マウス後肢モデルにおける動脈形成中の白血球動員モニタリングのための多光子生体内イメージング

要約

白血球および血小板の動員は、動脈形成中の側副動脈の効果的な成長に必要な必須成分を構成する。多光子顕微鏡は、動脈形成中の白血球の動員と血管外漏出を研究するために、 in vivoで 高い時空間分解能と光毒性の低い細胞ダイナミクスを追跡するための効率的なツールです。

要約

動脈形成は、成長する側副血管の血管周囲腔への白血球および血小板動員に強く依存する。動脈形成における側副動脈および白血球を分析するための標準的なアプローチは、 ex vivo (免疫)組織学的方法論である。ただし、この手法では、血流、せん断応力、細胞間相互作用、粒子速度などの動的プロセスを測定できません。この論文は、生体内イメージングを利用して、動脈形成中に成長する側副動脈の in vivo プロセスを監視するためのプロトコルを提示します。ここで説明する方法は、ダイナミクス測定のための信頼性の高いツールであり、多光子励起顕微鏡によって提供される最小限の光細胞毒性で高コントラスト分析を提供します。成長する側副動脈を分析する前に、大腿動脈の片側結紮によってマウスの内転筋に動脈形成が誘導された。

結紮後、せん断応力の増加により既存の側副動脈が成長し始めました。術後24時間で側副動脈の上の皮膚と皮下脂肪を取り除き、さらなる分析のためのポケットを構築した。in vivoイメージング中の血流および免疫細胞を視覚化するために、CD41-フルオレセインイソチオシアネート(FITC)(血小板)およびCD45-フィコエリスリン(PE)(白血球)抗体を、マウスの尾静脈に配置されたカテーテルを介して静脈内(i.v.)注射した。この記事では、動脈形成に関連するプロセスを研究するために、一般的に使用される静的ex vivo(免疫)組織学的分析の代替またはin vivo補完として、生体内多光子イメージングを紹介します。要約すると、この論文は、動脈形成の後肢モデルにおける免疫細胞輸送、血流、およびせん断応力を調査するための新規で動的なin vivo法について説明し、評価の可能性を著しく高めます。

概要

近年の集中的な研究の関心にもかかわらず、虚血性心疾患や脳卒中などの心血管疾患は、依然として世界の主要な死因です¹。これらの疾患に対する現在の治療法は、経皮経管的血管形成術、経皮的経管的冠動脈形成術、バイパス手術などの高侵襲療法です²。したがって、代替の非侵襲的治療選択肢の開発が緊急に必要とされている。身体は、狭窄または閉塞した血管の周りに自然なバイパスを作成して、中断された血流を狭窄の遠位部分に向け直すことができます。このプロセスは動脈形成²と呼ばれます。最近の多くの研究では、流体せん断の増加が動脈形成中に重要な役割を果たす白血球動員に影響を与えることが示されています³。動脈形成中の白血球の動員を分析するための現在の主なオプションは、 ex vivo (免疫)組織学的分析または蛍光活性化セルソーティング(FACS)方法論です⁴。動脈形成中の白血球動態の評価を可能にするために、この論文は多光子顕微鏡による生体内イメージングプロトコルを提示します。

白血球は、動脈形成の過程で動員される主要な血球です³。このプロトコルは、多光子イメージングを使用して、マウス後肢虚血モデル^5,6を採用した大腿動脈結紮(FAL)による動脈形成の誘導から24時間後に、側副動脈に注射された抗CD45-PE抗体で標識された付着性白血球のクロールを示します。あるいは、免疫細胞をex vivoで標識し、生体内顕微鏡を用いた血管新生に関する研究で示されているように、マウスに注意深く注射することができます⁷。血管および動脈内の血流は、CD41-FITC(血小板を標識するため)、デキストラン-FITC(血漿)、または血管樹の一部の基底膜に存在するコラーゲンタイプ1を視覚化する第2高調波発生(SHG)によって視覚化できます。SHGは、多光子励起のユニークな遊離標識効果です。多光子イメージングは、組織を傷つけたり、レーザーパワー励起によって細胞を活性化したりすることなく、長期的な細胞追跡を可能にします。多光子顕微鏡は、蛍光色素を最小限の光毒性で組織/臓器の奥深くまで励起できるため、生きている動物の蛍光標識された細胞や構造を視覚化するためのイメージング法として最適です⁸。

