げっ歯類におけるヘテロトピック心臓弁移植のための簡略モデル

要約

このプロトコルは、心臓弁のアロア活性の研究を可能にするために、腎嚢の下に大動脈弁小葉を移植するための簡単で効率的な方法を記載している。

要約

小児で成長することができる心臓弁置換術のための緊急の臨床的必要性があります。心臓弁移植は、抗凝固を必要とせずに体細胞成長が可能な耐久性のある心臓弁を提供する可能性を秘めた新しいタイプの移植として提案されている。しかし、心臓弁移植の免疫生物学は未踏のままであり、この新しいタイプの移植を研究するための動物モデルの必要性を強調している。腹部大動脈への異所性大動脈弁移植のための以前のラットモデルが記載されているが、技術的に困難で費用がかかる。この課題に対処するために、心臓弁移植免疫生物学を研究するための実用的でより直接的な方法として、げっ歯類における腎嚢下移植モデルが開発された。このモデルでは、単一の大動脈弁小葉が収穫され、腎嚢下腔に挿入される。腎臓は容易にアクセスでき、移植された組織は、血管新生され、様々な組織サイズを収容することができる嚢下空間に確実に収容される。さらに、1匹のラットが3つのドナー大動脈小葉を提供することができ、1つの腎臓が移植組織に複数の部位を提供できるため、所与の研究に必要なラットは少なくて済みます。ここで、移植技術が記載されており、心臓弁移植の移植免疫学の研究において重要な一歩を踏み出した。

概要

先天性心不全は、ヒトにおいて最も一般的な先天性障害であり、毎年1,000人の生児のうち7人が罹患しています¹。様々な機械的および生体補綴弁が日常的に移植される成人患者とは異なり、小児患者は現在、弁置換のための良い選択肢がない。これらの従来のインプラントは、レシピエント小児において成長する可能性を有さない。その結果、心臓弁インプラントを子供が成長するにつれて連続して大きなバージョンと交換するために病的な再手術が必要であり、罹患した子供はしばしば生涯に最大5回以上の開心手術を必要とする^2,3。研究によると、介入や死亡からの自由度は、年長の子供よりも乳児にとって著しく貧弱であり、人工心臓弁を有する乳児の60%が最初の手術から3年以内に再手術または死亡に直面している^{ことが示されています4}。したがって、小児患者において機能を成長させ維持することができる心臓弁を送達することが緊急に必要とされている。

何十年もの間、成長する心臓弁置換術を提供する試みは、組織工学と幹細胞に集中してきました。しかしながら、これらの弁を診療所に翻訳する試みは、これまでのところ失敗している⁵、^6、7、8。これに対処するために、心臓弁移植は、自己修復および血栓形成を回避する能力を有する成長する心臓弁置換術を提供するためのより創造的な操作として提案されている。心臓全体を移植する代わりに、心臓弁のみが移植され、従来の心臓移植またはロス肺サイン^9,10,11と同様に、レシピエント小児と共に^{成長する。}術後、レシピエントの子供は、弁の成長が不要になったときに移植された弁を成人サイズの機械的補綴物と交換できるようになるまで、免疫抑制を受ける。しかしながら、心臓弁移植移植片の移植生物学は未踏のままである。したがって、この新しいタイプの移植を研究するためには、動物モデルが必要である。

腹部大動脈への大動脈弁の異所性移植について、いくつかのラットモデルが以前に記載されている¹²、13、¹⁴、¹⁵、^16、17、18。しかし、これらのモデルは非常にトリッキーであり、多くの場合、訓練を受けた外科医が正常に手術する必要があります。さらに、彼らは高価で時間がかかります¹⁹。心臓弁移植の免疫生物学を研究するためのより単純な動物モデルを作成するために、新しいラットモデルが開発されました。単一の大動脈弁小葉を摘出し、腎嚢下腔に挿入する。腎臓は、循環免疫細胞へのアクセスで高度に血管新生されているため、移植拒絶反応の研究に特に適している^20,21。他の何人かは、膵臓、肝臓、腎臓、角膜などの他の同種移植片移植の移植生物学を研究するために腎嚢下モデルを利用しているが^、これはこの位置での心臓組織の移植の最初の記述である。ここで、移植技術が記載されており、心臓弁移植の移植免疫学の研究において重要な一歩を踏み出した。

プロトコル

この研究は、国立衛生研究所の実験動物のケアと使用に関するガイドに従って、動物研究委員会によって承認されました。

1. モデル動物(ラット)に関する情報

1. すべての外科的処置に最大20倍の倍率を有する手術用顕微鏡( 材料表を参照)を使用してください。
2. 実験の必要に応じて、同系株(ルイス・ルイスなど)または同種異系株(ルイス・ブラウン・ノルウェーなど)を移植に使用します。
3. 実験的な質問に適した5〜7週齢および体重100〜200gのラットを使用する。

