真核生物グリコーゲン代謝研究のための吸光光度法

要約

可視域で動作する単純な分光光度計を使用して、グリコーゲン代謝の重要な酵素の活性を測定する技術が提示されます。

要約

グリコーゲンは、細菌から動物に至るまで、さまざまな生物によってグルコースの貯蔵形態として合成されます。この分子は、α1,6結合の付加によって導入された分岐を有するα1,4結合グルコース残基の直鎖を含む。グリコーゲンの合成と分解がどのように制御され、グリコーゲンがその特徴的な分岐構造をどのように達成するかを理解するには、グリコーゲン貯蔵の酵素の研究が必要です。しかしながら、これらの酵素活性を研究するために最も一般的に使用される方法は、典型的には、すべての研究者が利用できるわけではない試薬または技術を使用する。ここでは、技術的に単純で費用効果が高く、それでもグリコーゲン貯蔵の制御に関する貴重な洞察を提供できる一連の手順について説明します。この技術は、330〜800nmの範囲で動作する分光光度計へのアクセスを必要とし、ユーザーが使い捨てのプラスチックキュベットを使用することを想定して説明されています。ただし、手順は容易に拡張でき、マイクロプレートリーダーで使用するために変更できるため、高度な並列分析が可能です。

概要

グリコーゲンは自然界に広く分布しており、化合物は細菌、多くの原生生物、真菌、および動物に含まれています。微生物では、栄養素が制限されている場合、グリコーゲンは細胞の生存に重要であり、哺乳類などの高等生物では、グリコーゲンの合成と分解が血糖値を緩衝するのに役立ちます^1,2,3。したがって、グリコーゲン代謝の研究は、微生物学や哺乳類生理学などの多様な分野にとって重要です。グリコーゲン代謝を理解するには、グリコーゲン合成(グリコーゲン合成酵素と分岐酵素)とグリコーゲン分解(グリコーゲンホスホリラーゼと枝切り酵素)の重要な酵素を研究する必要があります。グリコーゲン合成酵素、ホスホリラーゼ、分岐、および枝切り酵素活性のゴールドスタンダードアッセイは、放射性同位元素を使用します。例えば、グリコーゲンシンターゼは一般に、UDP-[14C]グルコース(動物および真菌酵素の場合)またはADP-[^14C]グルコース(細菌酵素の場合)からのグルコースのグリコーゲン^4,5への取り込みに続いて、停止した放射化学的アッセイで測定される。同様に、グリコーゲンホスホリラーゼは、[^14C]グルコース-1-リン酸からグリコーゲン⁶へのグルコースの取り込みに続いて、グリコーゲン合成の方向に測定されます。枝切り酵素は、グリコーゲンホスホリラーゼ⁷によってグルコース-1-リン酸からα1,4結合鎖への[14C]グルコースの取り込みを刺激するこの酵素の能力を測定することによってアッセイされ、枝切り酵素活性は、グリコーゲン⁸に[^14C]グルコースを取り込む酵素の能力に従うことによって決定されます。.放射性基質は非常に感度が高く、酵素活性の低い粗細胞抽出物に使用できますが、高価であり、放射性同位元素の使用に伴う規制要件の対象となります。これらの障壁により、特定のアッセイの使用は多くの労働者の手の届かないところにあります。しかしながら、長年にわたって、これらの酵素の測定に対する印象的な様々な分光光度法が記載されている。一般に、これらのアプローチは、最終的にはNADH / NADPHの生成または消費、またはグリコーゲンとヨウ素の間の着色錯体の生成の測定に依存しています。したがって、それらは単純であり、タングステンまたはキセノンフラッシュランプのみを備えた単純な分光光度計を使用して実行できます。

グリコーゲン合成酵素の分光光度アッセイは、グルコースが成長するグリコーゲン鎖に付加されるにつれて糖ヌクレオチド供与体から放出されるヌクレオシド二リン酸を測定することに依存し^{ている9,10}。以下のプロトコルのセクション1に記載されているグリコーゲンシンターゼ活性を測定する手順は、Wayllaceら¹¹によって概説されている手順の変更であり、カップリングスキームを以下に示します。

