免疫組織化学のための合成抗原コントロール

要約

この研究は、免疫組織化学のための合成抗原コントロールを作成する簡単な方法を文書化しています。この技術は、広範囲の濃度で様々な抗原に適応可能である。サンプルは、アッセイ内およびアッセイ間の性能と再現性を評価するための基準を提供します。

要約

免疫組織化学(IHC)アッセイは、タンパク質発現パターンに関する貴重な洞察を提供し、その信頼性の高い解釈には、十分に特徴付けられた陽性および陰性対照サンプルが必要です。適切な組織または細胞株コントロールが常に利用できるとは限らないため、合成IHCコントロールを作成する簡単な方法が有益であり得る。このような方法をここで説明する。これは、タンパク質、ペプチド、またはオリゴヌクレオチドを含む様々な抗原タイプに、広範囲の濃度で適応可能である。このプロトコルは、様々な診断的に関連する抗体によって認識されるヒト赤芽球性癌遺伝子B2(ERBB2/HER2)細胞内ドメイン(ICD)からのペプチドを例として用いて、合成抗原コントロールを作成するために必要なステップを説明する。ウシ血清アルブミン(BSA)溶液中のHER2 ICDペプチドの段階希釈物をホルムアルデヒドと混合し、85°Cで10分間加熱してペプチド/BSA混合物を固化および架橋する。得られたゲルは、組織のように処理、切片化、および染色することができ、広範囲の染色強度にまたがる既知の抗原濃度の一連のサンプルを生じる。

この単純なプロトコルは、日常的な組織学ラボ手順と一致しています。この方法は、ユーザが所望の抗原の十分な量を有することのみを必要とする。関連するエピトープをコードする組換えタンパク質、タンパク質ドメイン、または直鎖状ペプチドは、局所的または商業的に合成され得る。社内抗体を生成するラボは、免疫抗原のアリコートを合成制御標的として予約することができます。幅広い濃度にわたって明確に定義されたポジティブコントロールを作成する機会により、ユーザーは実験室内および実験室間のアッセイ性能を評価し、アッセイのダイナミックレンジと直線性に関する洞察を得て、特定の実験目標に合わせてアッセイ条件を最適化することができます。

概要

免疫組織化学(IHC)は、ホルマリン固定パラフィン包埋(FFPE)組織切片における標的抗原の高感度かつ特異的で空間的に正確な検出を可能にします。しかし、IHC染色結果は、温冷虚血時間、組織固定、組織前処理、抗体反応性および濃度、アッセイ検出化学、および反応時間¹を含む複数の変数によって影響を受ける可能性がある。したがって、IHC反応の再現性のある性能および解釈には、これらの変数の厳密な制御、および十分に特徴付けられた陽性および陰性対照サンプルの使用が必要である。頻繁に使用される対照には、目的抗原を発現するために独立した分析から知られているパラフィン包埋組織または培養細胞株が含まれるが、そのようなサンプルは必ずしも利用可能ではない¹。さらに、組織および細胞株対照における標的抗原の発現レベルは、一般に定性的にのみ理解され、可変であり得る。再現可能で正確に既知の濃度の標的抗原を含むコントロールは、IHC反応条件の最適化を支援することができます。合成IHC対照試料を作成するために生理学的に関連する濃度範囲で様々な抗原タイプに適応可能な一般的な方法が、著者^ら2によって記載されている。ここでは、このタイプの標準の作成と使用のための詳細なプロトコルを提供しています。