2.毛皮の除去、皮膚の準備、麻酔

1. すべての操作を無菌条件下で実行します。
   注:このステップは、専用の外科的スペースで、滅菌条件下で行われます。
2. ラットを麻酔誘導室に入れ、酸素中の5%イソフルランで麻酔を誘導する。手順全体を通して酸素中の3.5%イソフルランで麻酔を維持します。
3. ドナー手術のために、毛皮バリカンを使用してラットの毛皮を臍から胸骨の切り込みまで取り外します。レシピエント手術のために、肋骨から骨盤までの後腋窩線の手術野にわたって毛をクリップする。次に、外科用消毒剤で皮膚を準備する。
4. 処置を開始する前に麻酔の外科的平面を得る。ラットのつま先を鉗子でしっかりと圧縮して、麻酔の十分な深さを確認してください。ラットが痛みに後退した場合は、必要に応じて麻酔薬を滴定します。
5. 呼吸数と麻酔の深さを臨床的に手順を通して監視します;イソフルランのレベルは、55〜65呼吸/分の呼吸数を維持するために必要に応じて調整される。

3. ドナーの運営

1. ステップ2で述べたようにラットを準備して麻酔をかけます。剣状突起から胸骨の切り欠きまで、解剖はさみを使用して皮膚を切開する。心臓への最適なアクセスが達成されるまで、胸骨の両側の肋骨を切断して胸骨摘出術を行う。
2. 左心房に100U / 100gの注射でラットをヘパリン化する。
3. 放血 によって ドナーを犠牲にする。
4. 胸腺を切除して、大きな血管の視覚化を改善します。次に、上行大動脈で心臓を無名動脈のレベルまで取り除きます。

4. 大動脈弁リーフレットの作成

1. ドナー心臓を、心臓切除術の直後に滅菌ペトリ皿に入れる。ドナー心臓を氷冷冷保存バッファーで解剖します( 材料表を参照)。
2. 鉗子およびVannasスプリングはさみを使用して、大動脈根のみが大動脈弁に近位にある1mmの心室袖口で残るまでドナー心臓を解剖する。
3. 左副鼻腔と非冠状動脈洞の間にバルサルバの洞を開くために縦方向に切断して大動脈弁を開き、3つの小葉すべてを視覚化します。
   注:カットはバルサルバの洞の全長でなければなりません。実際の寸法はラットのサイズに依存する。
4. 各大動脈弁リーフレットを個別に切除する。具体的には、鈍い鉗子を使用してリーフレットの端をつかみ、Vannasスプリングはさみを使用して、1つのコミスシュアから環状まで切り取り、次に次のコミスアシュアに向かって切り取ることによってリーフレットを切除します。
   注:弁膜内皮細胞の破壊を最小限に抑えるために、小葉の端だけをつかむように特に注意してください。
5. リーフレット切除後のサンプルを、レシピエントラットに移植する準備ができるまで氷冷保存バッファー溶液に保存します。冷蔵保管の4時間以内にすべての小葉を埋め込む。

5. 受取人の操作

1. ステップ2で述べたようにラットを準備して麻酔をかけます。手術を行うには、36-38°Cに維持された加熱パッドを使用してください。
2. ブプレノルフィン(0.03mg/kg)をすべてのレシピエントラットに手術前および術後6〜12時間ごとに投与し、痛みを緩和する。
3. ラットを右側方リカンベント位置に置き、左腎臓にアクセスします。
   注:左腎臓は、右腎臓に対して尾の位置が高いため、好ましい。
4. はさみを使用して、側面の皮膚を縦方向に1インチ以上切開します。
   注:切開部は、腎臓が処置中に腹腔内に後退するのを防ぐために十分な張力を提供するために、腎臓のサイズよりも小さく保たなければならない。
5. 同様に、下にある腹壁を切開する。
6. 腎臓を外部化する
   1. 親指と人差し指を使用して、湾曲した鉗子を使用して腹部と皮膚の切開部を通して腎臓の尾極を持ち上げながら、背側および腹側に軽い圧力をかけます。同様に腎臓の頭蓋端を外在化させる。
   2. あるいは、腎周囲脂肪を掴み、軽い張力で上に引っ張ることによって腎臓を外在化してもよい。
      注:腎臓や腎血管を直接つかまないように注意してください。
   3. 腎臓が外在化したら、温かい生理食塩水を腎臓に流して湿らせてください。
7. 水嚢下ポケットを作成します。
   1. 腎嚢が根底にある実質と明確に区別できるように、1組の鈍い鉗子を使用して腎嚢に軽く圧力をかける。同時に別の鈍い鉗子を使用して、カプセルを慎重につかみ、静かに上に引っ張ってカプセルに穴を開けます。
      注:カプセルの繊細な性質のために、この切開を確立するために最小限の力が必要である。
   2. 鈍い鉗子を使用して、大動脈弁リーフレットを収容するために〜2mmのスペースが作成されるまで切開部を延長し続ける。
   3. 1組の鉗子で切開部の端を持ち上げ、鈍いプローブを腎嚢の下に進めながら、弁小葉よりわずかに大きい浅い嚢下ポケットを発達させる。
8. 大動脈弁を嚢下ポケットに移植する。
   1. 冷蔵保管から大動脈小葉を取り出し、手術野に置きます。
   2. 縁の線維性カプセルを持ち上げながら、鈍い鉗子で大動脈小葉を嚢下ポケットに進める。
      メモ:組織が切開部から十分に離れていることを確認し、カプセルの下にしっかりと固定してください。根底にある実質の損傷または繊維状カプセルのさらなる裂け目を避けるために注意が必要である。
   3. 腎嚢の切開部は開いたままにしておくことができます。
9. 切開端に適用されるカウンタートラクションを使用して、腎臓を解剖学的位置に静かに押し戻します。
10. 実行中の滅菌外科用縫合糸で腹部切開部を閉じる。ステープルで皮膚を閉じます。
11. 術後ケア
    1. 手術後、ラットを食物と水にアクセスできる加熱パッド上の清潔なケージに入れます。
    2. 日常的な創傷治癒および痛みまたは苦痛の徴候を評価するために動物を毎日監視する。7〜10日後にホッチキスを取り外します。