(グルコース)_n + UPD-グルコース → (グルコース)_n+1 + UDP

UDP + ATP → ADP + UTP

ADP + ホスホエノールピルビン酸 → ピルビン酸 + ATP

ピルビン酸 + NADH + H+ → 乳酸 + NAD⁺

グリコーゲン合成酵素は、UDP-グルコースからグリコーゲンにグルコースを付加します。この過程で生成したUDPは、ヌクレオシド二リン酸キナーゼ(NDPキナーゼ)によってUTPに変換され、ADPを生成する反応となる。次に、ADPはピルビン酸キナーゼの基質として機能し、ホスホエノールピルビン酸をリン酸供与体として使用してADPをリン酸化します。生成したピルビン酸は、NADHを消費する反応で酵素乳酸脱水素酵素によって乳酸に変換される。したがって、アッセイは、NADHが消費されるにつれて340nmでの吸光度の減少をモニタリングしながら、連続的に実施することができる。グルコース供与体としてADP-グルコースを必要とする酵素での使用に容易に適応します。ここでは、グリコーゲンシンターゼの作用によって放出されるADPがピルビン酸キナーゼによって直接作用されるため、カップリングステップはより単純です。

グリコーゲンホスホリラーゼ活性の測定に利用できるさまざまな分光光度アッセイがあります。古典的なバージョンでは、以下に示すように、酵素はグリコーゲン合成の方向に後方に駆動されます。

(グルコース)_n + グルコース-1-リン酸 → (グルコース)_n+1 +_{P i}

時限間隔で、反応混合物のアリコートを除去し、遊離したリン酸塩の量を定量化する^12,13。我々の手では、このアッセイは、ホスホリラーゼ作用に必要な高濃度のグルコース-1-リン酸と組み合わされた、グルコース-1-リン酸の多くの市販調製物中に容易に測定可能な遊離リン酸が存在するため、使用が制限されていた。むしろ、グリコーゲンがホスホリラーゼ¹³によって分解されるときに放出されるグルコース-1-リン酸を測定する代替アッセイを日常的に採用しています。以下に示す共役反応スキームが採用される。

(グルコース)n + P_i → (グルコース)_n-1 + グルコース-_1-リン酸

グルコース-1-リン酸 → グルコース-6-リン酸

グルコース-6-リン酸 + NADP+ → 6-ホスホグルコノラクトン + NADPH + H⁺

グルコース-1-リン酸はホスホグルコムターゼによってグルコース-6-リン酸に変換され、グルコース-6-リン酸は6-ホスホグルコノラクトンに酸化され、同時にNADP⁺がNADPHに還元されます。以下のプロトコルのセクション2に詳述されている手順は、Mendicino et al.14およびSchreiber & Bowling ¹⁵によって記述された方法に由来する。アッセイは、時間の経過とともに340nmでの吸光度が増加し、反応速度の決定を可能にする連続的に容易に実施することができる。

枝切り酵素活性の吸光光度測定は、ホスホリラーゼ限界デキストリン¹⁶に対する酵素の作用によって放出されるグルコースの測定に依存する。この化合物は、グリコーゲンホスホリラーゼでグリコーゲンを網羅的に処理することによって作られます。グリコーゲンホスホリラーゼ作用はα1,6-分岐点から4グルコース残基離れて停止するので、限界デキストリンにはグリコーゲンが含まれており、その外鎖は~4グルコース残基に短縮されています。ホスホリラーゼ限界デキストリンの調製は、Taylorら¹⁷ およびMakino & Omichi¹⁸によって開発されたものに由来する手順を用いて、本明細書に記載されている。

分岐解除は 2 段階のプロセスです。二官能性枝切り酵素の4-α-グルカノトランスフェラーゼ活性は、最初に3つのグルコース残基を分岐点から近くのα1,4結合グルコース鎖の非還元末端に転移する。分岐点に残っている単一のα1,6結合グルコース残基は、次いでα1,6-グルコシダーゼ活性¹⁹によって加水分解される。アッセイは通常、停止した方法で実行され、所与の時間(または一連の回)後に放出されるグルコースは、以下に示すように結合酵素アッセイで測定されます。

(グルコース)n → (グルコース)_n-1 + グルコース

グルコース + ATP → グルコース-6-リン酸 + ADP

グルコース-6-リン酸 + NADP+ → 6-ホスホグルコノラクトン + NADPH + H⁺

産生されるNADPHの測定は、グルコース産生の尺度を与える。以下のプロトコルのセクション3で概説されている手順は、Nelsonら¹⁶によって記述されたものに基づいています。NADH/NADPHの消費または生成に依存する他の方法と同様に、アッセイは非常に感度が高いです。ただし、ホスホリラーゼ限界デキストリンから遊離グルコースを遊離させる可能性のあるアミラーゼまたは他のグルコシダーゼの存在は、重大な干渉を引き起こします(ディスカッションを参照)。

