ヒト原発性皮膚線維芽細胞に基づくハンチントン病モデルにおける微小管プラスエンドダイナミクスの可視化

要約

このプロトコルは、EB3タンパク質トランスフェクションによる微小管プラスエンドビジュアライゼーションに専念し、一次細胞培養における動的特性を研究しています。このプロトコルは、ハンチントン病患者から得られたヒト原発性皮膚線維芽細胞に実施された。

要約

蛍光標識マーカータンパク質とタイムラプスビデオ顕微鏡との組み合わせでのトランスフェクションは、細胞骨格の動的特性を研究する古典的な方法です。このプロトコルは、ヒトの原発性線維芽細胞トランスフェクションの技術を提供し、一次細胞培養条件の詳細のために困難であり得る。さらに、細胞骨格の動的特性の維持は微小管の安定化を引き起こすことなく良好な信号対雑音比を得るためにトランスフェクションの低レベルを必要とします。光によるストレスや蛍光色素の退色から細胞を保護する対策を講じるのが重要です。私たちの研究の過程で、我々は人間の一次線維芽細胞研究に適した条件の最良の組み合わせを選択するために、異なるトランスフェクション方法とプロトコルだけでなく、異なるベクターをテストしました。得られたタイムラプス動画を解析し、ImageJを用いて微小管ダイナミクスを計算した。異なる細胞部分における微小管のプラスエンドのダイナミクスは似ていないので、我々は分析をサブグループ(中心領域、ラメラ、線維芽細胞の尾)に分けました。特に、このプロトコルは、患者のサンプルにおける細胞骨格動態の インビトロ 分析に使用することができ、様々な疾患の発症のダイナミクスを理解するための次のステップを可能にする。

概要

ハンチントン病(HD)は、タンパチンチンタンパク質(HTT)をコードする変異遺伝子によって引き起こされる不治の神経変性病理である。HTT は、主に小胞と微小管に関連しており、おそらく微小管依存輸送プロセス^1,2に関与している。微小管ダイナミクスに対する変異HTTの影響を研究するために、成長するプラスエンドを結合して安定化させることによって微小管の動的特性を調節するEB3タンパク質のインビトロビジュアライゼーションを用いた。蛍光標識されたEB3をヒト皮膚線維芽細胞にロードするために、プラスミドトランスフェクションを適用した。この研究では、HD患者の皮膚生検から得られた原発性線維芽細胞培養を用いた。

HTTタンパク質遺伝子の変異は、ポリグルタミン管³の伸びにつながる。HTTは、エンドサイトーシス^4、細胞輸送^1、2、タンパク質分解^5、等のような細胞プロセスにおいて役割を有する。これらのプロセスの大部分は、微小管を含む細胞細胞骨格の様々な要素を含む。

ヒトの初等細胞は、患者細胞で起こる事象を可能な限り密接に再現するのに最適なモデルです。このようなモデルを作成するには、ヒト生検材料(例えば、外科サンプルから)から細胞を分離する必要があります。得られた一次細胞株は、種々の遺伝的、生化学的、分子的、および細胞生物学の方法を用いて病原論を研究するのに適している。また、ヒト一次細胞培養は、様々なトランスフォー分化およびトランスジェニック培養を作成するための前駆体として機能する^6。

しかし、不死化細胞培養とは対照的に、初代細胞の重大な欠点は、その限られた通過能力である。したがって、初期の通路段階(最大15)で細胞を使用することをお勧めします。古い文化は非常に迅速に退化し、そのユニークな特性を失います。したがって、新たに得られた一次細胞は、長期保存のために凍結しておくべきである。

一次細胞培養は、培養条件に影響を受けやすい。したがって、多くの場合、独自のアプローチと増大する条件の最適化が必要です。特に、我々の実験で使用されるヒト皮膚原発性線維芽細胞は、基質に要求されている。そこで、実験の種類に応じて、様々な追加コーティング(例えばゼラチンやフィブロネクチン)を用いた。