6. 分析のための組織の収集

1. 移植後の選択されたエンドポイントで、放血によって動物を安楽死させる。具体的には、中央値開腹術を行い、酸素中の5%イソフルラン下で腹部大動脈をトランセクトする。
2. 腎臓を動員し、はさみで腎動脈、静脈、尿管を切除して切除します。
   注:移植したリーフレットを含む領域を把握しないように注意してください。
3. 腎臓をホルマリンに一晩置き、パラフィンに埋め込み、所望の染色のためにそれを切除する。腎臓嚢を前方に向き、腎臓実質を後方に向けるように標本を配向させる。

結果

実験計画のグラフィカルな描写がラットモデルのために提供される(図1)。さらに、ドナーの心臓から解剖された大動脈根および移植用に準備された個々の大動脈弁リーフレットも図2に示す。次に、移植用腎嚢下の大動脈弁小葉の位置の代表的な画像を図3Aに示し、レシピエントラット内の3、7、および28日後(図3B〜

ディスカッション

重要性と潜在的なアプリケーション
機械的および生体補綴式心臓弁は、弁置換を必要とする成人患者において日常的に使用されているが、これらの弁は成長する可能性を欠いており、したがって、小児患者にとって最適ではない。心臓弁移植は、先天性心疾患の新生児および乳児に心臓弁置換術を成長させるように設計された実験的手術である。しかし、従来の心臓移植の移?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.9% Sodium Chlordie, USP	Baxter	NDC 0338-0048-04
4-0 Polyglactin 910	Ethicon	J415H
7.5% Povidone-Iodine	CareFusion	29904-004
70% ETOH	Fisher Scientific	BP82031GAL
Anesthesia induction chamber	Harvard Apparatus	75-2030	Air-tight inducton chamber for rats
Anesthesia machine	Harvard Apparatus	75-0238	Mobile Anesthesia System with Passive Scavenging
Anesthesia Mask	Harvard Apparatus	59-8255	Rat anesthesia mask
Brown Norway Rats (BN/Crl)	Charles River	Strain Code 091	Male, 5-7 weeks, 100-200 g
Buprenorphine Hydrochloride, 0.3 mg/mL	PAR Pharmaceutical	NDC 42023-179-05	0.03 mg/kg, administered subcutaneously
Electric hair clippers	WAHL	79434
Electric Heating Pad	Harvard Apparatus	72-0492	Maintained at 36-38 °C
Heparin	Sagent Pharmaceuticals	NDC 25021-400-10	100U/100g injection into the left atrium
Insulin Syringe, 1 mL	Fisher Scientific	14-841-33
Iris forceps curved	World Precision Instruments	15917
Iris forceps straight	World Precision Instruments	15916
Isoflurane, USP	Piramal Critical Care	NDC 66794-017-25	Induced at 5% isoflurance in oxygen and maintained with 3.5% isoflurane in oxygen
Lewis Rats (LEW/ Crl)	Charles River	Strain Code 004	Male, 5-7 weeks, 100-200 g
Micro forceps	World Precision Instruments	500233	Dumont #5
Micro scissors	World Precision Instruments	501930	Spring-loaded Vannas Scissors
Needle Driver	World Precision Instruments	500226	Ryder Needle Driver
Operating microscope	AmScope	SM-3BZ-80S	3.5x - 90x Stereo Microscope
Petri Dish	Fisher Scientific	FB0875714
Petrolatum ophthalmic ointment	Dechra	NDC 17033-211-38
Skin staples	Ethicon	PXR35	Proximate 35
Sterile cotton swabs	Puritan	25-806 1WC
Sterile gauze sponges	Fisher Scientific	22-037-902
Surgical Scissors	World Precision Instruments	1962C	Metzenbaum Scissors
University of Wisconsin Buffer (Servator B)	S.A.L.F S.p.A.	6484A1	Stored at 4 °C