ファージディスプレイを使用してE3リガーゼ用ユビキチンバリアント変性変性器を開発する

要約

ユビキチン化は翻訳後修飾の重要なタンパク質であり、その中で多くのヒト疾患に関与している調節不全である。このプロトコルは、ファージディスプレイを使用して、ユビキチン化の特異性、効率、パターンを制御するE3リガスの活性を結合および調節できる新しいユビキチン変異体を分離する方法を詳述する。

要約

ユビキチンは、ユビキチンプロテアソーム系のコア成分である小さな8.6 kDaタンパク質です。その結果、高い特異性を持つが、親和性が低いタンパク質の多様な配列に結合することができます。ファージディスプレイを通じて、ユビキチン変異体(UbV)は、野生型ユビキチンに対する親和性が向上し、標的タンパク質に対する結合特異性を維持するように設計することができる。ファージディスプレイはファージミドライブラリーを利用し、それにより、糸状M13バクテリオファージ(ファージ表面に外部に表示されるために選択される)のpIIIコートタンパク質がUbVと融合する。ヒト野生型ユビキチンの特定の残基は、標的タンパク質との新規相互作用を促進するために必要な多様性を導入しながら、タンパク質の構造の有害な変化を回避するようにUbVを生成するために軟らかくランダム化される(すなわち、天然の野生型配列に偏りがある)。ファージ表示プロセス中に、これらのUbVはファージコートタンパク質上に発現および表示され、目的のタンパク質に対してパンされます。標的タンパク質との良好な結合相互作用を示すUbVは保持され、一方、不良な結合剤は洗い流され、ライブラリプールから除去される。UbVの対応するファージミドを含むファージ粒子に取り付けられた保持されたUbVは、別のファージディスプレイで同じ標的タンパク質に対してパンできるように溶出し、増幅し、濃縮されます。通常、ファージディスプレイの最大5ラウンドが実行され、その間に弱くおよび/または無差別に結合するUbVに対して強い選択圧力が課され、親和性の高い人が濃縮され、濃縮されます。最終的には、野生型よりも標的タンパク質に対する特異性および/または親和性を示すUbVは単離され、さらなる実験を通じて特徴付けることができます。

概要

タンパク質とタンパク質相互作用の分子的詳細を理解することは、生物学的プロセスのシグナル伝達機構、特に臨床的に重要な疾患に寄与するシグナル伝達機構を解き出す上で重要です。近年、ファージディスプレイは、目的の^{標的タンパク質1,2,3,4}に対する結合力が大幅に改善されたタンパク質/ペプチドを単離する実用的かつアクセス可能な方法として利用されており、タンパク質とタンパク質相互作用の細胞内プローブとして使用することができます。

ユビキチン化は酵素活性(E1活性化酵素→E2共役酵素→E3リガース)のカスケードであり、タンパク質基質にユビキチン(Ub)を共有結合して分解または細胞シグナル伝達の変化を仲介する。さらに、デュビキチナーゼはタンパク質からのユビキチンの除去を触媒する。したがって、細胞には何千ものUb依存性タンパク質相互作用があり、その大半は親和性は低いが特異性が高い共通の表面を認識し、大きく多様な表面を介して弱い相互作用を可能にする。

Ernstらは、高い選択性を維持しながら、関心のあるタンパク質に対する結合親和性を高めることができるかどうかを確認するために、Ubの既知の結合領域に突然変異を導入した^。100億個以上(7.5 x ¹⁰¹⁰)Ub変異体(UbV)の組み合わせライブラリで、既知のUbタンパク質相互作用を媒介するUb表面全体の位置に変異が生まれました。このライブラリーは、M13バクテリオファージpIIIコートタンパク質を多様なUbVに融合させたフェゲミドで構成されていました。したがって、個々のUbVは、発現時にコートタンパク質を介してファージ表面に表示することができる。選択プロセス中に、標的タンパク質とのかなりの結合相互作用を有するUbVを表示するファージは、ファージディスプレイの後のラウンドで保持され、濃縮され、一方、標的タンパク質に不十分に結合するUbVを表示するファージは洗い流され、ファージプールから除去される。保持されたファージ粒子は、表示されたUbVに対応するファージミドを含み、それらを配列し、一度単離した後にさらに特徴付けることを可能にする。

