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要約

このプロトコルは、小さなAAV産生、ビトリアル内注射、遺伝子画像化、および遺伝子ゲノムDNA分離と共に、デジタル液滴PCR(dd-PCR)を用いてマウスの遺伝子のAAVトランスダクション効率を定量化する方法を示しています。

要約

多くのレチナル細胞生物学研究所は現在、遺伝子編集や規制アプリケーションのためにアデノ関連ウイルス(AAV)を日常的に使用しています。AAVの伝達の効率は、通常、全体的な実験結果に影響を与える重要です。トランスダクション効率の主な決定要因の1つは、AAVベクターの血清型または変異体です。 現在、様々な人工AAV血清型および変異体は、細胞表面受容体をホストするために異なる親和性を有して利用可能である。遺伝子の遺伝子治療では、異なるレチナル細胞タイプに対して様々な程度の伝達効率が得られます。また、AAV産生の噴射経路および品質も、AAVの変換効率に影響を与える可能性があります。したがって、さまざまなバリアント、バッチ、および方法論の効率を比較することが不可欠です。デジタル液滴PCR(dd-PCR)法は、核酸を高精度に定量化し、標準や基準を使用せずに特定のターゲットの絶対定量を行うことができます。dd-PCRを用いて、注入されたレチナ内のAAVゲノムコピー数を絶対定量化することにより、AAVのトランスダクション効率を評価することも可能です。ここでは、dd-PCRを用いて、レチナル細胞内のAAVのトランスダクション率を定量化する簡単な方法を提供します。マイナーな改変により、この方法論は、ミトコンドリアDNAのコピー数定量化の基礎となり、いくつかの疾患および遺伝子治療用途に不可欠なベース編集の効率を評価する基礎となる可能性もあります。

概要

アデノ関連ウイルス(AAV)は現在、様々な遺伝子治療研究に一般的に使用されています。AAVは、より少ない免疫原性と少ないゲノム統合で、安全で効率的な遺伝子導入方法を提供します。標的細胞へのAAVの侵入はエンドサイトーシスを介して起こり、細胞表面1,2上の受容体および共受容体の結合を必要とする。したがって、異なる細胞タイプに対するAAVのトランスダクション効率は、主にキャプシドおよびその宿主細胞受容体との相互作用に依存する。AAVには血清型があり、各血清型は、明確な細胞/組織の栄養と伝達効率を持つことができます。また、ウイルスキャプシドの化学修飾によって生成される人工AAV血清型および変異体、ハイブリッドキャプシドの産生、ペプチド挿入、キャプシドシャッフル、指向進化、および合理的突然変異誘発3もある。アミノ酸配列やカプシド構造のわずかな変化でさえ、宿主細胞因子との相互作用に影響を及ぼし、異なる栄養価を有する。カプシド変異体に加えて、AAV産生の注入経路およびバッチ間変動のような他の要因は、神経性レチナにおけるAAVの導入効率に影響を与える可能性がある。したがって、異なるバリアントのトランスダクション率の比較のための信頼性の高い方法が必要です。

AAVの導入効率を決定する方法の大部分は、レポーター遺伝子発現に依存する。これらには、蛍光イメージング、免疫染色化学、ウェスタンブロット、またはレポーター遺伝子産物5、6、7の構造化学的分析が含まれる。しかし、AAVのサイズ制約により、伝達効率を監視するレポーター遺伝子を含めることが必ずしも可能であるとは限りません。ハイブリッドCMVエンハンサー/チキンβ-アクチンまたはウッドチャック肝炎転写後調節要素(WPRE)のような強力なプロモーターをmRNA安定剤配列として用い、サイズ問題8をさらに複雑にする。したがって、より直接的な方法論で注入されたAAVのトランスダクション率を定義することも有益です。