フェムト秒間隔内にパルスが供給される同調された赤外線レーザーを使用すると、焦点面8の上下に励起することなく、焦点面でのみ蛍光色素が励起^{されます。}したがって、多光子顕微鏡は、臓器内の動的な生物学的事象を研究するための高い時空間分解能、より少ない光損傷、および組織浸透イメージングの増加を可能にします。生きた動物のイメージングに理想的な顕微鏡ツールです。ただし、多光子やその他の生体内顕微鏡検査の技術は、心拍、呼吸、蠕動運動、筋肉の緊張、およびその他の生理学的機能による組織の動きによって制限され、画像の取得と分析を妨げます。これらの動きは時間的および空間的な分解能を損ない、時にはその後の分析を妨げることさえあるため、正確なデータ分析と解釈を可能にするために適切に対処する必要があります。組織の動きによるアーチファクトを低減または防止するために、いくつかの戦略が開発されています。このプロトコルは、VivoFollow⁹と呼ばれるin situドリフト補正ソフトウェアを適用して、画像取得中の組織ドリフトを補正します。このアプローチは、必要な画像安定化を提供し、長期的なイメージングと細胞追跡分析を可能にします。

プロトコル

この研究は、バイエルン州動物管理使用委員会によって承認されました(倫理規定:ROB-55.2Vet-2532.Vet_02-17-99によって承認されました)。これらの実験は、ドイツの動物法ガイドラインに厳密に従って実施されました。

1.動物と大腿動脈結紮術(FAL)

注:無菌の炎症と動脈形成を誘発するために、8〜10週齢の雄C57BL / 6Jマウスを使用しました。いずれのマウスも、FALまたは偽の手術中または手術後にそれぞれ死亡または創傷感染または創傷治癒障害に罹患しなかった。

1. 麻酔
   注:MMFミックス麻酔を注射する前に、マウスが眠るまで最初に5%イソフルランで麻酔をかけることをお勧めします。
   1. マウスの体重を量り、ミダゾラム5.0 mg / kg、メデトミジン0.5 mg / kg、およびフェンタニル0.05 mg / kgの用量でMMFミックスを調製します。.
   2. 1 mLシリンジにMMFミックスを満たし、30 G針を使用して最終容量100 μL s.c.を注入します(5%イソフルランによる麻酔後)。
   3. マウスを温かいパッドの上に置き、マウスが完全に麻酔されるまで待ちます。タイマーを35分に設定します。この時間の後、MMFミックスの用量の半分(50μL)を注射します。
   4. マウスのペダルと指間反射(つま先のつまみをしっかりして)テストして、麻酔の深さを確認します。
      注:反応がない場合は、適切な鎮痛の深さを示します。
2. 大腿動脈結紮術(FAL)
   注意: 滅菌手術器具と縫合糸を使用してください。開封前と閉鎖後に消毒剤で皮膚を消毒してください。
   1. 麻酔をかけたマウスを加熱プレート(35〜37°C)に置いて、生理的な体温を維持します。アイクリーム(デクスパンテノール)を各目に塗り、麻酔下での目の乾燥を防ぎます。
   2. 麻酔をかけたマウスをFALの前後にレーザードップラーイメージング(LDI)チャンバーに移し、血流と灌流を確認します(図1A-C)。
   3. 髪を取り除き、皮膚を消毒し、大腿動脈にアクセスするために切り傷を入れます。手術顕微鏡下で、編組絹糸縫合糸(7-0)を用いてマウス後肢の右大腿動脈を結紮し、左大腿動脈に対して偽手術を行い、前述の^ように内部コントロールを兼ねる6(図1D-K)。
      注:皮膚の切開は、皮膚に近い血管への直接の損傷を避けるために小さなハサミで行われました。
   4. 編組シルク縫合糸(6-0)を使用して皮膚を閉じます。ブプレノルフィン(0.1 mg / kg)s.c.を12時間ごとに投与し、痛みを和らげるために麻酔に拮抗する前に10分から開始します。.痛みの信号、すなわち、グルーミング活動の低下、動きの躊躇、または手術後24時間の猫背姿勢について動物を観察します。
   5. ナロキソン(1.2 mg / kg)、フルマゼニル(0.5 mg / kg)、およびアチパメゾール(2.5 mg / kg)の組み合わせを注射して、FALを終了して皮膚を閉じた後に麻酔に拮抗します。.
   6. 手術後、マウスを暖かいパッドの上に置き、直立姿勢を維持し、ケージの周りを正常に歩き始めるまで動物を継続的に監視します。
   7. マウスが完全に目覚めたら、他のマウスと一緒にケージに戻し、ケージを動物飼育室に戻します。