細胞骨格は、細胞の形状、移動度、および移動を決定します。細胞骨格の動態は、多くの細胞内プロセスにおいて、相間および有糸分裂の両方において極めて重要である。特に、チューブリンから重合した細胞骨格は、高い動的かつ極性構造であり、運動タンパク質媒介指向細胞内輸送を可能にする。微小管の末端は一定の再配置で、その組立相は分解相と交互に行われ、この動作は「動的不安定性^」7、8、9と呼^ばれる。様々な関連タンパク質は、重合反応の平衡をシフトし、ポリマー形成またはタンパク質モノマー形成のいずれかに導く。管状サブユニットの添加は、主に微小管¹⁰のプラスエンドで起こる。エンド結合(EB)タンパク質ファミリーは、EB1、EB2、EB3の3つのメンバーで構成されています。それらはプラスエンドトラッキングタンパク質(+TIP)として機能し、成長するプラスエンド¹¹を結合して安定化させることによって微小管の動的特性を調節する。

多くの研究では、蛍光分子標識チューブリンマイクロインジェクションまたはトランスフェクションを使用して、タイムラプスイメージングとビデオ分析を行い、 インビトロで微小管を視覚化する。これらの方法は、細胞、特に初等ヒト細胞に侵襲的で有害である可能性があります。最も困難なステップは、細胞トランスフェクションの条件を見つけることです。生存率やネイティブ細胞形態に影響を与えることなく、可能な限り最高レベルのトランスフェクションに到達しようとしました。この研究は、健康なドナーとハンチントン病患者の皮膚線維芽細胞における微小管ダイナミクスの違いを研究するために古典的な方法を適用する。

プロトコル

このプロトコルは、2015年9月8日付の連邦医療生物機関の連邦研究および物理化学医療臨床センターのガイドラインに従っています。

注: 図 1 は、プロトコルの概要を示します。

1. ヒト皮膚線維芽細胞の一次培養を得る(図2)

1. 50 μg/mLのペニシリンと50 U/mLのストレプトマイシンを補った、ダルベッコの修飾イーグル培地(DMEM)培地で、数時間以内に検査室に生検を届けます。
   注:皮膚生検は、患者がインフォームド・コンセントに署名した後、医師によって無菌状態で行われなければなりません。
2. 生検組織を少量の培地と共に6cmのペトリ皿に入れます。
3. 無菌メスを使用して、生検サンプルを約0.5〜1mmの大きさに切ります。1-2で得られた断片を3.5cmのペトリ皿に入れ、生検片の上に無菌カバースリップを置きます。次の組成物に1.5mLの成長培地をゆっくりと加える:DMEM、50 U/mLペニシリンストレプトマイシン、および10%牛血清(FBS)。
4. 培養線維芽細胞は_、CO2インキュベーター内部の成長培地中で、5%CO2、37°C、80%湿度で維持した。
   注:4-7日後、最初のケラチノサイト、次に線維芽細胞は、組織から皿の底に移行し始めます。

2. 一次文化の貯蔵、凍結、凍結解除

1. 培養皿から細胞を取り除きます(ポイント3.2-3.4を参照)。
2. 細胞懸濁液を15 mLの円錐形チューブに移し、遠心分離機を200 x gで5分間移動 します。その後、上清を捨て、冷却されたFBSの900 μLで細胞ペレットを再懸濁します。
3. 凍結保存チューブに滴下し、100 μLのジメチルスルホキシド(DMSO)を加えます。
4. 低温冷凍庫に-80°Cでクライオプローブを入れる。 24時間後、長期保存のために凍結窒素を液体窒素(−−196°C)に移します。
5. 凍結保存された細胞を解凍するには、窒素貯蔵から凍結を取り出し、1分以内に、37°Cに予熱した輸送媒体の9mLを含む15mL円錐状のチューブに1mLの含有量を移す。
6. 慎重に再中断し、200 x gで5分間チューブを遠心分離します。上清を捨て、細胞ペレットを必要量の成長培地に再懸濁し、所要径のペトリ皿の上に置く。

