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要約

本研究は、3つの異なる肺提供モデル(脳死後提供、循環死後提供、出血性ショック後提供)の確立を示しています。これらのイベントに関連する炎症過程と病理学的障害を比較します。

要約

実験モデルは、さまざまな病態生理学的事象に関与する病因現象を理解するための重要なツールです。これに関連して、移植後の原発性移植片機能障害の病態生理学を引き起こす要素を研究するために、さまざまな動物モデルが使用され、潜在的な治療法が評価されます。現在、実験的ドナー提供モデルは、脳死後のドナーと循環停止後のドナーの2つに大きく分けられます。さらに、臓器提供の動物モデルを検討する際には、出血性ショックに関連する有害な影響を考慮する必要があります。ここでは、3つの異なる肺提供モデル(脳死後提供、循環死後提供、出血後ショック提供)の確立について説明し、これらのイベントに関連する炎症過程と病理学的障害を比較します。目的は、関連する病理学的メカニズムを研究し、移植のための実行可能な移植片の数を最適化するための新しい治療標的を探索するための肺提供の信頼できる動物モデルを科学界に提供することです。

概要

臨床的関連性
臓器移植は、いくつかの重篤な病状に対する確立された治療法の選択肢です。近年、原発性移植片機能障害(PGD)の病態生理学に関する知識の向上や、集中治療、免疫学、薬理学の分野の進歩など、臓器移植の臨床および実験分野で多くの進歩が達成されています1,2,3。関連する外科的および薬理学的処置の成果と質の向上にもかかわらず、利用可能な臓器の数と待機リストのレシピエントの数との関係は依然として主要な課題の1つです2,4。この点に関して、科学文献は、移植時まで臓器を治療および/または保存するために臓器提供者に適用できる治療法を研究するための動物モデルを提案しています5,6,7,8。

動物モデルは、臨床診療で観察されるさまざまなイベントを模倣することにより、関連する病理学的メカニズムとそれぞれの治療アプローチの研究を可能にします。これらのイベントの実験的誘導は、ほとんどの場合、臓器移植に関する科学文献で広く調査されている臓器および組織提供の実験モデルを生成しました6,7,8,9。これらの研究は、脳死(BD)、出血性ショック(HS)、循環死(CD)を誘発するものなど、さまざまな方法論的戦略を採用しています。

脳死(BD)
BDは、さまざまなシステムの進行性の劣化につながる一連のイベントに関連しています。これは通常、脳の外傷または出血により頭蓋内圧(ICP)の急性または段階的な上昇が起こったときに発生します。このICPの増加は、クッシング反射10,11として知られるプロセスで安定した脳血流を維持しようとして血圧の上昇を促進します。これらの急性変化は、移植後の罹患率と死亡率に影響を与えることに加えて、提供された臓器の量と質を損なう心血管、内分泌、および神経学的機能障害を引き起こす可能性があります10,11,12,13。

出血性ショック(HS)
HSは、臓器提供者の多くが血液量を大幅に減少させる外傷の犠牲者であるため、臓器提供者と関連していることがよくあります。肺や心臓などの一部の臓器は、血液量減少とそれに伴う組織低灌流のためにHSに対して特に脆弱です14。HSは、毛細血管透過性の増加、浮腫、および炎症細胞の浸潤を通じて肺損傷を誘発し、ガス交換を損ない、進行性の臓器劣化を引き起こし、その結果、提供プロセスを脱線させます6,14。

循環器死(CD)
CD後提供の利用は、世界の主要施設で指数関数的に増加しており、収集される臓器の数の増加に貢献しています。CDドナーから回収された臓器は、低血(苦悶期)または無血(無収縮期)の間隔の後に発生する温虚血の影響を受けやすい8,15。低灌流または血流の欠如は、ATPの突然の喪失および組織内の代謝毒素の蓄積に関連する組織低酸素症につながる15。現在、臨床診療における移植に使用されているにもかかわらず、これらの臓器の使用が移植後の移植片の質と患者の生存に与える影響については、多くの疑問が残っています15。したがって、CDに関連する病因をよりよく理解するための実験モデルの使用も増加しています8,15,16,17。