分岐酵素活性の比色測定は、グルコースのα1,4結合鎖がヨウ素に結合するらせん構造を採用し、着色錯体を形成するという事実に依存しています²⁰。形成される複合体の色は、α1,4結合鎖の長さに依存する。したがって、α1,4結合グルコースの長くて大部分が分岐していない鎖からなるアミロースは、ヨウ素と濃い青色の複合体を形成します。対照的に、その外鎖が一般にわずか6〜8グルコース残基長のオーダーであるグリコーゲンは、橙赤色の複合体を形成する。アミロースの溶液を分岐酵素と共にインキュベートする場合、アミロースへの分岐の導入は、より短いα1,4結合グルコース鎖の生成をもたらす。したがって、アミロース/ヨウ素錯体の吸収極大はより短い波長にシフトします。ここで説明する手順は、Boyer & Preiss²¹ によって詳述されたものに由来し、分岐酵素活性は、時間の経過に伴う660nmでのアミロース/ヨウ素複合体の吸収の減少として定量化されます。

上記の議論からすぐに明らかなように、ヨウ素とα1,4-グルコース鎖の間に形成される錯体の色が鎖長によって変化するという事実は、グリコーゲン/ヨウ素複合体の吸光度スペクトルがグリコーゲン分岐の程度によって変化することを意味する。これは確かに事実であり、より分岐の少ないグリコーゲン/より長い外鎖を有するグリコーゲンは、より分岐している/より短い外鎖を有するグリコーゲンよりも長い波長の光を吸収する。したがって、ヨウ素染色反応を使用して、グリコーゲン分岐の程度に関する迅速で定性的なデータを得ることができます²²。ヨウ素とのグリコーゲン錯体が特に強くない場合、オレンジ - 茶色が形成されます。しかしながら、発色は、飽和塩化カルシウム溶液²²を含有させることによって増強することができる。これにより、メソッドの感度が約10倍になり、マイクログラム量のグリコーゲンをすぐに分析できます。下記のプロトコルのセクション4に記載される分岐の決定のためのアッセイは、Krisman²²によって開発された手順から適応される。グリコーゲンサンプルをキュベット内のヨウ素溶液および塩化カルシウムと組み合わせ、330nmから800nmの吸収スペクトルを収集するだけで実施できます。吸光度の最大値は、分岐の程度が減少するにつれて、より長い波長にシフトします。

まとめると、ここで説明する方法は、グリコーゲン代謝の重要な酵素の活性を評価し、グリコーゲン分岐の程度に関する定性的データを取得するための簡単で信頼性の高い手段を提供します。

プロトコル

1. グリコーゲン合成酵素活性の測定

1. 表1に示すように必要な試薬のストック溶液を調製する(実験日より前)。

コンポーネント	経路
50 mM トリス pH 8.0	0.61 g のトリス塩基を ~ 80 mL の水に溶解します。 4°Cに冷却します。  HClでpHを8.0に調整し、水で容量を100mLまで上げます。
20 mM HEPESバッファー	HEPES 0.477 g を ~ 80 mL の水に溶解します。 NaOHでpHを7.0に調整し、水で容量を100mLに補います。
132 mM トリス/32 mM KCl バッファー pH 7.8	1.94 g のトリス塩基と 0.239 g の KCl を~90 mL の水に溶解します。 HClでpHを7.8に調整し、水で容量を100mLに補います。
0.8% w/v カキグリコーゲン	80 mgのカキグリコーゲンを量り、水に加えます。 最終容量を水で最大10 mLにし、穏やかに温める/混合してグリコーゲンを完全に溶解します。
100 mM UDP-グルコース	0.31 gのUDP-グルコースを水に溶解し、最終容量を1 mLまでにします。 アリコートで保存し、-20°Cで凍結します。  数ヶ月間安定しています。
50 mM ATP	0.414 g の ATP を ~ 13 mL の水に溶解します。 NaOHでpHを7.5に調整し、水で容量を15mLに補います。 -20°Cで凍結したアリコートで保存します。  数ヶ月間安定しています。
100 mM グルコース-6-リン酸 pH 7.8	0.282 gのグルコース-6-リン酸を~7〜8 mLの水に溶解します。 NaOHでpHを7.8に調整します。 水で容量を10 mLまで作ります。 アリコートで-20°Cで冷凍保存します。  少なくとも6ヶ月間安定しています。
40 mM ホスホエノールピルビン酸	4 mgのホスホエノールピルビン酸を0.5 mLの20 mM HEPESバッファーpH 7.0に溶解します。 -20°Cで保存してください。  少なくとも1週間安定しています。
0.5 M マンガン2	9.90 gのMnCl2 を最終容量100 mLの水に溶解します。
NDPキナーゼ	凍結乾燥粉末を十分な水で再構成し、1 U/μl溶液を得る。 アリコートを調製し、液体窒素で凍結し、-80°Cで保存します。  少なくとも1年間安定しています。