適切なコントロールは、IHCアッセイ¹、^3、4の有効な解釈に不可欠である。組織、培養細胞、およびペプチドコーティングされた基質は、研究者の特定のニーズに応じてIHC対照として採用されている。組織をIHC対照として使用することに内在する利点と限界は、広範囲に議論されてきた^1,4。多くの抗体について、適切なコントロールを、広いダイナミックレンジにわたって標的抗原を発現する細胞集団を含む選択された正常組織から選択することができる。組織対照は、標的抗原が発現部位または存在量に関して十分に特徴付けられていない場合、または潜在的に交差反応する抗原が同じ細胞または組織部位で共発現される場合にはあまり適さない。これらの文脈において、目的抗原を発現する培養細胞株のブロックが有用であり得る。標的特異性のさらなる証拠を提供するために、細胞株は、標的抗原を過剰発現または過小発現するように操作することができる。例えば、このようなアプローチは、最近、PD−L1抗原⁵の範囲を発現する同種性細胞株の組織マイクロアレイを用いた様々な抗PD−L1アッセイを評価するために使用された。細胞株ブロックの日常的な使用に対する実際的な制限には、十分な細胞数を生成するのに必要なコストと時間、およびクローン^細胞株6内でも、一部の抗原の発現が確実に一貫していない可能性があるという事実が含まれます。合成ペプチドは、短い線状エピトープを認識する抗体のIHCコントロールの3番目の選択肢です。今回、Steven Bogenたちの研究グループは、スライドガラス^7,8およびガラスビーズ⁹の表面に結合させたペプチドの使用について広く発表している。このグループによるある研究は、ペプチドベースのIHC対照の定量的分析が、並行して分析された組織対照の定性的評価によって見逃された染色プロセス変動を検出できることを実証した¹⁰。ビーズベースの抗原を使用する標準は広く適用可能である可能性があるが、多くの詳細は著者に独占的であり、広範な採用を制限している。

IHC標準に対する別のアプローチは、人工的に作成されたタンパク質ゲルに標的抗原を組み込む。この概念は、1972年にPer Brandzaegによって、正常なウサギ血清がグルタルアルデヒド¹¹を使用して重合された研究で初めて実証されました。次いで、得られたゲルの小さなブロックを、様々な濃度で目的の免疫グロブリン抗原を含む溶液に1〜4週間浸漬した。アルコール固定およびパラフィン包埋後、得られた対照の切片は、それらが浸漬された抗原溶液の対数に対応する強度で染色されることが示された。その後、研究者らは、免疫電子顕微鏡研究における陽性対照として、希釈BSAまたは脳ホモジネート溶液中の特定のアミノ酸のグルタルアルデヒドコンジュゲートを調製した^12,13。より最近の研究は、質量分析におけるFFPE組織の代用物としてのホルムアルデヒド固定タンパク質溶液から作られたゲルの使用を調査した¹⁴。別の最近の研究は、ヒトまたはウシの血清アルブミン溶液を様々な濃度および^pH15で加熱することによって形成されるゲルの構造および特性を調査した。これらの著者らは、血清アルブミンが実験条件に応じて機械的弾力性、二次構造保存、脂肪酸結合能が異なる3種類のゲルを形成することを見出した。これらの論文は、ここで採用されているアプローチの一般的な実現可能性を示しています。定義された組成のタンパク質溶液は、日常的な組織学的方法を使用してさらに処理、切片化、および染色することができる組織様ゲルを作成する。

このプロトコールは、熱およびホルムアルデヒドで重合されたウシ血清アルブミン(BSA)から作製された合成IHCコントロールの形成を記載している。ゲルには、完全長タンパク質、タンパク質ドメイン、および直鎖状ペプチドを含む多種多様な抗原、ならびにオリゴヌクレオチド²を含む非タンパク質抗原を組み込むことができる。この実証では、ヒトERBB2(HER2/neu)タンパク質TPTAENPEYLGLDVPV-COOHのC末端16アミノ酸をコードする直鎖状ペプチドである抗原の例を使用します( 材料表を参照)。この配列は、ハーセプトストポリクローナル試薬(ENPEYLGLDVP)およびモノクローナル抗体CB11(AENPEYL)および4B5(TAENPEYLGL)を含む3つの市販の診断関連抗体によって認識されるエピトープを含む( 材料表を参照のこと)¹⁶。

ここで実証された方法は、組織学研究室で実践されているあらゆる組織学検査室に馴染みのあるプロセスおよび技術を使用して、容易に入手可能な試薬を使用する。最も重要な制限は、標的抗原を同定して購入する必要性であり、多くの場合、比較的控えめなコストで達成することができる。これらの合成コントロールは完全に定義された組成であり、簡単な方法で作られているため、再現可能な結果で多くのラボで実装できます。それらの使用は、IHC染色結果の客観的で定量化可能な評価を容易にし、実験室内および実験室間の再現性を高めることができる。

