をxiphoidプロセスの下に挿入し、左肩に向かって進み、横隔膜を通って胸腔に入ります。シリンジを軽く引き戻して、胸腔から残った空気を取り除きます( 図1Pを参照)。
36. マウスからテープを取り外します。
37. イオフルランをオフにします。
38. マウスが目覚める準備が整うまで、酸素を100%で換気を続けます。
39. 慎重にマウスのスナ出の周りに2-0シルク縫合糸をカットし、マウスを抜き出します。
40. マウスをクリーンケージに移し、完全に回復するまで監視します。呼吸困難の兆候が存在する場合は、マウスを安楽死させる。
41. 90 μL の無菌リン酸緩衝液 (PBS) で希釈したブプレノルフィンの 10 μL (0.1 mg/kg) を皮下注射して術後鎮痛を提供します。

結果

このプロトコルで説明する外科的処置のステップを要約し、図1に示す。簡単に言えば、手術の前に、マウスは麻酔を受け、左胸郭の上の毛は取り除かれる。マウスは、胸腔の破られた時の生存を可能にするために挿管され、機械的に換気される。肋骨の上に重なっている軟部組織が切除され、小さな円形の欠陥が作成され、6^番目と7^番目の肋骨にまたが...

ディスカッション

肺などの遠隔転移部位では、高解像光学イメージングは、腫瘍細胞転移の精巧なダイナミクスに関する洞察を提供する。単一癌細胞の 生体内 可視化と宿主組織との相互作用を可能にすることにより、高解像インビタルイメージングは、転移の根底にあるメカニズムを理解するのに役立つ証明された。

ここで説明する、高解像多光子顕微鏡を介してマウス肺の連続...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1% (w/v) solution of enzyme-active detergent	Alconox Inc	N/A	concentrated, anionic detergent with protease enzyme for manual and ultrasonic cleaning
2 µm fluorescent microspheres	Invitrogen	F8827
5 mm coverslip	Electron Microscopy Sciences	72296-05
5% (w/v) solution of sodium hydroxide	Sigma-Aldrich	S8045
5% Isoflurane	Henry Schein, Inc	29405
5-0 braided silk with RB-1 cutting needle	Ethicon, Inc.	774B
7% (w/v) solution of citric acid	Sigma-Aldrich	251275
8 mm stainless steel window frame	N/A	N/A	Custom made, Supplementary Figure 2
9 cm 2-0 silk tie	Ethicon, Inc.	LA55G
5 mm disposable biopsy punch	Integra	33-35-SH
Blunt micro-dissecting scissors	Roboz	RS-5980
Brass window tool holder	N/A	N/A	Custom-made, Supplemental Figure 3
Buprenorphine	Hospira	0409-2012-32
Cautery pen	Braintree Scientific	GEM 5917
Chlorhexidine gluconate	Becton, Dickinson and Company	260100	ChloraPrep Single swabstick 1.75 mL
Compressed air canister	Falcon	DPSJB-12
Cyanoacrylate adhesive	Henkel Adhesives	LOC1363589
Fiber-optic illuminator	O.C. White Company	FL3000
Bead sterilizer	CellPoint Scientific	GER 5287-120V	Germinator 500
Graefe forceps	Roboz	RS-5135
Infrared heat lamp	Braintree Scientific	HL-1
Insulin syringes	Becton Dickinson	329424
Isoflurane vaporizer	SurgiVet	VCT302
Jacobson needle holder with lock	Kalson Surgical	T1-140
Long cotton tip applicators	Medline Industries	MDS202055
Nair	Church & Dwight Co., Inc.	40002957
Neomycin/polymyxin B/bacitracin	Johnson & Johnson	501373005	Antibiotic ointmen
Ophthalmic ointment	Dechra Veterinary Products	17033-211-38
Paper tape	Fisher Scientific	S68702
Murine ventilator	Kent Scientific	PS-02	PhysioSuite
Rectangular Cover Glass	Corning	2980-225
Rodent intubation stand	Braintree Scientific	RIS 100
Small animal lung inflation bulb	Harvard Apparatus	72-9083
Stainless steel cutting tool	N/A	N/A	Custom made, Supplementary Figure 1
Sulfamethoxazole and Trimethoprim oral antibiotic	Hi-Tech Pharmacal Co.	50383-823-16
SurgiSuite Multi-Functional Surgical Platform for Mice, with Warming	Kent Scientific	SURGI-M02	Heated surgical platform
Tracheal catheter	Exelint International	26746	22 G catheter
Vacuum pickup system metal probe	Ted Pella, Inc.	528-112