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要約

細胞外小胞(EV)は細胞生物学と細胞間コミュニケーションに貢献します。細胞の取り込みEVを可視化・定量化するための実用的なアッセイが必要です。現在のプロトコルは、ナノ濾過ベースのマイクロ流体デバイスによるEV単離に続く共焦点顕微鏡 による 3次元蛍光イメージングを利用してEV取り込みアッセイを提案している。

要約

細胞の細胞外小胞(EV)の取り込み量を可視化し、定量化するための実用的なアッセイが必要です。EV取り込みは、様々な研究分野における細胞間コミュニケーションの役割を果たしています。がん生物学、神経科学、および薬物送達。多くのEV取り込みアッセイが文献で報告されている。しかし、実用的で詳細な実験方法論が欠けている。EVの取り込み値は、蛍光標識EVにより、細胞内での位置を検出することで評価できます。細胞内の内在化したEVと細胞の表面的なEVを区別することは困難でありながら、EVの取り込み値を正確に決定することは極めて重要です。そこで、3次元(3D)蛍光共焦点顕微鏡を通じてEV取り込みを効率よく定量化するアッセイが提案されている。蛍光標識されたEVは、ナノ濾過ベースの微小流体装置を用いて作製し、3D共焦点顕微鏡で可視化し、高度な画像処理ソフトウェアを用いて解析した。このプロトコルは、細胞レベルでEVを分析するための堅牢な方法論と、効率的な分析のための実用的なアプローチを提供します。

概要

細胞外小胞(EV)は、ナノサイズの脂質膜結合粒子で、そのサイズによって分類されます: エクトソーム (100-500 nm) およびエキソソーム (50-150 nm)1.EVには、タンパク質、核酸、脂質など、さまざまな生体分子が含まれています。これらの生体分子は、貨物としてカプセル化される前に細胞から発生し、EV1,2,3を介して細胞外空間に放出されます。

その貨物の多様性により、EVは細胞間通信において積極的な役割を果たすと考えられています。細胞によるEVの放出および取り込みにより、細胞間の生体分子の移動が可能となる4,5.EV貨物をセルに導入すると、受信者細胞の機能やホメオスタティック状態が変われ得る4,5,6.EV は複数の経路を通じて内部化されます。しかし、正確なメカニズムは正確には実証されていません。

遺伝子タグ付けなどのEV取り込みアッセイの大部分は、個々のEV7に蛍光標識を付ける。得られた信号は、マイクロプレート光度計、フローサイトメトリー、または顕微鏡検査によって測定することができ、各技術は大きな制限を有する。マイクロプレートフォトメーター、フローサイトメトリー、または標準的な2次元(2D)顕微鏡では、内部化されたEVsと表面的に取り付けられたEVsを区別できません。さらに、これらの各技術に必要なサンプル調製は、EV取り込み評価に追加の問題を導入する可能性があります。例えば、EV取り込み分析の前にトリプシンで付着した細胞を持ち上げると、表面的に取り付けられたEVが細胞表面10,11に切断されることがあります。トリプシンはまた、細胞表面と相互作用し、細胞およびEV表現型に影響を与える。さらに、トリプシンは表面的なEVを完全に切り離すものではなく、孤立した集団を歪める可能性があります。

蛍光色素でEVに正確にラベルを付けるには、残留色素7を除去するために追加の洗浄工程が必要です。受け入れられた分離技術は、EVの分離中に起こる凝固による偽陽性シグナルにも寄与する可能性がある。例えば、シリアル超遠心分離(UC)は、EVを分離し、固定染め染料を除去するために広く使用されています。しかし、UCはEVを共沈殿させ、残存色素は偽陽性シグナル12,13を引き起こす可能性がある。カラムベースのろ過などの他のナノ濾過方法も、非固定化色素除去にも広く使用されています。カラムマトリックス内で相互作用するEVと色素の複雑な性質により、複雑な入力14,15,16によってカラムの分子カットオフが変化するため、残存染料が不完全に除去される可能性があります。

現在のプロトコルは、蛍光標識された単離されたEVを単離して洗浄するためのナノ濾過ベースのマイクロ流体装置を提案している。ナノ濾過ベースのマイクロ流体デバイスは、流体支援分離技術(FAST)17,18を介して効率的なろ過を提供することができます。FAST はフィルター全体の圧力降下を低減し、EV と色素の間の潜在的な凝集を減らします。残留色素を効率よく除去することで、蛍光標識されたEVの品質とアッセイの特異性を高めることができる。