実験モデル
臓器提供には、さまざまな実験的臓器提供モデル(BD、HS、CD)があります。しかし、研究では、一度に1つの戦略にしか焦点を当てないことがよくあります。2つ以上の戦略を組み合わせたり比較したりする研究には顕著なギャップがある。これらのモデルは、献血数を増やし、その結果、潜在的なレシピエントの待機リストを減らすことを目的とした治療法の開発に非常に役立ちます。この目的で使用される動物種は研究ごとに異なり、目的がヒトの形態生理学とのより直接的な翻訳であり、動物のサイズによる外科的処置の技術的困難が少ない場合に、ブタモデルがより一般的に選択されます。利点にもかかわらず、物流上の困難と高いコストがブタモデルに関連しています。一方、低コストで生物学的操作の可能性は、げっ歯類モデルの使用を支持し、研究者が病変を再現および治療するための信頼できるモデルから開始することを可能にし、臓器移植の分野で得られた知識を統合することを可能にする。

ここでは、脳死、循環器死、出血性ショック提供のげっ歯類モデルを紹介します。これらの各モデルに関連する炎症過程と病理学的状態について説明します。

プロトコル

動物実験は、サンパウロ大学医学部の実験動物の使用と管理に関する倫理委員会(プロトコル番号112/16)に準拠しています。

1.動物のグループ化

  1. 12匹の雄の Sprague Dawley ラット(250〜300 g)を3つの実験グループ(n = 4)の1つにランダムに割り当てて、動物モデルに関連する効果を分析および比較します。
  2. 動物を出血性ショック群(HS、n = 4)に割り当てます:出血性ショック誘発を伴う血管カテーテル法を受けた動物+360分間の維持+心肺ブロック抽出+分析用のサンプル調製。
  3. 動物を脳死群(BD、n=4)に分類:脳死+360分間維持+心肺ブロック抽出+分析用サンプル調製。
  4. 動物を循環死群(CD、n = 4)に割り当てます:血管カテーテル法+循環死の誘導+換気の停止+室温で180分間の虚血+分析用のサンプル調製を受けた動物。

2.麻酔と術前の準備

  1. ラットを5%イソフルランを含む密閉チャンバーに1〜4分間置きます。つま先挟み反射をチェックして、適切な麻酔を確認します。反射反応がない場合(足の引っ込みなし)、小児喉頭鏡の助けを借りて口腔気管挿管(14-Gアンギオカス)を実行します。
  2. 以前に調整した人工呼吸器(FiO2 100%、一回換気量10 mL / kg、90サイクル/分、およびPEEP 3.0 cmH2O)を使用して、気管カテーテルを人工呼吸器に接続し、麻酔薬濃度を2%に調整します。
    注:動物モデルに関連するすべての手順は、このセクションで説明するのと同じ麻酔プロトコルに従いました。
  3. 関心のある領域(頭、首、胸、腹部)から毛皮を取り除きます。次に、ガーゼを使用して、手術野と動物の尾を消毒します。消毒は、ジグルコン酸クロルヘキシジンスクラブのアルコール溶液を3回交互に行います。
  4. 動物の尻尾の先端を切り、親指と人差し指を尻尾の付け根の上に置き、押して根元から離します。末梢血サンプル(20μL)をテールから採取し、総白血球数8を採取します。
    注:この手順は、気管切開の開始前と各プロトコルの終了直後に実行する必要があります(BDおよびHS-360分後)。
  5. 精密ピペットを使用して、採取した血液を380μL(1:20)のターク溶液(氷酢酸99%)で希釈します。希釈したら、血液サンプルをノイバウアーチャンバーにピペットで移し、顕微鏡(40倍)下に置きます。チャンバーの4つの側方象限で総白血球数を実行します。