3. 細胞培養

1. 蒸留水で作られたオートクレーブ0.1%ゼラチン溶液で皿底を覆います。15分間インキュベートします。
   注:トランスフェクションビジュアライゼーションには、ガラス底プレート皿(ガラス厚170 μmの共焦点皿)を使用する必要があります。
2. 以下の組成物を有する培地を調製する:DMEMは10%FBS、2 mM L-アラニル-L-グルタミン、50 U/mLペニシリン連鎖球菌シンを添加した。十分に混ぜ合わせ、4°Cで保存します。 培地を37°Cに温め、細胞に加えます。
3. 顕微鏡下で培養を評価する。培地を取り出し、Dulbeccoのリン酸塩溶液(DPBS)で線維芽細胞を洗います。
4. 細胞に1mLのプリ加温0.25%トリプシン溶液を加えます。基板から完全に切り離す場合は、顕微鏡下の細胞を確認してください。1 mLの培養培地でトリプシンを非アクティブ化する。
5. 細胞懸濁液を15 mLの円錐形チューブに移します。チューブを5分間200xgで遠心分離し、上清を取り除き、培養液の1mLで細胞ペレットを再懸濁する。
6. セルの数をカウントします。8-15 x 10³/cm² の密度でそれらを播種し、培養培地の2 mLで再中断するために必要な数の細胞を計算します。
7. ゼラチン溶液を培養皿から取り出し、すぐに2mLの細胞懸濁液を加える。CO2インキュベーターで37°Cで線維芽細胞を栽培します。
8. 2~4日ごとにメディアをリフレッシュします。
   メモ:実験では、4-11の通路のセルを使用してください。

4. トランスフェクション

1. 培養前に培養液を24時間新鮮な培養培地に交換する。
   注: 細胞合流は 70-80% である必要があります。
2. 細胞の播種の面積と密度に基づいてDNA-脂質複合体を調製する。リポソーム系トランスフェクション剤を使用する。
   注:セルシード密度を1 x 10⁴ セル/cm²として使用してください。
3. 3 μLの市販トランスフェクション試薬を、チューブの壁に触れることなく、抗生物質を含まない最適な最小必須培地(Opti-MEM)の125 μLに添加します。穏やかに再中断します。
4. プラスミドDNA(GFP-EB3)を1μg添加して、125μLのオプティ-MEMに添加した。穏やかに再中断します。
   注:GFP-EB3¹¹ をコードする発現ベクターは、A.アフマノワ博士(エラスムス大学、ロッテルダム⁾¹¹の許可を得て、I.カベリナ博士(ナッシュビルのヴァンダービルト大学)から親切な贈り物として受け取りました。
5. 希釈されたトランスフェクション試薬の各チューブに希釈プラスミドDNAを加える(1:1)。30分間インキュベートします。
6. 細胞を含む6cmのペトリ皿にDNA-脂質複合体を加え、30sの十字架スイングと混合する。トランスフェクション剤を24時間インキュベートし、次いで新鮮な培地に変える。24時間および48時間後のトランスフェクションの効率を分析する。
   注:トランスフェクション後24時間、効率は10〜15%、48時間後に40%までであった。

5. イメージングの準備

1. 細胞の生画像化の前に、自己蛍光を低減するためにpH-indicator色素のない培地に培養培地を変更する。
2. ミネラルオイルを培地表面に慎重に塗布して培地を完全に覆い、外部環境から単離して_O2 の浸透と媒体の蒸発を低減する。
3. 水銀ランプと油浸漬60倍または100xの対物レンズを使用して、高い数字の開口を使用して画像を撮影します。
   注:生体内観察のために、顕微鏡は、物体テーブルとレンズを+37°C、CO2供給付きの密閉室、湿度レベルの支持に加熱するなど、細胞に必要な条件を維持するためにインキュベーターを装備する必要があります。湿度を作るために二重蒸留水を使用してください。撮影前に二重蒸留水のレベルを確認してください。
4. 画像化の前に、顕微鏡ホルダーに細胞と共焦点皿を置きます。画像を撮りながら漂わないように、皿とカメラがホルダーにしっかりと取り付けられていることを確認してください。

