海綿体神経損傷ラットモデルにおける海綿体内圧記録

要約

このプロトコルは、勃起不全および海綿体内圧力測定に関連する根治的前立腺全摘除術の安定した両側海綿状神経損傷ラットモデルの開発について説明しています。

要約

両側海綿状神経(CN)損傷ラットモデルは、臨床治療法の効果を評価するための勃起不全(ED)に関連する臨床海綿状神経損傷をシミュレートするために広く使用されています。しかし、ED研究分野では、CN損傷モデルの構築方法に欠陥があり、さまざまです。近年最も一般的に使用されている方法はCNクラッシュ傷害です。この研究は、両側 CN 損傷ラット モデルの構築手順と海綿体内圧 (ICP) 記録の測定の手順の詳細な説明を提供することを目的としています。この研究により、シリンジ針をハードサポートとして使用し、止血針をゴムスリーブで固定した止血剤を用いた止血圧潰傷害のCN傷害法の開発に成功しました。また、この方法では、電圧 1.0 V、周波数 20 Hz、パルス幅 5 ms が、両側 CN 損傷ラット モデルでの ICP 記録に最適化された刺激パラメーターであると結論付けています。

概要

EDは、成人男性によく見られる病気の一つです。世界のED患者数は、2025年までに3億2,200万人に達すると推定され^ています1。中国で行われたある多施設共同の広範なサンプル調査では、骨盤手術や外傷によって引き起こされるEDの割合は約^8%であることが示されています2。手術技術や手術器具の継続的な改善にもかかわらず、EDの発生率は依然として高いです。神経温存根治的前立腺全摘除術(RP)後のEDの発症と進行は、海綿体平滑筋の萎縮、内皮細胞のアポトーシス、病理学的リモデリングをもたらす海綿状神経損傷の一因となると考えられています^3,4。

EDに関連するCN損傷の血行動態および組織病理学的変化のメカニズムを研究するために、げっ歯類、イヌ、ネコ、サル^5,6,7を含むいくつかの異なるタイプのCN損傷動物モデルが開発および評価されています。費用と再現性の利点に依存して、両側CN損傷ラットモデルは、根治的骨^盤手術8後のEDを評価するための最も一般的なモデルになっています。しかし、さまざまな形態の神経損傷が多数の文献で報告されており、その主な違いは神経損傷アプローチ(圧迫、凍結、切断、および切除)^9,10,11です。さらに、神経損傷アプローチの多様性は、ラットモデルにおける海綿体内圧(ICP)記録パラメータに一貫性のなさをもたらす可能性があり、それが^ICP8の精度と評価を決定します。それにもかかわらず、モデルの神経損傷を誘発し、ICPを記録するための標準化された方法はまだありません。

したがって、この研究は、より信頼性が高く再現性のある両側性CN損傷ラットモデルを構築することを目的としています。この手法は、モデル構築とICP測定の手順を詳細に説明しており、将来的にEDのメカニズムを研究し、効果的な治療法を開発するのに役立つ可能性があります。

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プロトコル

この研究では、体重300〜350 gの15匹の成体雄Sprague-Dawleyラット(生後3か月)を使用しました。すべての動物処置は、NIHの実験動物の世話と使用に関するガイドラインに従って、中山大学動物管理委員会第5関連病院の承認を得て行われました。動物は、温度と光が制御された快適な施設に収容されました。

1.外科手術用材料の準備

1. 次の器具を準備します:メス、ティッシュハサミ、スレッドハサミ、曲げ鉗子、組織鉗子、マイクロサージェリー鉗子、ハートマン蚊止血鉗子、滅菌手術用シート、マイクロニードルホルダー、ラット腹部リトラクター、および生物学的信号取得および処理システム( 材料の表を参照)。
   1. 手術前にすべての手術器具を滅菌してください。アルコール(70%エタノール)ワイプを使用して手術部位を清掃します。
      注:手術器具は、アルコール浸漬によって一晩滅菌する必要があります。
2. 圧力記録システムを準備します
   1. ヘパリン生理食塩水が入った10mLシリンジと皮下注射針25Gをチューブ付き3方向ストップコック(長さ20cm)に接続します。滅菌したチューブを滅菌ヘパリン生理食塩水(200 U / mL)で洗い流します。
      注:チューブにヘパリン生理食塩水を充填すると、システムへの気泡の導入を回避できます。
3. 25Gの針を動物の手術パッドから20cm(チューブの長さだけ)持ち上げます。次に、フラッシングまたはタッピングによって圧力記録システムの測定精度を調べます。

2.動物の準備

1. ペントバルビタールナトリウム(60 mg / kg)腹腔内注射によりラットに麻酔をかけます( 材料の表を参照)。.
   注:麻酔の十分な深さを確認するために、自発呼吸リズムの評価とラットの後足をつまむ ことによる 反射の評価が行われました。
2. 角膜の乾燥を避けるために、両側の目に軟膏を塗ります。
3. 適切な麻酔がかかっていることを確認した後、電気シェーバーを使用して腹部、首、会陰の下半分を剃ります。ラットを仰臥位にして、加熱パッド(37°C)に置きます。外科手術中は無菌状態を維持するために、医療用手袋を着用してください。