デジタル液滴PCR(dd-PCR)は、微量のサンプルからターゲットDNAを定量化する強力な手法です。dd-PCR技術は、油滴による標的DNAおよびPCR反応混合物の封入に依存する。各dd-PCR反応には、数千個の液滴が含まれています。各液滴は、独立したPCR反応9として処理され、分析される。液滴の解析により、ポアソンアルゴリズムを使用するだけで、任意のサンプル中の標的DNA分子の絶対コピー数を計算できます。AAVのトランスダクション効率は神経筋のAAVゲノムのコピー数と相関しているため、Dd-PCR法を用いてAAVゲノムを定量化しました。

ここでは、遺伝子組換えDNA6,10からAAVベクターの導入効率を算出するdd-PCR方法論について説明する。まず、tdTomatoレポーターを発現するAAVを小規模プロトコルを用いて生成し、dd-PCR法11で煮込んだ。第二に、AAVは本当に神経細胞のretinaに注入された。トランスダクション効率を実証するために、まず蛍光顕微鏡とImageJソフトウェアを用いてtdTomato発現を定量化しました。その後、dd-PCRを用いて注入されたレティナにおけるAAVゲノムの定量化のためのゲノムDNAの単離が行われた。tdTomato発現量とdd-PCRによって定量されたトランスタイズされたAAVゲノムとの比較は、dd-PCR法がAAVベクターのトランスダクション効率を正確に定量することを示した。当社のプロトコルは、AAVの変換効率を定量化するためのdd-PCRベースの方法論の詳細な説明を示しました。本プロトコルでは、ゲノムDNA単離後の希釈因子とdd-PCR結果を用いて、細胞内注射後にトランスデュージされるAAVゲノムの絶対数も示す。全体として、このプロトコルは、レチナにおけるAAVベクターの伝達効率を定量化するレポーター式に代わる強力な方法を提供する。

プロトコル

すべての実験議定書はサバンチ大学倫理委員会によって受け入れられ、実験は、動物の研究における使用に関する「視覚・眼科研究協会」の声明に従って行われた。

1. 小規模AAV生産12

  1. 培養 HEK293T細胞は、70-80%の合流までDMEM/ 10%FBSの完全な10 mLで15 cmのプレートを使用した。
  2. トランスフェクション混合物をヘルパープラスミド(pHGT1-Adeno1)20 μg、カプシドプラスミド7 μg、AAV2-CBA-tdTomato-WPREPRE 7 μg、PEI溶液(1 mg/mL)の136 μLを5mLのDMEMで調製します。
  3. 5 mLのトランスフェクション混合物を10 mLの培養培地を含む細胞培養皿に加え、37°Cで48〜60時間トランスフェクトされた細胞をインキュベートする。
  4. トランスフェクション後48-60時間でメディアを収集し、37°Cで30分間の250 U/mLの最終濃度でDNase Iで消化します。
  5. 消化した培地を4000 x gで遠心し、4 °Cで30分間、0.22 μmのシリンジフィルターで100kDaの予め湿った再生セルロース膜にフィルターします。
  6. 再生セルロース膜を4000xgで遠心し、4°Cで30分間、培地を廃棄します。
  7. 再生セルロース膜を4000xgで3回、4°Cで30分間、0.001%プルロン酸F-68を含むPBSで再生セルロース膜を洗浄し、遠心分離します。各ステップで PBS を破棄します。
  8. 再生セルロース膜の上部から濃縮されたAAVを収集し、さらに使用するためにアリコート。
  9. DNase I(0.2U/μl)で作りたてのAAVを5μL消化し、37°Cで15分間、37°Cで刺激します。これは、DNase Iを不活性化し、ウイルスキャプシドを分解する両方の95°Cインキュベーションで10分が続きます。
  10. 0.05%Pluronic F-68を使用して、消化されたAAVから10倍のシリアル希釈を準備します。滴定に AAV2-ITR および WPRE プライマーを使用する (表 1)。この価子は、希釈因子を用いてdd-PCR結果を乗算して算出した。結果はゲノムコピー/mL(GC/mL)に変換された。
    注:小規模AAV生産のAAV濃度は約1 x 1012 GC/mLになると予想されています。このプロトコルは、AAV13のようなメディアに AAV を効率的に放出しない AAV 株には適用されません。