共焦点顕微鏡は、細胞表面に内部化されたEVと表面的に結合したEVを区別し、時空間的な解像度におけるEV取り込みの細胞機構を包括的に調べることができます19,21,22,23,24,25。例えば、Sungらは、開発された生細胞レポーターを用いてエキソソームライフサイクルの可視化を説明した。3次元(3D)およびポスト画像処理ツール20の共焦点顕微鏡を用いて、内部化されたEVの位置を検出し、解析した。小さなEV(40〜200nm)のサイズは光学顕微鏡の解像度限界を下回っていますが、光検出器は蛍光放射の増強を検出できるため、蛍光標識されたEVは共焦点顕微鏡で検出できます。したがって、細胞内の蛍光標識されたEVの細胞内局在化は、EVおよび周囲の細胞小器官の複数のZ積層画像を取得することによって正確に決定することができる。

さらに、3D再構成とポストデータ処理により、内部化、表面化、自由浮遊型のEVの位置に関するさらなる洞察を得ることができます。これらのプロセスを共焦点顕微鏡で提供するタイムラプスライブセルイメージングと組み合わせることで、EV取り込みのレベルを正確に評価でき、リアルタイムでのEV取り込みの追跡も可能です。また、EVの入稿解析は、細胞内機能に対するインターナライズされたEVの共同局在化を評価することによって、共焦点顕微鏡を用いて行うことができる。本プロトコルは、ナノ濾過ベースのマイクロ流体デバイス17,26、共焦点顕微鏡法、およびポスト画像解析を用いてEV取込アッセイを行う方法論を記述する。

プロトコル

1. EV単離およびオンチップ免疫蛍光EV標識

  1. EV分離のための細胞培養培地(CCM)の収集とCCM前処理
    1. 75 cm2 の細胞培養フラスコで30%の合流度でPC3細胞をシードする。標準培地および細胞系特異的サプリメントで、コントロール細胞が90%の合流度(〜48時間)まで増殖することを可能にする。
      注:EV含有成分が細胞の取り込み(すなわち、牛血清)に影響を与えないようにするために、エキソソーム枯渇した培地およびサプリメントを使用してください。
    2. CCMを収穫する。
    3. CCMを1000 x g で室温(RT)で10分間遠心し、メディアと一緒に収穫した未接続の細胞や大きな破片をペレットにします。上清を新しい円錐形の管に移す。
    4. 新しいチューブでは、上清を4°Cで20分間10,000xgで遠心分離し、培地に残っている小さな破片やアポトーシス体をペレット化する。いくつかの大きなEVはペレットになります。上清を新しいチューブに移します。
    5. フッ化ポリビニリデン(PVDF)膜シリンジフィルターを通して上清をろ過します。
      メモ:EV分離のためにCCMを直ちに処理しない場合は、分離が実行されるまで、前処理されたCCMを-80°Cに保存してください。凍結した場合は、フリーズ解凍サイクルを 1 つに制限します。
  2. ナノ濾過ベースのマイクロ流体装置を用いたCCMからのEV分離
    1. 凍結した場合は、ステップ1.2.2の前に30 sのCCMと渦を完全に解凍します。
    2. ナノ濾過ベースのマイクロ流体デバイスのサンプルチャンバーに、前処理CCM(ステップ1.1)の1mLを注入します(材料表を参照)。
      メモ:ナノ濾過ベースのマイクロ流体デバイス17,26の標準的な操作手順に従ってください。
    3. ベンチトップ回転機( 材料表を参照)で10分間3000 rpmで回転し、マイクロ流体デバイスを操作します。
      注:CCMが最初の実行の後にサンプルチャンバに残っている場合は、すべてのCCMがサンプルチャンバから空になるまで追加のスピンを実行します。
    4. ピペット処理により、廃液を除去し、ステップ1.2.1、1.2.2、および1.2.3を2回繰り返します。
      注: 合計で、3 mL の CCM が EV 分離のために処理されます。
    5. 1 mL リン酸緩衝生理食塩分 (PBS) をサンプルチャンバーに注入し、分離した EV を洗浄します。ステップ1.2.3で述べたようにマイクロ流体装置を作動させるベンチトップ回転機で回転する。デバイスの膜上に純粋なEVを見つけます。
      注:ナノ濾過系マイクロ流体デバイスから分離されたEVの品質は、特に、透過電子顕微鏡(TEM)、走査型電子顕微鏡(SEM)、ナノ粒子追跡解析(NTA)、構造化照明顕微鏡、酵素結合免疫吸着測定法およびリアルタイムPCRによる従来のUC法と比較して確認された。
  3. ナノ濾過系マイクロ流体装置を用いたEVの免疫蛍光標識(図1)
    1. アッセイの目的に従ってEV特異的抗体を選択します( 材料表参照)。
      注:特定の抗体は、EV取り込み経路(すなわち、エンドサイトトーシス)に特異的なリガンド結合部位を妨害する可能性があります。
    2. 100 μL の分離された EV を含むデバイスの溶出穴に EV 特異的抗体の 1 μg/mL を注入します。
    3. プレートシェーカー上のRTで暗闇の中で1時間インキュベートし、サンプル全体で抗体の均等な分布を確保します。
    4. 溶出穴に粘着テープを貼り付けます。1 mL PBS をサンプルチャンバーに注入し、任意の残留抗体を洗い流します。
    5. サンプルチャンバーが空になるまで3000 rpmでデバイスを回転させます。ピペット処理により、廃液室から任意の流体を除去します。サンプルチャンバーに1 mL PBSを注入します。
      注:蛍光標識されたEVは膜チャンバーに配置されます。
    6. 膜チャンバーからアンバーチューブに蛍光標識されたEV(図2)をピペット。使用するまで光からブロックします。