2. 多光子生体内イメージングのための組織調製

1. 尾静脈注射
   注:動物は、生体内イメージングの準備を開始する前に麻酔下にある必要があります。静脈カテーテルの針を導入する前に、尾に皮膚消毒剤を塗布することをお勧めします。これは血管を視覚化するのにも役立ちます。
   1. 2 x 30 G針、10 cmの細口径ポリエチレンチューブ(内径0.28 mm、外径0.61 mm)、1 mLシリンジ、およびヒストアクリル接着剤を使用して尾静脈注射カテーテルを準備し、イメージング中にさらに静脈注射を行うためにカテーテルをマウステールに固定します(図2A、B、および図2F)。
   2. 静脈注射用の抗体溶液を調製します:CD45-PEおよびCD41-FITC(20 μg/マウス)を最終容量100 μLで。
   3. 尾に横方向に配置された尾静脈がないか確認し、静脈をせき止めて尾静脈を特定します。尾部を消毒し、静脈カテーテルを挿入し、組織組織アクリル接着剤を使用して固定します(図2B)。
   4. イメージング前(少なくとも15分前)および組織調製終了後に抗体を注入します。
2. ティッシュの準備
   注意: 組織の準備の前に、常に温かいパッドを使用し、各目にアイクリーム(デクスパンテノール)を一滴投与してください。滅菌手術器具と縫合糸を使用してください。開封前と閉鎖後に消毒剤で皮膚を消毒してください。
   1. 麻酔をかけたマウスを安定したポータブルパッドに置きます。粘着テープを使用してパッドに4点固定して、マウスを仰臥位に固定します(図2B)。
   2. 2枚のモデリング粘土を成形し、マウスの上後肢の下に配置して、内転筋の平面位置を確保します(図2B、赤い矢印で示されています)。
   3. マウスの体温を37°Cで安定させるには、マウスを0.64〜4.0倍ズームで手術用顕微鏡下の加熱プレートにパッドを置きます(図1L)。
   4. 両脚の毛を取り除き、皮膚を消毒し、右後肢の大腿動脈結紮術の瘢痕の周りを円を描くように皮膚を切ります(図1M)。
   5. 脚の上部から皮膚と脂肪層を取り除き(図1N、O)、縫合糸を使用して残りの皮膚を脇に引っ張り、内転筋の周りにポケットを作成します(図1P、Q)。
   6. 皮下脂肪を除去して、内転筋、深遠な動脈/静脈、および側副血管の明確なビジョンを取得します(図1Q、R)。
   7. 側副血管の上にある表在筋層を細かい鉗子で慎重に解剖して、慎重に除去し始めます(図1R)。
      注意: 側副動脈と側副静脈ははっきりと見え、イメージングの準備ができています(図1S)。
   8. 組織の乾燥を避けるために準備したポケットに生理食塩水を入れ、偽手術の左後肢に対して同じ手順を続行します。イメージングの前に、両方のポケットに超音波ゲルを追加すると、乾燥を防ぎ、対物レンズとの光結合のための浸漬媒体として機能します(図2C および 図2F)。