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プロトコル

1. 原液・工具の調製

1. 50 mL の円錐形チューブ中で 5 g の BSA 粉末を 14 mL の PBS、pH 7.2 に混合して、20 mL の 25% w/v BSA 溶液を調製し、均一に分散します。必要に応じてボルテックスはBSA粉末を分散させる。
   1. 溶液を4°Cで一晩保ち、完全に溶解させる。PBSで最終容量を20 mLに調整し、25%w/vの原液を作ります。
2. 6.26 g BSA 粉末を 13 mL の PBS、pH 7.2 に 50 mL の円錐管に入れて均一に分散するまで混合して、20 mL の 31.3% w/v BSA 溶液を調製します。溶液を4°Cで一晩保ち、完全に溶解させる。PBSで最終容量を20 mLに調整し、31.3% w/v のストック溶液を作ります。
3. ヒートブロックを85°Cに予熱します。
   注:以下のプロトコルは、1.5mLの微量遠心チューブで形成された容量1.26〜1.4mLのペプチド/BSAゲルを作成します。より小さな容量を使用するには、例えば、抗原ストックが制限されている場合、PCRチューブでゲルを調製し、ヒートブロックとして85°Cに設定したサーモサイクラーを使用する。
4. BSA/ホルムアルデヒド混合物が、700 μL の 25% BSA 溶液と 700 μL の 37% ホルムアルデヒドを混合することによって、期待どおりにゲルを形成することをテストします。5〜10秒以内に5回上下にピペッティングしてよく混ぜる。気泡を作らないでください。
   注意:濃縮ホルムアルデヒドは有毒です。適切な安全上の注意を払って使用してください。
5. BSA溶液とホルムアルデヒド溶液を混合した直後に、密閉型微量遠心管をヒートブロックに入れ、85°Cで10分間置いた。ヒートブロックからチューブを取り外し、冷却します。ゲルが期待どおりに形成されていることを確認します。