2. 蛍光標識されたEVを用いた細胞のインキュベーションによるEV取込アッセイ

  1. 細胞培養と相性の良い料理に対する標的細胞播種および培養。
    1. 1 x 104 PC3細胞をマイクロスライド8ウェルプレート(各ウェルに対して9.4 x 10.7 mm)に、0.2 mLのメディアまたは4 x 104 PC3細胞を1mLの35mm皿に入れます。薄いカバースリップ(厚さ:0.18 mm)から成る細胞培養対応皿に細胞を入れます。
      注:薄いカバースリップはライトの不利な散乱を最小にする。
    2. 最適な細胞培養条件(37°C、5%CO2 濃度、湿度90%)で細胞が一晩接着することを可能にします。
    3. 付着した細胞をエキソソーム枯渇培地で2回洗浄する(ステップ1.1.1で説明)。
  2. 蛍光標識されたEVによる細胞インキュベーション。
    1. ナノ粒子追跡解析(NTA、 補足図1)により蛍光標識されたEVの濃度(ステップ1.3.5)を測定します。培養細胞に添加する蛍光標識EVの最適濃度を決定する(ステップ2.1.2)。
    2. 蛍光標識されたEVを外反劣化媒体で希釈し、ステップ2.2.1で測定した所望の濃度に合致させます。(すなわち、エキソソーム枯渇したメディアの200 μLの7.80 x 109 EV(NTA値)
    3. 希釈したEV(ステップ2.2.2)を2.1.2で調製した接着対象細胞に追加します。実験時間(すなわち、4、8、または12時間)にインキュベートする。
    4. エキソソームフリーの培地で細胞を3回洗浄し、非内部化されたEVを除去します。
      注:オプション:セルは、洗浄後に固定することができます。
    5. 付着した細胞の細胞質にCMTMR((5-(および-6)-((4-クロロメチル)ベンゾイル(アミノ)テトラメチルロダミン)( 材料表を参照)を付け、最適な培養条件(37°C、5%CO2 濃度、湿度90%)でインキュベートする。
      注: 細胞領域色素は、EV 取り込みアッセイ中にスパイクされたEVの空間的位置(内部化または表面的)を決定するために、標識されたEVとは別に蛍光を発する必要があります。
    6. 標識された細胞をエキソソーム枯渇した培地で2回洗浄し、残留染料を除去する。生細胞共焦点イメージングの準備として、新鮮なエキソソーム枯渇した培地を細胞に加えます。

3. 共焦点顕微鏡

  1. 生細胞イメージングを行うために、ステージ上のインキュベーターを利用して、最適な細胞培養条件(37°C、5%CO2 濃度、湿度90%)を維持します。
  2. 準備した細胞をステージ上のインキュベーターに入れる。
  3. コントロール サンプルに基づいてイメージング パラメータを設定します。
    注意:推奨されるコントロールサンプルには、蛍光標識されたEVのみ、蛍光標識された細胞、ラベルなしのEV、およびラベルなしセルが含まれます。
  4. ターゲットセルの深さと、3D共焦点画像を取得するためのz方向の積み重ねサイズの範囲を決定します。
    メモ:Zスタックの厚さは1μmです。共焦点3D画像取得は2分34s(各Zプレーン画像取得は約8 s、合計20 Zスタック画像)
  5. 画像取得を、細胞特異的な色素(すなわち、赤)とEV特異的な色素(すなわち緑色)の両方の複数のZ積層画像に同時に設定する(図3 および 図4A)。