このタンパク質工学戦略を用いて、UbV阻害剤はヒトデュビキチン酵素⁵およびウイルスプロテアーゼ⁶のために開発された。重要なことに、我々は、E2結合部位をハイジャックし、HECTドメイン7上のUb結合エキソサイトを占有するUbVを活性化することによって、ヒトHECTファミリーE3リガス用の阻害UbVを生成^した。また、E2結合部位を標的とすることにより単量体リングファミリーE3を阻害し、均一体性RING E3s8を活性化するためにUbV二量体化を誘導することができる。マルチサブユニットリングE3の場合、UbvはRINGサブユニット(例えば、APC / C ^complex9)を標的にするか、または複合体形成を妨害することによって阻害を達成することができます(例えば、SCF ^E3s10の場合)。UbVを活用して、Ub-プロテアソーム系(UPS)におけるタンパク質とタンパク質の相互作用を体系的に問い合わせて、UPS酵素の生化学的メカニズムをよりよく解読し、治療介入のための機能的部位を同定および検証することができます。

以下のプロトコルは、以前に生成されたファージ表示UbVライブラリを使用して目的のタンパク質を標的とする方法と、ファージディスプレイの連続したラウンドを介して標的タンパク質と相互作用するUbVバインダーを濃縮する方法を説明する。

プロトコル

1. 試薬の準備

1. PBS(リン酸緩衝塩水):450 mLの超純粋_H2Oと10x PBS溶液の50 mLを混合し、4°Cまたは室温(〜20〜25°C)で濾過し、保存して滅菌します。
2. 10%BSA(ウシ血清アルブミン):BSAの1gを7mLの超純粋な_H2Oにゆっくりと加え、完全に溶解するまで混ぜます(塊なし)。最終容積が10 mLになるまで超純粋な_H2Oで上に上がって下ろします。ろ過により滅菌し、4°Cで保存します。
3. PBバッファー(1%BSAを補うPBS):BSAの5 gを400 mLの超純粋な_H2Oと50 mLのPBSにゆっくりと加え、完全に溶解するまで混ぜます(塊なし)。最終容積が500 mLになるまで超純粋な_H2Oで上に上がります。ろ過により滅菌し、4°Cで保存します。
4. PBTバッファー(1%BSAと0.05%トゥイーン20を添加したPBS):BSAの5gを400mLの超純粋な_H2Oと50mLのPBSにゆっくりと加え、完全に溶解するまで混ぜます(塊なし)。250 μL のトゥイーン 20 を追加します。最終容積が500 mLになるまで超純粋な_H2Oで上に上がります。ろ過により滅菌し、4°Cで保存します。
5. PTバッファー(0.05%トゥイーン20を補ったPBS):1 mLのTween 20と400 mLのPBSを混合する。最終容積が2 Lまで超純粋な_H2Oで上がり、ろ過により滅菌し、4°Cまたは室温(〜20〜25°C)で保存します。
6. 2YTスープ:トリプトン16g、酵母エキス10g、NaCl5gを800mLの超純粋_H2Oに加え、完全に溶解するまで混ぜます(塊なし)。最終容積まで超純粋な_H2Oで上に、オートクレーブ処理(〜20-25°C)でオートクレーブして1 L滅菌します。
7. LB/炭水化物プレート:_H2Oの400 mLに12.5gのLB混合物と7.5gの寒天を加え、最終容積が500mLになるまで超純粋な_H2Oで上がり、オートクレーブ処理によって殺菌します。寒天が完全に溶解していることを確認し、それが60°C以下に冷却するのを待ちます。 500 μLのカルベニシリンを500 mg mLに加え、よく混ぜて、皿に注ぎます。4 °Cで保管。
8. LB/テトプレート:12.5gのLB混合物と7.5gの寒天を超純粋な_H2Oの400 mLに加え、最終容積が500mLになるまで超純粋な_H2Oで上げ、オートクレーブで殺菌します。寒天が完全に溶解していることを確認し、それが60°C以下に冷却するのを待ちます。 500 μLの10 mg mL テトラサイクリンを加え、よく混ぜて、皿に注ぎます。4 °Cで保管。
9. 20%PEG(ポリエチレングリコール)/2.5 M NaCl:PEG-8000の50 gおよび36.5 gのNaClを加え、200 mLの超純粋な_H2Oを加え、完全に溶解するまで混ぜます。
   注: これには時間がかかる場合があります。暖房は助けることができます。最終容積が250 mLになるまで超純粋な_H2Oで上に上がります。ろ過またはオートクレーブによる殺菌。
10. 0.1 M HCl:1 M HClの20 mLと180 mLの超純粋_H2Oを混ぜ、濾過により滅菌し、室温(〜20〜25°C)で保存します。
11. 1 Mトリス(pH 11.0):6.1gのトリスベースを超純粋な_H2Oの40 mLに加え、HClでpHを11.0に調整し、トリスが完全に溶解するまで混ぜます。最終容積が50 mLになるまで超純粋な_H2Oで上に上がります。濾過により殺菌し、室温(〜20〜25°C)で保存します。
12. 100 mg/mL (1000x) カルベニシリン: カルベニシリン二ナトリウム塩 2 g を 20 mL の超純粋 _H2O に加え、完全に溶解するまで混ぜます。濾過により殺菌し、-20°Cで保存します。
13. 50 mg/mL (1000x) カナマイシン: 20 mLの超純粋_H2Oに1gのカナマイシン硫酸塩を加え、完全に溶解するまで混ぜます。濾過により殺菌し、-20°Cで保存します。
14. 10 mg/mL (1000x) テトラサイクリン: 70% エタノールの 20 mL に 0.2 gのテトラサイクリン塩酸塩を加えます。完全に溶解するまで混ぜます。濾過により殺菌し、-20°Cで保存します。