3.気管切開

  1. 適切なはさみと鉗子の助けを借りて、頸部気管の縦方向の解剖を行い、首の中央3分の1から胸骨上ノッチ(figure-protocol-14141.5 cm切開)まで行います。皮膚と皮下組織を切開した後、気管が露出するまで頸椎の筋肉を解剖します。
  2. 気管の下に2-0のシルク結紮糸を1つ置きます。
  3. マイクロハサミを使用して、気管の上部3分の1を気管切開し、均一な換気を実現します。金属製のカニューレの直径(3.5 cm)に対応するために、2つの軟骨リングの間の気管を水平に切断します。
  4. 換気チューブを挿入し、準備した結紮糸で固定します。
  5. 換気チューブを小動物換気システムに接続します。
  6. 一回換気量10mL / kg、速度70サイクル/分、および3cmH2OのPEEPでラットを換気します。

4.大腿動脈と静脈カテーテル検査

  1. 鼠径部の小さな切開部(figure-protocol-19241.5 cm)から大腿骨の三角形を露出させます。大腿血管を特定して分離します。この手順では、実体顕微鏡(倍率3.2倍)を使用します。
  2. 血管(静脈または動脈)の下に2つの4-0シルク結紮糸を、1つは遠位に、もう1つは近位に配置します。最も遠位の結紮糸を閉じてから、近位結紮糸に事前に調整された結び目を配置して引っ張ります。
  3. カテーテルを血管の小さな事前に形成された切開部に挿入します。脱臼を避けるためにカニューレを固定します。
    注:カテーテルは、動物の静脈ネットワークの口径に適した末梢静脈内カテーテルに加熱して溶接した20cmの新生児エクステンダーから、血液内容物の逆流を防ぎます。カニューレをヘパリンで潤滑し、平均動脈圧(MAP)測定中の血栓の形成や合併症を回避します。
  4. 動脈カテーテルを圧力トランスデューサーとバイタルサインモニタリングシステムに接続して、平均動脈圧(MAP)を記録します。トランスデューサーは、動物の心臓の高さに配置する必要があります。10 分ごとに MAP を記録します。
  5. シリンジカテーテル(3 mL)を静脈に挿入し、必要に応じて水分補給と放血を目指します。.

5.出血性ショック誘発

  1. 静脈アクセスとヘパリン処理シリンジを使用して、50 mmHgの figure-protocol-2654MAP値に達するまで少量の血液を除去し、出血性ショックを確立します。.
    注:実験の最初の1時間は10分ごとに2 mLのアリコートを採取し、その後の数時間は30分ごとに採取します。
  2. 圧力を約50mmHgで360分間安定させます。これを行うには、圧力が上昇または下がった場合は、それぞれ血液のアリコートを除去または追加します。.
  3. 低体温症を避けるために、近くに熱源を置きます。
    注:ここでは、ヒートランプが使用されています。
  4. プロトコルの最後に、肺ブロックを総肺活量(TLC)で採取し、液体窒素で瞬間凍結するか、さらなる研究のために固定溶液に入れます。
    注:小動物用人工呼吸器の助けを借りて、プロトコル中に換気パラメータにアクセスできます。本研究では、これらのパラメータは、HS導入の直前(ベースライン)と360分後(最終)に評価されました。

6.循環死誘導

  1. 循環死を誘発するには、静脈ラインから150 mg / kgのチオペンタールナトリウムを投与します。.次に、換気システムをオフにします。
  2. MAPが0mmHgに達するまで徐々に減少していることに注目してください。この時点から、温暖虚血期間の開始を考慮し、時間カウントを開始します。動物は室温(約22°C)で180分間放置する必要があります。
  3. プロトコルの最後に、肺を人工呼吸器に再接続し、TLCで肺ブロックを採取して収集します。液体窒素を使用して急速凍結するか、固定液に入れてさらに研究します。