4. 画像処理

  1. 自動画像処理ソフトウェアを使用して、生のzスタック共焦点画像を解析し、細胞によるEV取り込み量を決定します( 材料表を参照)。
  2. 閾値パラメータを細胞の蛍光シグナルとEV特異的染料に設定します。セルの仮想サーフェスを作成します(図 4A、B)。
    1. セルの仮想サーフェスを作成するには、[ 新しいサーフェスを追加]ボタンをクリックします。
    2. ソフトウェアが提供するアルゴリズムを使用するには、「アルゴリズム設定」として 「最短距離計算 」を選択し、「 次へ:ソースチャンネル」をクリックします。
    3. この実験では 、チャンネル 2 - CMTMR を 「ソースチャネル」として選択します。
    4. スムーズを選択し、サーフェススムージングのために「サーフェスの詳細」に適切な値を配置します。
      注:1ピクセル以来のこの実験では0.57 μmは、生撮像データで0.57 μmを表します。
    5. 絶対強度を「しきい値」として選択します。
    6. 提供されたアルゴリズムによって蛍光画像を自動的にしきい値にするには、[しきい値(絶対強度)]をクリックします。
    7. 「分割接触オブジェクト(領域拡大)」として 有効に するを選択し、この実験では、推定セルサイズの値を「シードポイント直径」10.0 μmにします。次 に、[次へ: シード ポイントをフィルター] をクリックします。
    8. 仮想セルのサーフェスを構成するには、[ + 追加 ] ボタンをクリックし、[ 品質 ] を [フィルターの種類] として選択します。目視検査による下限の適切な値(この実験では210)をしきい値し、上限値の最大値(1485)をしきい値にし、[ 完了 ]ボタンをクリックします。
      注:目視検査とは、研究者が細胞領域を生の蛍光画像から区別できることを意味します。
    9. 次に、EV の仮想ドットを作成するには、[ 新しいスポットを追加] ボタンをクリックします。
    10. [異なるスポット サイズ(領域拡大)]と[最短距離計算]を[アルゴリズム設定]として選択し、[次へ:送信元チャンネル]をクリックします。
    11. この実験で 「ソースチャンネル」としてチャンネル1 - Alexa Fluor 488 を選択します。
    12. スポット検出用の「推定XY直径」に適切な値を入れて、この実験では 1μm を使用します。次に、[ 次へ: スポットをフィルタ] をクリックします。
    13. 仮想 EV ドットを構成するには、[ + 追加 ] ボタンをクリックし、[ 品質 ] を [フィルターの種類] として選択 し、この 実験では、目視検査で 「下限しきい値」を設定します。次に、[ 次へ: スポット領域の種類] ボタンを クリックします。
    14. 「スポット領域タイプ」として 「絶対強度 」を選択し、「 次へ: スポットリージョン」をクリックします。
    15. 閾値に、EVドットの領域を、目視検査によって「領域閾値」に適切な値を入れ、この実験では「領域しきい値」として 100 を「領域閾値」とする。
      注:目視検査とは、研究者が生の蛍光画像からEV領域を識別できることを意味します。
    16. 「直径」として 「領域容積 」を選択し、「 終了」をクリックします。
  3. ソフトウェア提供のアルゴリズムを使用して、ステップ 4.2 で構築されたサーフェス内のグループ化されたスポットを分割します (図 4C、i-iv)。
    1. 構築された スポットをクリックし、フィルターに移動 します。
    2. [ + 追加 ]ボタンをクリックし、[ サーフェスサーフェスまでの最短距離]=[サーフェス 1] を フィルタ タイプとして選択し、[ 新しいスポットに選択範囲を複製 ]ボタンをクリックします。下限の最小しきい値 (-7.0) と上限の適切な値 (-0.5)。
      注: スポットの推定半径で上限を設定 します。この実験では、 スポットの推定直径、すなわち、EVドットは、ステップ4.2.11で 1μm に設定されました。したがって、上限は 0.5 になります。
  4. セル内の EV の自動カウント
    注: ソフトウェアは自動的にセル内の EV の数をカウントし、ターゲット セルによって内部化された数を示します。
    1. [作成した スポット 1]選択[サーフェスサーフェスまでの最短距離= サーフェス 1 -7.00 ~ -0.500]をクリックします。
    2. 統計に移動し、「 スポットの合計数」から値をエクスポートします。
      注:ソフトウェアが提供するアルゴリズムは、自動的にセルの数と量を計算します。
  5. 上記の計算値に基づいて、インキュベーション期間ごとのEV取り込みの歩留まりを決定します(図5)。
    1. セル数を取得するには、構築した サーフェス 1 をクリックし、[ 統計情報] に移動して、[全体] から [サーフェスの総数] の値をエクスポート します。
    2. 詳細からボリュームをエクスポートするには、詳細から統計に移動します。