2. タンパク質調製

1. μMでのターゲットタンパク質ストックの濃度を決定します。タンパク質濃度を評価する最も便利な方法は、280 nmでタンパク質ストックの吸光度を測定することです。濃度がmg/mLで既知の場合は、標的タンパク質の分子量を用いてμMに変換してください。目的のタンパク質に応じて、さまざまな方法を使用できます。詳細については、「ディスカッション」セクションを参照してください。
   注:タンパク質が切り捨てられた場合(特定のタンパク質ドメイン/モチーフ)、またはタグ付けされた場合は、mg/mLからμMに変換する際に、これらの分子量の変化を考慮してください。
2. 「ラウンド1」「ラウンド2/3」「ラウンド4/5」とラベル付けされた3つのマイクロ遠心チューブを用意します。
   1. 800 μL PBS で 1 μM に希釈するために必要なタンパク質の体積を計算し、PBS を加えることなくこの体積をチューブにアリコートします。
      注:利用可能な標的タンパク質の量が少ない場合、濃度をわずか0.25μMに下げます。

3. ラウンド1の選択の準備

1. 選択のラウンド2のためのファージ入力を培養するための種子培養を準備します。
   1. 十分に隔離された 大腸菌 コロニーで2YT/tetの5mLを接種し、200rpm軌道揺れで37°Cで一晩インキュベートする。
2. 選択の最初のラウンドのためにプレートをコーティングします。
   1. 適切な量のPBSとアリコート100μLで「ラウンド1」チューブの標的タンパク質を96ウェル結合プレート(すなわち標的プレート)の8つのウェルに希釈します。
      注:ファージディスプレイは、プレートのコーナーにウェルをコーティングすることにより、単一のプレート上で同時に4つの異なるタンパク質のために行うことができます。
   2. オプションのコントロール:GSTまたはMBP(マルトース結合タンパク質)など、標的タンパク質がタグ付けされている場合は、適切なエピトープタグを含む1μM溶液の100 μLで、別の96ウェル結合プレートに8つのウェルをコーティングします。これは、タグに非特異的に結合する望ましくないファージを除去するために使用されます。
   3. 200 rpmの軌道揺れで4°Cで一晩揺れるプレート。