3. CN分離と傷害の手順

1. メスを使用して、腹部の正中線下部の皮膚に4cmの切開を行います。膀胱と前立腺を完全に露出させるには、組織ハサミと組織鉗子を使用して、皮下筋膜、筋肉組織、腹膜を適切な長さで切開します。
2. ラット腹部リトラクターを使用して、手術フィールドマップを拡大します。吸収性の綿棒を使用して、靭帯などの隣接する組織から前立腺を分離します。
   注:大骨盤神経節(MPG)とCNは、前立腺の2つの背外側領域のいずれかに見られます。
3. 角度のついたマイクロハサミを使用して、MPGから遠位のCN1〜6mm上にある筋膜を切開します。次に、マイクロサージェリー鉗子を使用して、9-0縫合糸をCNの下にスライドさせます。
4. シリンジ針(25 G)をCNの下、MPGから5 mm遠位に置きます。.次に、止血剤を「止血剤チップ-シリンジ-針-神経-止血剤チップ」サンドイッチ構造(図1 および 図2)に照らして置きます。
   注意: シリンジの針は平らに研磨する必要があります。
5. 神経節から遠位5 mmのところで先端を完全に閉じた状態で止血器を1分間適用し、次に止血器とシリンジ針を引き抜きます(図2)。
6. 9-0縫合 糸を介して 神経をわずかに持ち上げ、バイポーラ電極のフック( 材料の表を参照)をMPGから遠位のCN2-4mmの周りに配置します(図3)。
   注:2組のMPGとCNは同じように操作しました。

4. ICP測定のための海綿体カテーテル法とCNの刺激

1. チューブを滅菌ヘパリン生理食塩水(200 U / mL)で洗い流してから、海綿体に導入します。
2. 25 Gの針を保持し、挿入方向を海綿体のコースと平行に保ちます(図3)。
   注:挿入を容易にするために、チュニカアルブギネアを伸ばす必要があります。
3. 25 Gの針を海綿体に6 mm押し込みます(図3)。チューブを洗い流し、海綿体を軽く押して、トランスデューサーの感度を評価します(図4)。偶発的な落下を防ぐために、パイプを粘着テープで作業台に固定します。
4. CN刺激には、1.0 Vの電圧、20 Hzの周波数、5 msのパルス幅のパラメータを使用します。1分間の刺激を加え、その後の刺激の間に5分間の休憩を挟みます。
   注意: 測定を開始するときは、3方向ストップコックを圧力トランスデューサーチャネルに回します。

5. 術後ケア

1. ラットを温めたパッド(37°C)に置き、麻酔の回復を注意深く監視します。
2. 術後の疼痛管理のために、ラットが完全に回復したら、非ステロイド性抗炎症薬(カルプロフェン、0.5 mg / kg、皮下注射など)( 材料の表を参照)を提供します。.
3. ラットを無菌ケージに移し、切開創の栄養状態、精神状態、および感染を評価するために2日間監視します。

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結果

手術手順では、推奨される刺激設定でこのプロトコルを使用して、典型的なICP反応曲線が生成されました。ICPの応答曲線は、神経を刺激すると即座に上昇し、刺激が引き出されると低下します(図5)。ICPを測定する前に海綿体内圧力線を調べることが不可欠であり、これはICP値の増加の評価に影響を与えます(図4)。

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ディスカッション

EDは、骨盤の手術や外傷の重篤な合併症です。神経温存手術を受けていますが、根治的前立腺全摘除術(RP)でEDの発生率は約14〜90%です¹²。損傷CNの問題のある再生のために、臨床的治療効果は満足のいくものではありません。したがって、EDの治療を探求するための安定したCN損傷動物モデルが不可欠です。Quinlanらは、RP関連EDの研究のためにCN損傷ラ?...

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資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
25 G needle	BD Bioscience	367391
Abdominal retractor	RWD Life Science	R22009-01
Animal operating pad	Provided by Guangdong Provincial Key Laboratory of Biomedical Imaging	NA
Bending forceps	RWD Life Science	F12011-10
Biological signal acquisition and processing system	Techman Software	BL-420S
Bipolar electrode	Techman Software	AC0047
Carprofen	Sigma-Aldrich	MFCD00079028
HARTMAN mosquito hemostatic forceps	RWD Life Science	F22002-10
Heparin	Shanghai Aladdin Biochemical Technology	2608411
Micro needle holder	RWD Life Science	F31047-12
Microsurgery forceps	RWD Life Science	F11001-11
Scalpel	RWD Life Science	S32003-12
Sodium pentobarbital	Guangdong Provincial Key Laboratory of Biomedical Imaging	NA
Sprague–Dawley rat	Guangdong Medical Laboratory Animal Center	GDMLAC-035
Thread scissors	RWD Life Science	S15001-11
Tissue forceps	RWD Life Science	F13019-12
Tissue scissors	RWD Life Science	S13029-14