3. 生体内多光子顕微鏡

1. 準備
   注:顕微鏡のインキュベーターチャンバー内に超音波ゲル入りのシリンジを保管して、長期イメージング中にポケットを補充するための暖かい温度を維持します。
   1. 準備した2つのポケットから生理食塩水を取り出し、超音波ゲルと交換して側副血管を覆います(図2C)。
   2. 尾静脈カテーテルを通して抗体溶液を注入します。抗体注入の15分後、固定マウスを有するパッドを加温された多光子イメージングチャンバーに移す(図2F)。
   3. 画像取得の完了後、深部ナルコーシス下で頸部脱臼によりマウスを安楽死させる。
2. 多光子顕微鏡画像取得
   注意: レーザー安定化を可能にするために、イメージングの30分前に顕微鏡の電源を入れてください。顕微鏡の最高の光学的安定性のために、顕微鏡チャンバーを恒久的に加熱しておくことをお勧めします。
   1. Ti:Sapphireレーザーボックス、電子インターフェースボックス、インキュベーションチャンバーの加熱ユニット、蛍光灯、およびコンピューターのキーをオンにします(図2D、E)。
   2. 取得ソフトウェア(インスペクターソフトウェア)を起動します。波長を800nmに設定し、顕微鏡シャッターを開きます(図3A ii)。
   3. 測定 ウィザードダイアログで、 計器 モード(シングルビーム)と 測定モード (3Dスキャンタイムラプス)を選択します(図3A i)。
   4. 麻酔をかけたマウスを顕微鏡の予め温めたインキュベーションチャンバーに移します。超音波ゲルのある領域(ステップ2.2.8)を対物レンズのフロントレンズに直接接触するように配置します(図2F)。
   5. 落射蛍光顕微鏡のシャッターを開き、FITC視覚化に適したフィルター/ダイクロイック設定を選択し(4)、落射蛍光照明下で血流を追跡して関心領域を見つけます。対象領域を中央視野に入れたら、落射蛍光顕微鏡シャッターを閉じます。
   6. [xy-Scanner]ダイアログで、画像サイズ(554x554)、ピクセル(512x512)、周波数(400)、ライン平均(1)のパラメータを設定します(図3A iii)。レーザー出力(5%)を調整し(図3A iv)、チャネルの光電子増倍管(PMT)ゲインを緑(66)、赤(66)、および青(63)に設定します(図3A v)。
   7. 生体内イメージングとドリフト補正の設定に適切な対物レンズを選択します(3.2.11の詳細を参照)。
      注:ここで選択された対物レンズはニコンLWD 16xでした(図3A vi)。
   8. 測定ウィザードダイアログウィンドウの右上隅にある赤いボタンを押してプレビュー取得モードを開始することにより、画像スタック範囲を定義します(図3A i)。
   9. 焦点を合わせることによって関心のある領域と構造を定義し、良好な画像を取得します。次に、画面を観察しながら、画像が消えるまで対物レンズを上に動かしてフォーカスを変更し、ゼロ(first=0)に設定します。画像が再び画面から消えるまで対物レンズを下に動かして反対方向にフォーカスを変更し、軸方向の最後の位置(end=40μm)として設定します(図3A vii)。
   10. ステップサイズを2μmに設定します。 測定ウィザードダイアログ の右上隅にある赤いボタンをクリックして、プレビュースキャンを停止します。
       注意: 図3A viiに示すように、画像の数が自動的に計算および設定されます(21画像)。
   11. 顕微鏡にライブドリフト補正⁹が装備されている場合は、ドリフト補正ソフトウェア(VivoFollowなど)を起動し、以下の手順に従ってください。
       1. 測定ウィザードダイアログで、最初の軸デバイスとしてPython軸(Python Ax)(図3A viii)を選択します。自動保存モードを有効にしないでください。時間軸(時間時間)でのみ自動保存(AS)ボックスにチェックを入れます。[使用可能なデバイス]ウィンドウのPythonアイコンを押して(図3A ix)、Pythonダイアログウィンドウを開きます。
       2. Python ダイアログの軸設定で、開始 (0 ゼロ) と終了 (-40) を入力します。ステップ (21) を図 3A x に示すように入力します。
       3. xyzステージZダイアログウィンドウに移動し、スキャン範囲を両端で200 μm拡大します:開始に(200 μm)と入力し、終了に(-240 μm)と入力すると、範囲が自動的に設定されます(-440 μm)。ステップサイズ(2 μm)を図3A xiに示すように維持します。
       4. VivoFollowフロントエンドダイアログを開き、モーションプロファイルボックスをクリックします(図3A xii)。
       5. Inspectorソフトウェアの 測定ウィザードダイアログ の左上隅にある緑色の矢印を押して、画像取得を開始します(図3A i)。
       6. ライブドリフト補正を使用する場合は、 図3A xiiiに示すように、ドリフト補正構成のダイアログを探します。不動のランドマーク基準として使用する取得チャンネルを設定します(このプロトコルでは、血管トレーサー信号を記録するチャンネル2を選択します)。最初と最後のz位置(ここでは200μm)に追加された最大補正オフセットをμm単位で入力し、「 OK」をクリックします。
       7. VivoFollowのフロントダイアログウィンドウでの画像取得中に、x、y、zの電流ドリフトオフセットをリアルタイムで監視します図3A xiv。
       8. 麻酔の再注入の別のサイクルが必要な場合は、~35分後に画像取得を停止します。MMFミックスの半分の用量(50 μl s.c)を注入し、緑色の矢印をもう一度押して画像取得を再開します(ステップ3.2.11.5)。
       9. 実験が終了するまでこの手順を繰り返します。