4. 1回の選択

1. ラウンド2入力を準備します。
   1. ステップ3.1から200μLの種子培養で30mLの2YT/tetを接種する。
   2. 細菌が中対数相(_OD600 0.6-0.8)になるまで、200 rpm軌道揺れで37°Cでインキュベートします。これには約3時間かかります。
2. ブロックターゲットプレート。
   1. プレートからコーティング液を取り出し、コントロールプレートが作られた場合は、シンクを反転させて振り付けます。ペーパータオルでパットドライ。
   2. 各コーティングウェルにPBバッファの300 μLを追加します。
   3. ステップ 4.2.1 のように PB バッファを取り外し、さらに 200 μL の PB バッファを追加します。
   4. 300 rpmの軌道揺れで1時間室温(20~25°C)でインキュベートします。
3. ファージライブラリを準備します。
   1. 氷の上にファージライブラリを解凍し、PBSのライブラリの多様性を100倍に希釈します。例えば、ライブラリの多様性が1 x ¹⁰¹⁰ で、ライブラリ濃度が1 x ¹⁰¹³の場合、濃縮が1 x ¹⁰¹²になるようにライブラリを希釈します。ここで使用するライブラリについては、ライブラリの1 mLと9 mLのPBSを組み合わせてPBSで10倍希釈します。
      注: ライブラリの多様性はライブラリの作成時に決定されるべきであり、そうでなければ簡単に評価することはできません。ライブラリー濃度は、中対数相(_OD600 0.6-0.8)で大腸菌細胞を接種し、LB/炭水化物にメッキを行うことによって決定することができる。
   2. 1/5 ボリュームの PEG/NaCl を追加します。たとえば、以前に希釈したライブラリの 10 mL に対して、PEG/NaCl を 2 mL 追加します。
   3. 氷の上で30分間インキュベートします。
   4. 4°Cで30分間11,000xgで遠心分離機、上清を捨て、最近2分間リフュージを残した上清を引き下げる。
      注:2回目に同じ方向にチューブをローターに入れ、ペレットを同じ場所に保管しておくと、見やすくなります。
   5. ファージペレットをタンパク質あたりPBTの1 mLで穏やかに再懸濁します。4つのタンパク質の場合、PBTの4 mLでペレットを再懸濁する。
      注:ペレットに触れないようにし、気泡を導入しないでください。
4. 標的タンパク質にファージを表示します。
   1. オプションのコントロール:コントロールプレートにコーティングされた各ウェルにファージライブラリの100 μLを追加します。300rpmの軌道揺れで1時間室温(〜20〜25°C)でインキュベートし、制御プレートからターゲットプレートにライブラリを移します。ステップ 4.4.2 をスキップします。
   2. ステップ4.2.1のようにターゲットプレートからPBバッファーを取り出し、各コーティングウェルにファージライブラリの100 μLを追加します。
   3. 300 rpmの軌道揺れで1時間室温(20~25°C)でインキュベートします。
5. エルテラウンド1ファージ。
   1. ファージライブラリを取り外し、PTバッファでコーティングされた井戸を4回洗います。プレートを反転し、最後のドロップを取り除くためにペーパータオルをタップします。
      注:複数の標的タンパク質が1つのプレートにコーティングされている場合は、ウェル間のすべての後続の溶液の流れを最小限に抑えるようにしてください。
   2. コーティングされた各ウェルに0.1 M HClの100 μLを加え、300 rpm軌道揺れで5分間室温でインキュベートします。
   3. 1 M トリス-HCl (pH 11)の 12.5 μL をコーティングした各ウェルに加えて pH を中和します。
   4. 溶出したファージを8つの井戸から1つの1.5 mLマイクロ遠心分離チューブにプールします。ピペットは、溶液を均質にし、井戸からすべての液体を吸引するために、転送中に上下します。
   5. 1%の最終的な濃度にプール溶出ファージに10%BSAを加えます。950 μLの典型的なラウンド1溶出量の場合は、10%BSAの95 μLを加えます。4 °Cで保管。 これはラウンド1出力です。