表1:グリコーゲン合成酵素活性のアッセイに必要なストック溶液。

2. アッセイ当日、4.5 mgのNADHを1.5 mLの50 mM Tris-HCl、pH 8.0に溶解することにより、4 mM NADHの新しい作業溶液を調製します。光から保護された氷の上に保管してください。
3. UDP-グルコース、ATP、ホスホエノールピルビン酸、およびNDPキナーゼのストック溶液を氷上で解凍します。
4. 水浴を30°Cに予熱する。
5. 表2に列挙した反応混合物試薬を添加して、1.5 mLチューブに各グリコーゲンシンターゼアッセイをセットアップします。

コンポーネント	容量(μl)
160 mM トリス/32 mM KCl バッファー pH 7.8	250
水	179
100 mM グルコース-6-リン酸、pH 7.8	58
0.8 % w/v カキグリコーゲン	67
50 mM ATP	80
4 mM NADH	80
100 mM UDP-グルコース	28
40 mM ホスホエノールピルビン酸	20
0.5 M マンガン2	8
最終巻	770

表2:グリコーゲンシンターゼ活性のアッセイのための組成物反応混合物。

注:セットアップを容易にするために、計画されたアッセイの数を完了するのに十分な数の上記の各試薬を含むマスターミックスを作成できます。

6. 上記の混合物中のNADHを水で置き換える空反応を準備する。使い捨てメタクリレートキュベットに移し、これを使用して分光光度計のゼロを340nmに設定します。
7. 反応混合物のアリコート770 μLを1.5 mLチューブに入れます。2 μLのNDPキナーゼと2 μLのピルビン酸キナーゼ/乳酸デヒドロゲナーゼ混合物を加え、穏やかに混合し、30°Cで3分間インキュベートして反応混合物を予熱します。
8. グリコーゲンシンターゼを含むサンプル30 μLを20 mMトリス緩衝液、pH 7.8に加えます。混合し、反応混合物を使い捨てメタクリレートキュベットに移します。
9. キュベットを分光光度計に入れ、340 nmの吸光度を10〜20分間の時間間隔で記録します。得られた吸光度を時間に対してプロットします。
   注:NADHの非酵素的酸化を制御するために、グリコーゲン合成酵素サンプルを20 mMトリスバッファーで置換する反応を実施する必要があります。サンプルの純度によっては、他のコントロール反応が必要になる場合があります。詳細については、「ディスカッション」を参照してください。
10. 反応速度を決定します(詳細については 結果 を参照)。

2. グリコーゲンホスホリラーゼ活性の測定

1. 表3に示すようにストック溶液を調製する(実験日の前)。

コンポーネント	経路
125 mM パイプ pH 6.8	3.78 gのパイプを水に溶かします。 NaOHでpHを6.8に調整し、水で容量を100mLに補います。
8% w/v オイスターグリコーゲン	カキグリコーゲン0.8 gを量り、水に加える。 最終容量を水で最大10mLにし、穏やかに温める/混合してグリコーゲンを溶かします。 -20°Cで冷凍保存する。
200 mM Naリン酸 pH 6.8	2.63gのNa2HPO 4.7H 2 Oおよび1.41 gのNaH2PO4を溶解する。水中のH2O。 水で容量を100 mLまで上げます。
1 mMグルコース-1,6-ビスリン酸	2 mgのグルコース-1,6-ビスリン酸を4 mLの水に溶解します。 分注し、-20°Cで凍結保存します。  少なくとも数ヶ月間安定しています。
10 ミリメートル NADP	23 mgのNADPを3 mLの水に溶解します。. 分注し、-20°Cで凍結保存します。  少なくとも数ヶ月間安定しています。

表3:グリコーゲンホスホリラーゼ活性のアッセイに必要なストック溶液。

2. ウォーターバスを30°Cに予熱する
3. 各グリコーゲンホスホリラーゼアッセイを1.5 mLチューブにセットアップし、以下にリストする反応混合物試薬を添加します(表4)。

コンポーネント	容量(μl)
125 mM パイプバッファー pH 6.8	160
水	70
8% w/v オイスターグリコーゲン	100
200 mM Naリン酸 6.8	400
1 mMグルコース-1,6-ビスリン酸	20
10 ミリメートル NADP	20
最終巻	770