結果

多光子顕微鏡は、白血球追跡のための高い時空間分解能を提供し、細胞移動ステップと速度を追跡および監視できます(図4A、B)。ただし、サンプルの生理学的動きは、特に長期間の生体内顕微鏡画像取得にとって課題となります。したがって、組織を固定するための良好な組織調製物およびホルダーおよび組織ドリフトのためのリアルタイム画像補正などの...

ディスカッション

記載された白血球動員の多光子 インビボ 分析の方法は、(免疫−)組織学的またはFACS分析のような白血球動員研究のために一般的に使用されるツールへの追加を表す。このイメージング方法を用いると、動脈形成¹⁰時の白血球付着および血管外漏出における動的過程をより詳細に可視化することができる。この方法の付加価値にもかかわらず、提供されるプロトコルに...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.0 mL Syringe	BD Biosciences, San Jose, CA, USA	309628	syringe for injection
3M Durapore Surgical Tape 1538-0	3M, St. Paul, MN, USA	1538-0	fixation tape
Atipamezole	Zoetis, Berlin, Germany		antagonize anesthesia
Buprenorphine	Reckitt Benckiser Healthcare, Slough, UK		antagonize anesthesia
C57/B6J mouse	Charles River, Sulzfeld, Germany		used animals for surgery/imaging
CD41-FITC ab	Biolegend	133904	Platelet labeling in vivo
CD45-PE ab	Biolegend	368510	Leukocytes labelling in vivo
Disinfectant Cutasept	Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Deutschland	AK64.2	Disinfection
Eye cream (Bepanthen)	Bayer Vital GmbH	5g
Fentanyl	CuraMED Pharma, Karlsruhe, Germany		anesthesia
Flumazenile	Inresa Arzneimittel GmbH, Freiburg, Deutschland		antagonize anesthesia
Fine bore polythene tubing	Smiths medical	Lot 278316	0.28 mm ID and 0.61 mm OD, tubing for the vein catheter
Histoacryl flexible	BRAUM	1050052	tissue glue
Imaris software	Oxford Instruments	version 9.2	Used for cell tracking, cell speed analysis, 3D projection
Laser Doppler Imaging instrument	Moor LDI 5061 and Moor Software Version 3.01, Moor Instruments, Remagen, Germany
LEICA KL300 LED	Leica, Solms, Germany		light for microscope
Leica M60	Leica, Solms, Germany		microscope for surgery
LEICA MC120 HD	Leica, Solms, Germany		camera for microscope
Medetomidine	Pfizer Pharma, Berlin, Germany		anesthesia
Midazolam	Ratiopharm GmbH, Ulm, Germany		anesthesia
Multiphoton microscope	Lavision	TRIMScope II	WL 820 nm
NaCl 0.9%	Braun, Melsungen, Deutschland	3570310	saline for pocket
Naloxone	Inresa Arzneimittel GmbH, Freiburg, Deutschland		antagonize anesthesia
Needle 30 G	BD Biosciences, San Jose, CA, USA	305128	needle for i.v. catheter
Silk braided suture (7-0)	Pearsalls Ltd., Taunton, UK	SUT-S 103	suture for femoral artery ligation
Ultrason Gel	SONOSID-ASID BONZ 250 mL	782012	gel for imaging
Vicryl 6.0 suture	Vicryl, Johnson&Johnson, New Brunswick, NJ, USA	NW-2347	suture to build pocket
VivoFollow drift correction software	Developed by Mykhailo Vladymyrov		Reference 9