5. その後の選択の準備

1. ステップ 3.1 のように、次の選択ラウンドのファージ入力を培養するためのシード培養を準備します。
2. ステップ 3.2 の場合と同様に、3 回目の選択のプレートに、以下の変更を加えます。
   1. 96ウェル結合プレートにタンパク質あたり4つの井戸のみをコーティングします。「ラウンド2/3」または「ラウンド4/5」の管の半分を適切なラウンドに使用してください。タンパク質が溶液から落ち着くのを避けるために、必要に応じてこれらのチューブの内容物を希釈します。
3. 次の選択のラウンドのためのファージ入力を準備します。
   1. ステップ 4.5.5 からのラウンド 1 出力の半分を使用して、ステップ 4.1 から 3 mL の中間段階のセルを接種します。一般的なラウンド1出力の場合は、出力の500 μLで接種します。
   2. 37°Cで30分間、200rpmの軌道揺れでインキュベートします。
   3. M13K07 ヘルパーファージを 1 x ¹⁰¹⁰ PFU/mL の最終濃度に加えます。
   4. 200 rpmの軌道揺れで37°Cで1時間インキュベートします。
   5. 培養3mL全体を2YT/carb/kanの30mLに移します。200 rpm軌道揺れで37°Cで一晩成長します。
   6. 翌日、培養物を50mL遠心分離チューブに移し、遠心分離機を11,000 x gで11,000 x g で4°Cで10分間培養し、細胞を沈殿させます。
   7. 上清を新しい50 mL遠心管にデカントし、PEG/NaClの8 mLと混合し、氷の上で10分間インキュベートします。
   8. 4°Cで10分間11,000xgの遠心分離機を、上清を捨て、遠心分離機を2分間再び捨てます。
      注:2回目に同じ方向にチューブをローターに入れ、ペレットを同じ場所に保管しておくと、見やすくなります。
   9. ファージペレットを800 μLのPBTで再懸濁して、完全に均質で、塊が見えないようにします。
   10. ファージ溶液を1.5 mLマイクロ遠心分離チューブに移し、遠心分離機を16,200 x g で4°Cで4分間ペレットデブリに移します。
   11. 上清を新しいマイクロ遠心チューブに移します。これは、次の選択ラウンドの入力です。
4. オプション: 入力および出力ソリューションをタイターします。
   1. 大腸菌種子培養の500 μLを使用して、2YT/テットの5 mLを接種し、細菌が中ログ段階になるまで200 rpmの軌道揺れを伴う37°Cでインキュベートします(_OD600 0.6 - 0.8)。これには約1時間かかります。
   2. PBSで^10-3-10-5 に希釈ファージの入力/出力溶液を、培養細胞の90 μLに各希釈液の10 μLを加えます。
      注:ファージは時間の経過とともにチューブに吸い込まれ、変形が偽陰性を生成する可能性があるため、希釈ファージ溶液をすぐに使用してください。
   3. 200 rpm軌道揺れで37°Cで20分間インキュベートします。
   4. 別のLB/炭水化物プレートに5 μLプレート。
      注:メッキされた量は、以前の結果/個人的な好みに依存する可変です。

6. その後の選択ラウンド

1. 以下に示す違いがある手順 3 と 4 で行われた準備と共に、後続のすべてのラウンドを実行します。
   1. 前のラウンドで生成された入力を、ライブラリではなくファージソースとして使用します。前のラウンドから取得したファージ入力の100 μLを有する、標的タンパク質あたり4ウェルをコーティングします。残りのファージ入力を4°Cで保存します。
   2. 選択の各ラウンドで4.5.1のより厳しい洗浄ステップを作ります。ラウンド1は4回の洗浄を必要とし、ラウンド2は6回、ラウンド3は8回、ラウンド4と5の両方が10回洗浄する必要があります。
   3. その後のラウンドは8の代わりに4つの井戸だけをコーティングするので、ラウンド1で使用されるものと比較していくつかのボリュームを減らします。例えば、ステップ4.5.5では、ファージ出力に10%BSAの45μLのみが追加され、ステップ5.3.1ではファージ出力の250μLのみが細胞を接種するために使用されます。

7. 選択後処理とファージの分離

1. ラウンド4と5の入出力ソリューションをタイターします。
   1. ステップ5.4でまだ行われていない場合は、4と5ファージ出力を丸めるために同じ手順に従い、理想的にはいくつかのプレートにわたって30〜300コロニーの範囲を生成します。
2. 培養および分離ファージ。
   1. アリコート450 μLの2YT/carb/M13K07は、96個のミニチューブ培養ボックスのチューブごとに入っています。
   2. 各チューブを接種するために、ステップ7.1からプレートのいずれかからよく隔離されたコロニーを選びます。
      注: 四周出力は四方の出力でボックスの上半分を、ラウンド5出力には下半分を使用します。
   3. 200 rpmの軌道揺れで37°Cで一晩インキュベートします。
   4. 遠心分離機 1,200 x g で 4 °C で 10 分間
   5. 細胞ペレットを邪魔することなく、新しい96ミニチューブ培養ボックスにできるだけ多くの上清を移し、古いものを捨てます。4 °Cで保管。
   6. 新しい箱から、各チューブから100μLを、50%グリセロールの100 μLを含む96ウェル非結合プレートに全ウェルに移します。よく混ぜ、バックアップストックとして-80 °Cで保管してください。