2. AAVの内膜注射

  1. 機器の準備
    1. 開始する前に、36 Gの鈍い針で10 μLのマイクロシリンジを準備してください。70%のEtOHで5回、ddH2Oで5回、PBSで最後に5回リンスします。
    2. 適切な量のAAVをマイクロシリンジに注入するごとにロードします。
    3. 手術用針(縫合糸、絹、6/0)、テープ、鉗子、はさみを準備します。
  2. ビトリア内注射
    1. 0.5%のトロピックアミドと2.5%のフェニレフリン塩酸塩(例えば、Mydfrin)の1滴を適用し、瞳孔を拡張するために麻酔前の眼球低下を含む。
    2. イオブルラン5%(1 L/分)でマウスを麻酔し、処置中に1.5%のイオブルラン(1 L/分)を継続する。小さなイオブルランチャンバーは、最初の誘導のために使用されます。
    3. 右反射の喪失、離脱反射、尾ピンチ応答により麻酔の深さを確認します。
    4. 注射手順の前に、各眼に0.3%トブラマイシンおよび0.1%デキサメタゾン滅菌眼液を塗布する。目の滴の適用は乾燥を防ぎ、抗炎症および抗菌効果を発揮する。
    5. 上まぶたを安定させるために外科用フックを使用してください。わずかに引き戻して、目の背側部分を露出させます。フックをベンチにテープで貼り付け、位置に保持します。
    6. 角張った虹彩はさみで結膜(1mm2未満)を取り除き、解剖顕微鏡下で眼の膜を露出させます。新鮮で無菌のインスリン注射器(30G)を使用して、スクレラを穿刺する。
    7. マイクロマニピュレーターを使用して、同じ穿刺を通してマイクロシリンジの針を挿入します。針の先端をレンズの後ろに置き、眼の中央に置きます。
    8. AAV2/BP2 および AAV2/PHP を 1 μL注入します。1.63 x 1012 GC/mLおよび1.7 x 1012 GC/mL濃度を有するSベクターは眼の膜内にゆっくりと入る。射出量制御は手動で行われます。針を1分間所定の位置に置いておき、針をゆっくりと引き出します。
    9. まぶたを放出し、0.3%のトブラマイシンと0.1%デキサメタゾンを含む抗炎症および抗菌局所ゲル処理を眼球に適用する。見た目(明るい目、手入れコート、ハンチ)、行動(活性、固定化、自己突然変異)、体重を0〜3のスケールでスコアシートに従って、次の日にマウスを監視および評価する。各条件には0-3のスコアがあり、合計スコアは3以上が終了基準です。
    10. 回復後、動物をケージに入れます。

3. 蛍光と眼炎イメージング

  1. マウスをひずみ、0.5%のトロピックアミドと2.5%のフェニレフリン塩酸塩を各眼に滴下して瞳孔を拡張する。
  2. イオフルランで上記の手順で動物を麻酔します。足をつまんで麻酔の深さを慎重に評価します。
  3. 画像処理段階にマウスを置き、眼管カメラを通してチェックして適切な拡張を確認します。局所ゲル(0.2%カルボマー980)を眼の表面に塗布して、麻酔下での脱水から目を保護し、イメージング用のカップリングゲルとして使用します。
  4. イメージングステージを操作して、目的の鼻と並ぶ。マウスの目を中央に配置するために必要に応じてステージを調整します。目を中央に配置したら、目と接触するまでゆっくりと目的を動かします。
  5. 両眼に眼深および蛍光イメージングを行い、細胞内注射後1週間及び2週間でtdTomato発現をフォローアップする(図3B)14。レポーター表現の比較のために同じ設定で眼科画像と蛍光画像を撮ります。