2. ペプチドの調製と希釈

1. 所望の配列の凍結乾燥ペプチドを5〜20mg得る。
   注:4B5によって認識されるヒトERBB2細胞内ドメインのC末端16アミノ酸はTPTAENPEYLGLDVPV-COOHである。
   1. N末端に4つのアミノ酸、アセチル-YGSG、およびC末端GSGC-アミドを加えて、ペプチドのBSAへの架橋を容易にし、BSA分子とペプチドエピトープとの間に間隔をあける。
      注:完全な配列は、アセチル-YGSGTPTAENPEYLGLDVPVGSGC-アミドである。
   2. 所望により、他のN末端およびC末端アミノ酸配列を使用して、コアペプチドエピトープを延長する。
      注:異なる配列の影響は、抗体/エピトープの組み合わせによって異なります。C末端ペプチドの添加は、C末端エピトープに対するいくつかの抗体の結合を減少させる。このような場合は、このシーケンスを省略します。
   3. 市販の供給源からのペプチドが>95%の純度で供給されていることを確認し、その組成はHPLCおよび質量分析分析によって確認される。
2. 5x(1.25 E-2 M)ペプチドストック溶液の必要体積を計算します。 表 1 の列 C-E を参照して、抗原分子量 (g/mole)、抗原純度パーセント (0 ~ 100)、および抗原量 (mg) の値を入力します。
   注:1.25 E-2 Mの原液を達成するためにサンプルを再懸濁するための溶媒の容量(μL単位)は、800 x 抗原分子量 x 抗原純度/抗原質量パーセントです。
   1. 8本の1.5 mL微量遠心チューブを準備し、明確にラベル付けします。
      注:チューブには、溶媒中の5倍のペプチドストック、溶媒中の1倍のペプチドストック、2.5 E-4 Mから2.5 E-8 Mのペプチド/BSA/ホルムアルデヒドゲルの5つの10倍連続希釈物、および抗原を添加しないBSA/ホルムアルデヒドを含むネガティブコントロールゲルが含まれます。すべてのゲルサンプルは同じように見えます。一度に複数のペプチド希釈液セットを調製する場合は、すべてのチューブと処理カセットを正しく標識して識別するように注意してください。色分けされた微量遠心チューブと処理カセットを可能な限り使用して、誤認を最小限に抑えます。
3. 凍結乾燥ペプチドの全質量(ERBB2ペプチドの場合は20 mg)を60 μLの適切な溶媒に再懸濁することにより、1.25 E-2 Mで5xペプチドストック溶液を調製する。
   メモ: この例では、ジメチルホルムアミド(DMF)をベンダーの容器に直接添加しました。
   1. 溶液を検査して、ペプチドが完全に溶解していることを確認します。必要に応じて、追加の溶媒を加え、および/またはペプチドが完全に溶解するまでサンプルを超音波処理し、5倍ペプチドストックについて 表1 で計算された体積を超えないように注意する。
      注意: DMFは有毒です;適切な注意を払って使用してください。
      注:アミノ酸配列、および対応する疎水性および電荷に応じて、ペプチドはDMF、ジメチルスルホキシド(DMSO)、純水、または酢酸、ギ酸、または炭酸水素アンモニウムの希薄溶液に可溶であり得る。ペプチド特性は、様々なオンラインツール¹⁷を用いて計算され得る。一部のペプチドベンダーは、特定の配列に適した溶媒を提案することがあります。
   2. 必要に応じて溶媒を加え、5xペプチドストックの体積を 表1で計算された最終体積に近づける。5秒間の渦と5000 x g の室温で5秒間の遠心分離機。ペプチドストック溶液は、-80°Cで保存することができる。
4. 表2、列Cを参照して、30 μLの5xペプチドストックを120 μLの溶媒(この例ではDMF)に希釈することによって、1xペプチドストック溶液(2.5E-3 M)の150 μLを調製する。5秒間の渦と5000 x gの室温で5秒間の遠心分離機。
5. 表 2、列 D を参照し、1x ペプチドストック 140 μL を 560 μL の 31.3% BSA/PBS、pH 7.2 に希釈することにより、700 μL の 5 E-4 M ペプチド/BSA 溶液 (希釈 1) を調製します。5秒間の渦と5000 x gの室温で5秒間の遠心分離機。
   注:この溶液の最終BSA濃度は25%(w / v)です。
6. 表 2, カラム E-H を参照して、25% BSA/PBS、pH 7.2 の 630 μL に 70 μL のペプチド/BSA 溶液を加えて、5 E-4 M ペプチド/BSA ストックの 4 つの連続した 10x 段階希釈液を調製します。5秒間の渦と5000 x gの室温で5秒間の遠心分離機。
   注:このステップの後、25%BSA/PBS、pH 7.2で5つの10倍段階希釈(5 E-4 Mから5 E-8 M)のペプチドが5回あります。最初の4つのサンプルは630μLを含む。最後のサンプルには700 μLが含まれます。
7. 表2、列Iを参照して、pH7.2の25%BSA/PBS、700μLを含む陰性対照BSAサンプルを調製する(図1A)。

3. BSAペプチドゲルの調製

1. ヒートブロックまたはサーモサイクラーが85°Cで安定していることを確認します。
2. 表 3, 列 B-E を参照してください。一度に1つのサンプルを作業し、最初の25%BSA/ペプチドサンプル(希釈1)630μLに37%ホルムアルデヒドを加えます。5〜10秒以内に5回上下にピペッティングしてよく混ぜる。気泡を作らないでください。
   注意:濃縮ホルムアルデヒドは有毒です。適切な安全上の注意を払って使用してください。
   1. ペプチド/BSA溶液とホルムアルデヒド溶液を混合した後、密閉型微量遠心管を85°Cのヒートブロックに入れ、10分間置きます。
      注:BSAペプチド溶液とホルムアルデヒドを十分に混合しますが、サンプルを熱にかける前に混合物をピペッティングに10秒以上費やさないでください。ホルムアルデヒド架橋はすぐに始まるので、手順を異なるサンプルに対して変化させると、ゲルは異なる形で形成され得る。これらのゲル中の最終BSA濃度は12.5%(w / v)です。最終BSA濃度が10%未満の場合、固化しないゲルを生じることがあります。最終BSA濃度が16%を超えると、ゲルがより脆く、処理後に切断しにくい場合があります。
   2. 希釈液2~4のそれぞれについて、ステップ3.2および3.2.1を繰り返します。
   3. 希釈5についてステップ3.2および3.2.1を繰り返すが、700μLの37%ホルムアルデヒドを、BSA抗原溶液の700μLに等しい容量で加える。
   4. 表 3 列の列 G を参照してください。陰性対照試料についてステップ3.2および3.2.1を繰り返し、700μLの37%ホルムアルデヒドを、700μLの陰性対照BSA溶液に等しい容量で加える。
3. 10〜12分後にヒートブロックからチューブを取り外します。加熱時間は、各サンプルについてできるだけ一致させる必要があります。ゲルをベンチトップで5~10分間冷やします(図1B)。
4. 清潔で柔軟な使い捨て実験室用ヘラを用いて、微量遠心管からゲルサンプルを1枚に取り出し、少なくとも15mLの中性緩衝ホルマリン(NBF)を含む密閉容器に入れ、サンプルごとにNBFの別々の容器を使用する。
   1. あるいは、微量遠心管の底部を新しい片刃のカミソリ刃で切り取り、空気または適切なプローブでゲルを下から押し出します(図1C-G)。
      注:固化したホルムアルデヒド/BSAゲルは、室温で最大24時間、微量遠心チューブに留まることができます。ゲルを微量遠心管に24時間以上放置すると、脆くなり、加工や切断が難しくなる可能性があります。