結果

ナノ濾過ベースのマイクロ流体デバイスを使用して、EVをPC3 CCMから単離し、フルオロフォア共役EV特異的(CD63)抗体で標識した(図1)。ラベル付きのEVは、3D共焦点顕微鏡で正常に視覚化されました(図2)。標識されたEVは、エキソソーム枯渇培地において数時間細胞をインキュベートした。インキュベーション後、細胞をエキソソーム枯渇培地で洗浄し?...

ディスカッション

共焦点顕微鏡による3D蛍光イメージングに基づくEV取込みアッセイは、効率的な方法論と高感度分析を提供します。この蛍光EV標識は、EVの可視化を促進し、正確なEV取り込みアッセイを成功に導きます。EVの標識と残留色素除去のための以前の方法は、超遠心(UC)を使用して沈殿を除去することによって報告されています。しかし、UCはEVを共沈殿させ、固定化された色素は偽陽性シグナ?...

開示事項

Y.-K. Choは、ラボスピナー(韓国、蔚山)にライセンスされているナノ濾過ベースのマイクロ流体デバイス、Exodiscに関する特許の発明者です。他のすべての著者は何も開示する必要はありません。

謝辞

この作業はNCI認可のnosによって支えられた。U54CA143803、CA163124、CA093900、およびCA143055からK.J.P.本研究は、韓国保健福祉省(助成番号:HI19C1122)が出資する韓国保健産業開発研究所(KHIDI)を通じた韓国保健技術研究開発プロジェクトの助成金によって支援されました。J.キムとY.-Kによる仕事。韓国政府が出資する基礎科学研究所(IBS-R020-D1)の支援を受けた。著者らは、ブレイディ泌尿器科学研究所の現在および過去のメンバー、特にピエンタ・アメンド研究所のメンバーが原稿の批判的な読書に感謝する。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
Alexa Fluor 488 anti-human CD63 AntibodyBiolegend353038Fluorescent dye conjugated EV-specific antibody
CellTracker Orange CMTMR DyeThermo Fisher ScientificC2927Live cell (cytoplasm) fluoresent labeling reagent
CFI Apo Lambda S 40XC WINikonMRD77400Objective for confocal imaging, NA=1.25
CFI Plan Apo VC 20XNikonMRD70200Objective for confocal imaging, NA=0.75
ExodiscLabspinner Inc.EX-D1001A nano-filtration based microfluidic device for EV isolation
ExoDiscoveryLabspinner Inc.EX-R1001Operation device for Exodisc
Exosome-depleted FBSThermo Fisher ScientificA2720801Nutrient of cell culture media for PC3 cell line derived EV collection
Fetal bovine serum (FBS)VWR1500-500Nutrient for cell cultivation
Goat Anti-Mouse IgG H&L preadsorbedabcam ab7063Mouse IgG antibody for negatvie control of EV labeling
Ibidi USA U DISH μ-Dish 35 mmIbidi81156Culture dish for confocal imaging
Imaris 9.7.1Oxford Instruments9.7.1Post-image processing software
Incubator System+ CO2/O2/N2 gas mixerLive Cell InstrumentTU-O-20Incubator system for live cell imaging
Nikon A1 HD25 / A1R HD25 cameraNikonNACamera for confocal imaging
Nikon Eclipse Ti microscopeNikonNAInverted microscope for confocal imaging
NIS-Elements AR 4.50.00Nikon4.50.00Image processing software for Nikon microscope
NTA, NanoSight NS500Malvern PanalyticalNS500Measurement device for EV concentration
OriginPro 2020OriginLab9.7.0.185Graphing software
Penicillin-StreptomycinThermo Fisher Scientific15140122Antibiotics for cell cultivation
RPMI 1640Thermo Fisher Scientific21875034Cell culture media for PC3 cell line cultivation
SYTO RNASelect Green Fluorescent cell Stain - 5 mM Solution in DMSOThermo Fisher ScientificS32703RNA staining fluorescent dye for the EV labeling

参考文献

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