4. レティナの分離

  1. 2週間時点でのRETINA回収のためのCO2 吸入による眼深および蛍光イメージング後の動物を安楽死させる。
  2. 13.5 cmのスプリッタ鉗子の助けを借りて眼球を前方にシフトします。
  3. 鉗子で穏やかな圧力をかけることによって残りのガラス膜と一緒にレンズを取り外す。
  4. 精密湾曲した鉗子で眼球と視神経の接続を切断し、同じ湾曲した鉗子で静かに眼球を絞ります。
  5. 解剖されたレチナをマイクロ遠心分離チューブに移します。
  6. 液体窒素にチューブを入れることによって、凍結のレチナをスナップします。

5. 組織ゲノムDNAの分離

  1. ゲノムDNAを、製品化したプロテイン酵素K消化ベースの組織ゲノムDNAキットで分離します。
  2. 55°Cでレティナを消化し、200 x g で30分間、すでにキットに供給されているプロテナーゼKを使用します。
  3. RNaseインキュベーションステップ、洗浄バッファーIおよびIIで洗浄ステップ、および最終的にメーカーのプロトコルに従って溶出ステップを行います。
  4. 最後の洗浄後に余分なスピンステップを追加して、残留エタノールを除去します。
  5. ゲノムDNAの濃度を測定し、サンプルを-20°Cで保存します。

6. ウイルスゲノムの定量のためのマウスのレチナサンプルの液滴デジタルPCR解析

  1. 0.05%Pluronic F-68溶液に注入されたレチナからゲノムのDNAを希釈し、各サンプルに対して1 ng/μLの最終濃度に達した。
  2. 各プライマーに対して125 nMの最終濃度のターゲット特定プライマーを使用して、WPREと18Sに対して別々の反応を行います。
  3. 1 ngのゲノムDNA、125 nMプライマー、2xエバグリーンスーパーミックスを含む20 μLのPCR反応ミックスで液滴生成を行います。
  4. 液滴生成のために、カートリッジの中央部にサンプルミックスをロードします。
  5. カートリッジへのサンプルローディングが完了したら、70 μLの液滴生成油をカートリッジの下段に追加します。
  6. ガスケットをカートリッジの上に置き、液滴発生器に入れます。ガスケットとカートリッジの間に隙間がないことを確認します。
  7. 上のウェルで生成された液滴の約40 μLを静かに取ります。半スカートの96ウェルPCR反応プレートに液滴溶液を加えます。
  8. PCR プレートを、アルミ製シールホイルを使用してシーラー PCR でシールします。
  9. PCR プレートを 96 ウェルヒートシールサーマルサイクラーに入れます。PCR プロトコルを使用します。95°C、30秒で95°Cの40サイクル、1分間60°C、5分間4°C、5分間90°C、4°C、4°Cの無限保持。各サイクルで2°C/sランプレートを適用して、サイクル中に各ステップの正しい温度に到達するように液滴を確保
  10. PCR プレートを液滴リーダーに配置し、dd-PCR ソフトウェアを使用して液滴を定量化します。テンプレートは、evagreen の特定の設定を使用して設定されます。
  11. 蛍光強度対液滴数の各標本を用いた1次元プロットグラフを使用してデータを分析します。しきい値は、しきい値を超える液滴が正のもの、下の液滴が負のものとして割り当てられるように配置されます。その後、ポアソンアルゴリズムを適用して、コピー/μL単位でターゲットDNAの開始濃度を決定します。WPRE対18Sの比は、AAVトランスダクション効率を測定するために計算されます。

結果

小規模な AAV の生産は、迅速かつ効率的な方法で、ビトリアル内注射用のベクターを提供します (図 1)。小規模なAAV生産は、通常、1 x 1012 GC/mlの範囲内の方位を与え、これはレティナにおけるレポーター発現を検出するのに十分である(図2)。dd-PCR を使用した AAV のタンターは、一貫した結果を与えます。ITR2およびWPRE固有のプライマーは日常...