7.脳死誘導

  1. ラットをうつ伏せの位置に置きます。
  2. 手術用ハサミを使用して頭蓋骨から皮膚を取り除きます。矢状縫合糸の前方2.80mm、腹側10.0mm、矢状縫合糸の外側1.5mmに1mm口径のボアホールを開けます。
  3. バルーンカテーテル全体を頭蓋腔に挿入し、バルーンに生理食塩水(500μL)があらかじめ充填されていることを確認します。
  4. 注射器の助けを借りて、カテーテルを急速に膨らませます。
  5. 急激なMAP上昇(クッシング反射)、反射の欠如、両側性散瞳、および無呼吸を観察することにより、脳死を確認します。確認後、麻酔を中止し、動物を360分間人工呼吸器にかけます。
  6. 低体温症を避けるために、近くに熱源を置きます。
  7. プロトコルの最後に、TLCで肺ブロックを採取して収集し、液体窒素で瞬間凍結するか、固定溶液に入れてさらに研究します。
    注:小動物用人工呼吸器の助けを借りて、プロトコル中に換気パラメータにアクセスできます。本研究では、BD導入の直前(ベースライン)と360分後(最終)にこれらのパラメータを評価しました。

結果

平均動脈圧(MAP)
BDおよびHSの血行動態の影響を決定するために、MAPをプロトコルの360分間にわたって評価しました。ベースライン測定値は、BDまたはHSに曝露された動物の皮膚除去および頭蓋骨掘削後、および血液アリコート採取前にそれぞれ収集されました。BDおよびHS導入前は、2群のベースラインMAPは類似していた(BD:110.5 ± 6.1 vs. HS:105.8 ± 2.3 mmHg;p=0.5;二元配置分散分析)。カテ...

ディスカッション

近年、脳死の診断数の増加により、移植を目的とした臓器や組織の最大のプロバイダーになりました。しかし、この成長は、循環器死後の寄付の信じられないほどの増加を伴っています。その多因子的な性質にもかかわらず、死因の引き金となるメカニズムのほとんどは、血含有量の広範な喪失を伴う外傷の後に始まるか、またはそれに伴う4,18。<...

開示事項

私たちは、この出版物に関連する既知の利益相反がないこと、およびこの研究の結果に影響を与えた可能性のあるこの研究に対する重要な財政的支援がないことを確認したいと思います。

謝辞

資金援助をしてくれたFAPESP(Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo)に感謝します。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
14-gauge angiocathDB38186714Orotracheal intubation
2.0-silkBrasutureAA553Tracheal tube fixation
24-gauge angiocathDB38181214Arterial and venous access
4.0-silkBrasutureAA551Fixation of arterial and venous cannulas
Alcoholic chlorhexidine digluconate solution (2%).Vic PharmaY/NAsepsis
Trichotomy apparatusOsterY/NClipping device
Precision balanceShimadzuD314800051Analysis of the wet/dry weight ratio
Barbiturate (Thiopental)Cristália18080003DC induction
Balloon catheter (Fogarty-4F)Edwards Life Since120804BD induction
Neonatal extenderEmbramed497267Used as catheters with the aid of the 24 G angiocath
FlexiVentScireq1142254Analysis of ventilatory parameters
HeparinBlau Farmaceutica SA7000982-06Anticoagulant
IsofluraneCristália10,29,80,130Inhalation anesthesia
Micropipette (1000 µL)Eppendorf347765ZHandling of small- volume liquids
Micropipette (20 µL)EppendorfH19385FHandling of small- volume liquids
MicroscopeZeiss1601004545Assistance in the visualization of structures for the surgical procedure
Multiparameter monitorDixtal101503775MAP registration
Motorized drillMidetronicMCA0439Used to drill a 1 mm caliber borehole
Neubauer chamberKasviD15-BLCell count
Pediatric laryngoscopeOxygelY/NAssistance during tracheal intubation
Syringe (3 mL)SR3330N4Hydration and exsanguination during HS protocol
Pressure transducerEdwards Life SinceP23XLMAP registration
Metallic tracheal tubeBiomedical006316/12Rigid cannula for analysis with the FlexiVent ventilator
Isoflurane vaporizerHarvard Bioscience1,02,698Anesthesia system
Mechanical ventilator for small animals (683)Harvard ApparatusMA1 55-0000Mechanical ventilation
xMap methodologyMilliporeRECYTMAG-65K-04Analysis of inflammatory markers

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