結果

ファージディスプレイから製造されたバインダーは、多くの方法で検証および分析することができます。ファージミドライブラリー内の多様なインサートに隣接するプライマーでファージをシーケンシングする方法を最初に進めることが推奨されます。理想的なファージディスプレイ実験は、いくつかの配列に対する明確なバイアスを示す(図1)。他のシーケンスも存在?...

ディスカッション

ステップ2.1(タンパク質調製物)で述べたように、タンパク質濃度を評価するために様々な方法を使用することができ、ファージディスプレイに使用される特定の標的タンパク質に基づいて、それぞれがユニークな利点と欠点を有するであろう。一般的なメソッドの詳細な説明とプロトコルのソースは、以前に^{提供されています 11}.

前のラウンドのファー?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Axygen Mini Tube System (0.65 mL, sterile, 96/Rack, 10 Racks/pack)	Fisher Scientific	14-222-198	Culturing phage outputs after phage display.
BD Difco Dehydrated Culture Media: LB Broth, Miller (Luria-Bertani)	Fisher Scientific	DF0446-17-3	Preparing plates for titering.
Bovine Serum Albumin (BSA), Fraction V	BioShop Canada	ALB001	Buffer component.
Carbenicillin disodium salt 89.0-100.5% anhydrous	Millipore-Sigma	C1389-5G	Culturing phagemid-infected cells.
Compact Digital Microplate Shaker	Fisher Scientific	11-676-337	Shaking plates during incubation with the phage library.
Corning Microplate Aluminum Sealing Tape	Fisher Scientific	07-200-684	Sealing phage glycerol stocks.
Dehydrated Agar	Fisher Scientific	DF0140-01-0	Preparing plates for titering.
DS-11 Spectrophotometer/Fluorometer	DeNovix	DS-11 FX+	Protein concentration measurement.
Greiner Bio-One CellStar 96-Well, Non-Treated, U-Shaped-Bottom Microplate	Fisher Scientific	7000133	Storing phage glycerol stocks.
Hydrochloric Acid	Fisher Scientific	A144-500	Phage elution.
Invitrogen One Shot OmniMAX 2 T1R Chemically Competent E. coli	Fisher Scientific	C854003	Bacterial strain for phage infection.
Kanamycin Sulfate	Fisher Scientific	AAJ1792406	Culturing M13K07 helper phage-infected cells.
M13KO7 Helper Phage	New England Biolabs	N0315S	Permit phagemid packing and secretion.
MaxQ 4000 Benchtop Orbital Shaker	Fisher Scientific	11-676-076	Bacterial cell culture.
Nunc MaxiSorp 96 well microplate, flat bottom	Life Technologies	44-2404-21	Immobilizing proteins.
Phosphate Buffered Saline (PBS) 10X Solution	Fisher Scientific	BP3994	Buffer component/phage resuspension medium.
Polyester Films for ELISA and Incubation	VWR	60941-120	Covering the microplates during incubation.
Polyethylene Glycol 8000 (PEG)	Fisher Scientific	BP233-1	Phage precipitation.
Sodium chloride	Millipore-Sigma	S3014	Phage precipitation.
Sterile Plastic Culture Tubes: Translucent Polypropylene	Fisher Scientific	14-956-1D	Culturing phage inputs.
Tetracycline Hydrochloride	Fisher Scientific	BP912-100	Culturing E. coli OmniMax cells.
Tris Base	Fisher Scientific	BP1525	Neutralizing eluted phage solution.
Tryptone Powder	Fisher Scientific	BP1421-2	Cell growth media component.
Tween 20	Fisher Scientific	BP337500	Buffer component.
Yeast Extract	Fisher Scientific	BP1422-2	Cell growth media component.