ディスカッション

このプロトコルでは、異なるキャプシドタンパク質を有する2つのAAVベクターを生成し、それに応じてそれらをtiteredした。このプロトコルの最も重要なステップの1つは、トランスダクション12,13の後に検出可能なレポーター式をもたらす十分な量のAAVを生成することです。

AAV の titering も、AAV の投与量を調整する重要な要因で?...

開示事項

著者らは開示するものは何もない。

謝辞

Oezkan Keles、ジョセフィーヌ・ユットナー、ボトンド・ロスカ教授(分子・臨床眼科バーゼル研究所)のAAV生産に対する支援と支援に感謝します。また、AAV8/BP2株に関しては、ペンシルベニア大学ペレルマン医学部のジーン・ベネット教授にも感謝したいと思います。ゲブゼ工科大学の動物施設で動物の作業を行います。そのために、レイラ・ディクメタスとウイガー・ハリス・タゼベイ教授に、動物の畜産に対する技術支援と支援に感謝します。また、ファトマ・オズデミール博士の原稿に対するコメントに感謝したいと思います。この作業は、TUBITAK、補助金番号118C226と121N275、およびサバンチ大学統合助成金によってサポートされています。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
96-Well Semi-Skirted ddPCR platesBioRad12001925ddPCR
Amicon FilterMilliporeUFC910096AAV
C1000 TOUCH 96 DEEP WELLSBioRad1851197ddPCR
C57BL/6JRj mice strainJanvierC57BL/6JRjMice
DG8 gasketsBioRad1863009ddPCR
DG8 CartridgesBioRad1864008ddPCR
DMEMLonzaBE12-604QAAV
DPBSPAN BIOTECHL 1825AAV
Droplet generation oil eva greenBioRad1864006ddPCR
Droplet reader oilBioRad1863004ddPCR
FBSPAN BIOTECHp30-3306AAV
Foil seals for PX1 PCR Plate sealerBioRad1814040ddPCR
Insulin SyringesBD Medical320933Intravitreal injection
IsofluraneADEKA ILAC SANAYI VE TICARETN01AB06anesthetic
Microinjector MM33World Precision Instruments82-42-101-0000Intravitreal injection
Micron IVPhoenix Research LabsMicron IVMicroscopy system based on 3-CCD color camera, frame grabber, and off-the-shelf software enables researchers to image mouse retinas.
Mydfrin (%2.5 phenylephrine hydrochloride)AlconS01FB01pupil dilation
Nanofil Syringe 10 μlWorld Precision InstrumentsNANOFILIntravitreal injection
Needle RN G36, 25 mm, PST 2World Precision InstrumentsNF36BL-2Intravitreal injection
PEI-MAXPolyscience24765-1AAV
Penicillin-StreptomycinPAN BIOTECHP06-07100AAV
Plasmid pHGT1-Adeno1PlasmidFactoryPF1236AAV
Pluronic F-68Gibco24040032AAV
PX1 PCR Plate Sealer systemBioRad1814000ddPCR
QX200 ddPCR EvaGreen SupermixBioRad1864034ddPCR
QX200 Droplet Reader/QX200 Droplet GeneratorBioRad1864001ddPCR
SPLITTER FORCEP WATCHER
MAKER - LENGTH = 13.5 CM		endostall medicalEJN-160-0155Retina isolation
Steril Syringe FilterAISIMOASF33PS22SAAV
Tissue Genomic DNA KitEcoSpinE1070gDNA isolation
Tobradex (0.3% tobramycin / 0.1% dexamethasone)AlconS01CA01anti-inflammatory / antibiotic
Tropamid (% 0.5 tropicamide)Bilim Ilac Sanayi ve Ticaret AS.S01FA06pupil dilation
TurbonucleaseAccelagenN0103LAAV
Viscotears (carbomer 2 mg/g)Bausch+LombS01XA20lubricant eye drop

参考文献

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