4. BSAゲルのトリミング、加工、埋め込み

1. 清潔なシングルエッジカミソリを使用して、ゲルコーンを厚さ約5mmの円筒形のディスクにトリミングします(図1H、I)。ディスクを生検ラップで包み、1つの大きなゲルディスクを1つのカセット(ステップ5のパイロット研究で使用する)に入れ、残りのゲルディスクを2番目のカセット(図2A、E)にまとめて、ステップ6の組織マイクロアレイ(TMA)構築に使用する。包んだゲルディスクを、明確にラベル付けされた組織加工カセットに入れます。
   1. 処理前にゲルサンプルあたり少なくとも15mLの10%NBFのカセットゲルを置き、各サンプルに対してNBFの別々の容器を使用する。ゲルは6〜48時間10%NBFに留まることができます。
2. ゲルを自動組織学組織プロセッサで処理し、圧力と真空を伴う大規模な組織スケジュールに従います。各工程は1時間かかる:10%NBF、70%エタノール、95%エタノール(2回繰り返し)、100%エタノール(2回繰り返し)、キシレン(3回繰り返し)、パラフィンを60°Cで(3回繰り返す)。
   注:サンプルを手動で処理することを選択する治験責任医師は、同じ試薬の順序と時間に従ってください。
3. サンプル処理が完了したら、組織プロセッサからカセットを取り出し、パラフィン包埋センターに移動します。
4. 生検ラップからゲルを包み込み、パラフィンにゲルを埋め込む。各サンプルについて、ゲルの1枚のディスクを15 mm x 15 mmの小さな型に埋め込み(図2B-D)、残りのゲルディスクを2番目の大きな型にまとめます(図2F-H)。1つのサンプルを含む最初のブロックは、パイロット研究でペプチドゲルをテストするために使用されます。2番目のブロックは、TMA構築に使用することができる。

5. ペプチド希釈系列のパイロット評価

1. ペプチド希釈系列ごとに、合計 6 つの別々のセクション (5 つの希釈系列サンプルのそれぞれから 1 つのセクションと、BSA のみの陰性対照サンプルから 1 つのセクション) を含む 2 つのスライドガラスを作成する計画を立てます。
   1. 最初のスライドガラス上に、3つの最も高いペプチド濃度(2.5 E-4 M〜2.5 E-6 M)の1つのゲルディスクを含む小さなブロックのそれぞれから厚さ4 μmのセクションを1つ切り取ります。
   2. 2 番目のスライド上に、2 つの最低ペプチド濃度 (2.5 E-7 M および 2.5 E-8 M) を持つ各ブロックから厚さ 4 μm のセクションを 1 つ、BSA のみのコントロールブロックから 1 つのセクションを切り取ります。スライド上のサンプルの順序を記録します。
      注:パラフィン包埋ゲルは滑らかに切断され、断片化、引き裂き、またはチャタリングアーチファクトなしで均一なセクションを生成することを期待してください。特定のパラフィン包埋ゲルサンプルを切片化することが困難な場合は、切片化する前にブロック面を氷冷蒸留水に短時間浸してください。必要に応じて、異なる浸漬時間または異なる溶液(例えば、アンモニア水)で実験する。
   3. 切片化後、スライドを室温(約23°C)で24時間乾燥させ、続いて60°Cで30分間乾燥させる。
2. 各ペプチドについて調製した2つのスライドを、標準的なIHCプロトコルに従って所望の抗体で染色する。
   注:この実証でウサギモノクローナル4B5に使用した一次抗体のスライド上の濃度は1.5 ug/mLでした。
   1. 各ゲルセクション内で比較的均一なシグナルが見られ、異なるゲルサンプルはペプチド希釈物に対応するシグナル強度の範囲を示すことを期待してください。
3. パイロット研究の結果が満足のいくものである場合、プロトコールの次のステップで説明するように、異なる濃度のペプチド抗原を含むゲルドナーブロックからTMAを構築する。