6. イメージングパラメータの設定

1. 光は細胞損傷性活性酸素種(ROS)を誘導するので、低露出値を選択してください。
   注:ヒト皮膚線維芽細胞における微小管の動態を研究するために、300msの曝露が選択されました。
2. 関心のある対象に焦点を当てます。
   メモ:長期的なタイムラプスイメージングの場合は、自動フォーカス安定化システムを使用して、Z軸に沿ったシフトの可能性を補正します。
3. 細胞の光感度と蛍光色素のフェージングの速度に応じて、最適なイメージング条件を選択します。
   メモ:微小管は非常に動的な構造であるため、適度に短い時間間隔を選択することができ、フレームレートは十分に高くなければなりません。皮膚線維芽細胞の微小管ダイナミクスを調べるには、1フレーム/sの周波数で3〜5分間使用しました。
4. 次のオブジェクトを選択してイメージを取得する場合は、すでにイメージされた領域から離します。このエリアは光の影響を受け、目立つ写真漂白が発生します。
   注:比較的高い画像周波数を使用しているため、画像間のシャッターが閉じ、画像撮影の全期間、ランプが点灯し、フェージングが増加しました。
5. トランスフェクションの品質、微小管の画像の品質(最適な信号対雑音比)、および分析された細胞の場合のドリフトの欠如を考慮して、微小管のダイナミクスを視覚的に研究するための最適なビデオを選択してください(図3)。
6. 選択したビデオを使用して、ImageJ または Fiji プログラムでマイクロチューブのプラスエンドダイナミクスをトレースして、マイクロチューブのプラスエンドダイナミクスを調べることができます (図 4)。
   注: 定量的分析命令については 、図 2 および 補足ファイル 1を参照してください。

結果

生成された GFP-EB3 ムービーは、プロトコルを使用して生成されます (図 1) マイクロチューブの動的特性を示しています。微小管は異なる細胞プロセスに関与しており、その動的特性は患者の生検材料からの原発ヒト細胞培養の様々な生命特性に影響を与える(図2)。

次のパラメータは、微小管の動的不安定性を決定します: 成長...

ディスカッション

微小管のダイナミクス解析の品質の向上は、高品質の顕微鏡画像から得ることができます。生きている細胞のタイムラプスイメージングに必要なすべての条件を観察し、イメージングパラメータを正しく調整することが重要です。ガラスはプラスチックとは異なる屈折率を有するため、ガラス底部(共焦点皿)を備えた特殊な細胞培養皿を使用することは重要である。ガラスの厚さと領域全体?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Instrumentation
Camera iXon DU897 EMCCD	Andor Technology
Eppendorf Centrifuge 5804 R	Eppendorf Corporate
Fluorescence filter set HYQ FITC	Nikon		Alternative: Leica, Olympus, Zeiss
LUNA-II Automated Cell Counte	Logos Biosystems	L40002
Microscope incubator for lifetime filming	Okolab	Temperature controller H301-T-UNIT-BL-PLUS
		Gas controller CO2-O2-UNIT-BL
Objective lens CFI Plan Apo Lambda 60x Oil 1.4 (WD 0.13)	Nikon		Alternative: Leica, Olympus, Zeiss
Widefield fluorescence light microscope Eclipse Ti-E	Nikon		Alternative: Leica, Olympus, Zeiss
Software
Fiji (Image J version 2.1.0/1.53c)	Open source image processing software
NIS Elements	Nikon		Alternative: Leica, Olympus, Zeiss
Additional reagents
Mineral oil (Light white oil)	MP	151694
Cell culture dish
Cell Culture Dish	SPL Lifesciences	20035
Confocal Dish (glass thickness 170 µm)	SPL Lifesciences	211350	Alternative: MatTek
Conical Centrifuge tube	SPL Lifesciences	50015
Cryogenic Vials	Corning-Costar	430659
Microcentrifuge Tube	Nest	615001
Cultivation
Lipofectamine 3000 Transfection Reagent	Thermo Fisher Scientific	L3000001
Dimethyl sulfoxide	PanEko	135
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Media)	PanEko	C420
DPBS (Dulbecco's phosphate-salt solution)	PanEko	P060
Fetal bovine serum (FBS)	Hyclone	K053/SH30071.03
Gelatin (bovine skin)	PanEko	070
GlutaMAX	Thermo Fisher Scientific	35050038
Opti-MEM (1x) + Glutamax	Gibco	519850026
Penicillin-streptomycin	PanEko	A063
Trypsin-EDTA (0.25%)	Thermo Fisher Scientific	25200072
Transfection
Plasmid DNA with EB3-GFP	Kind gift of Dr. I. Kaverina [Vanderbilt University, Nashville] with permission from Dr. A. Akhmanova [Erasmus University, Rotterdam]	Stepanova et al., 2003 DOI: 10.1523/JNEUROSCI.23-07-02655.2003