6. BSAゲルTMA構造

1. ERBB2ペプチドの5つの希釈物すべてを含むBSAゲルおよびBSAゲルのみを含むドナーブロックからの直径1mmの重複コアを含む組織マイクロアレイを構築する。
   注:必要に応じて、追加のネガティブコントロールとして、非標的ペプチドの同じ5つの希釈物を含むBSAゲルを含めます。所望により、陽性対照として代表的なERBB2発現細胞株のコアが挙げられる。
2. TMAの厚さ4μmの切片を切断し、実験室標準プロトコルに従って1.5ug/mLの抗ERBB2/HER2/neuウサギモノクローナル4B5( 材料表を参照)で染色します。
3. 得られた染色強度を検査により定性的に、またはデジタル画像スキャンおよび分析によって定量的に評価する(図3A、B)。
   メモ:デジタル画像解析はこのプロトコルの焦点ではないため、これらの手順は読者が自分の好みに応じて実行するために残されています。

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結果

ペプチドは、光学的に透明な溶液を形成するために、室温で適切な溶媒に完全に溶解すべきである。目に見える粒状物質が30〜60分後にまだ存在する場合、 表1で計算された5倍のペプチド原液の意図された体積を超えない元の溶媒または代替溶媒の追加体積を追加することが有用であり得る。同様に、ペプチド/BSAを組み合わせた溶液は半透明のままでなければなりません(

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ディスカッション

この方法により、ユーザーは、ほとんどの組織学研究所で使い慣れた材料と技術を使用して、IHC反応の標準として既知の組成と抗原濃度の均一なサンプルを作成できます。最も重要なステップは、目的の抗体が結合するエピトープを特定することです。このプロトコルは、ERBB2/HER2 ICDからの線状ペプチド抗原の使用を記載している。同じプロトコールを使用して、オリゴヌクレオチド、蛍光?...

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資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anti-HER2/neu clone 4B5	Ventana	5278368001
Biopsy Wraps	Leica	3801090
Bovine Serum Albumin, ultra pure	Cell Signaling Technology	BSA #9998
50 mL Conical Tube	Corning	352070
Disposable base mold (15 mm x 15 mm)	Fisher	22-363-553
Disposable base mold (24 mm x 24 mm)	Fisher	22-363-554
Disposable spatula	VWR	80081-188
Eppendorf Thermomixer	Eppendorf	22331
37% Formaldehyde	Electron Microscopy Sciences	15686
ERBB2 / HER2 peptide			UniProt P04626-1; a.a. 1240-55
Leica Autostainer XL	Leica	ST5010
Magnetic Stir Bar
NanoZoomer 2.0 HT whole slide imager	Hamamatsu
10% Neutral Buffered Formalin	VWR	16004-128
Nuclease-free microfuge tubes 1.5 mL
Paraplast paraffin	Leica	39601006
Peptide parameter calculator	Pep-Calc17	https://www.pep-calc.com/
Peptide suppliers	ABclonal Science		Users should contact peptide vendors for details of mass, purity and cost.
	Anaspec Peptide		Users should contact peptide vendors for details of mass, purity and cost.
	CPC Scientific		Users should contact peptide vendors for details of mass, purity and cost.
	New England Peptide		Users should contact peptide vendors for details of mass, purity and cost.
Phosphate Buffered Saline pH 7.2
Reagent Alcohol	Thermo Scientific	9111
Single Edge Razor	VWR	55411-050
Superfrost Plus positively charged microscope slides	Thermo Scientific	6776214
TMA Tissue Grand Master	3DHISTECH
Xylenes	VWR	89370-088