表4:グリコーゲンホスホリラーゼ活性のアッセイのための組成物反応混合物。

注:セットアップを容易にするために、計画されたアッセイの数を完了するのに十分な数の上記の各試薬を含むマスターミックスを作成できます。

5. 表4にリストされている成分を含むブランク反応液を調製しますが、pH 6.8の25 mM PIPESバッファー(125 mM PIPESバッファー1/5を水で希釈して調製)を30 μL追加します。使い捨てメタクリレートキュベットに移し、分光光度計のゼロを340nmに設定するために使用します。
6. 1.5 mLチューブに770 μLの反応混合物を1つ取ります。1 μLのグルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼと1 μLのホスホグルコムターゼを加え、穏やかに混合し、30°Cで3分間インキュベートして反応混合物を予熱します。
7. グリコーゲンホスホリラーゼを含むサンプル30 μLを25 mM PIPESバッファー、pH 6.8に加えます。反応混合物を混合し、使い捨てメタクリレートキュベットに移します。
8. キュベットを分光光度計に入れ、340 nmの吸光度を10〜20分間の時間間隔で記録します。得られた吸光度を時間に対してプロットします。
   注:グリコーゲンホスホリラーゼを25 mM PIPESバッファーで置換する反応を含める必要があります。グリコーゲンホスホリラーゼサンプルの純度によっては、他のコントロールも必要になる場合があります(詳細については、「ディスカッション」を参照)。
9. 反応速度を決定します(詳細については、代表的な結果を参照してください)。

3. グリコーゲン枝切り酵素活性の測定

1. 表5に示すようにストック溶液を調製する(実験日より前)。

コンポーネント	経路
100 mM マレイン酸バッファー	1.61gのマレイン酸を~80mLの水に溶かします。 NaOHでpHを6.6に調整し、水で最終容量を100mLまでにします。
300 mM トリエタノールアミン塩酸塩/3 mM MgSO4 pH 7.5	27.85gのトリエタノールアミン塩酸塩および0.370gのMgSO 4を溶解する。7H2O~400mLの水中。 NaOHでpHを7.5に調整し、水で最終容量500mLまで作ります。
150 mM ATP/12 mM NADP	1.24 g の ATP を ~ 10 mL の水に溶解します。 pHを監視し、NaOHを添加して、ATPが溶解するにつれてpHを~7.5に維持します。 0.138 gのNADPを加える。 NaOHでpHを~7.5に調整し、水で最終容量15mLまで作ります。-20°Cでアリコートで保存してください。 数ヶ月間安定しています。
50 mM リン酸Na 緩衝液 pH 6.8	32.81gのNa2HPO 4.7H 2 Oおよび17.61gのNaH2PO4を溶解する。水中のH2O。 水で容量を最終容量5 Lまで上げます。

表5:グリコーゲン枝切り酵素活性のアッセイに必要なストック溶液。

2. ホスホリラーゼ限界デキストリンの調製
   1. カキグリコーゲン0.3 gを10 mLの50 mMリン酸ナトリウム緩衝液、pH 6.8に溶解します。
   2. 凍結乾燥ホスホリラーゼA粉末を十分に溶解し、pH 6.8の50 mMリン酸緩衝液に60 Uの活性をもたらします。
      注:購入したホスホリラーゼAの量に応じて、必要な質量は異なりますが、通常は5〜10mgの粉末です。
3. グリコーゲン溶液に60UのホスホリラーゼAを加え、透析バッグに移します。室温で1 Lの50 mMリン酸ナトリウム緩衝液、pH 6.8に対して8時間透析します。新鮮な透析バッファーに変更し、一晩インキュベーションを続けます。
4. さらに10UのホスホリラーゼAを添加し、新しい透析バッファーに変更します。8時間後、再び新鮮な透析バッファーに変更し、一晩インキュベーションを継続します。
5. 透析バッグの内容物を遠沈管に移し、10分間煮沸する。氷上で冷やしてから、10,000 x g で15分間遠心分離します。
6. 上清を透析バッグに移し、2Lの蒸留水を3回交換して8時間透析します。
7. 透析バッグの内容物を50mLの遠沈管に移します。体積を測定し、氷冷した無水エタノールを2倍量加えて限界デキストリンを沈殿させます。チューブを氷の上に30分間放置します。
   注:エタノールを添加するとすぐに白い沈殿物が形成され始めますが、そうでない場合は、3 M NaClを滴下します。
8. 15,000 x g で15分間遠心分離し、上清を廃棄します。リミットデキストリンの白いペレットを66%v/vエタノールで2回すすぎ、すすぎごとに~30mLを使用します。
9. 限界デキストリンを乳鉢に移し、完全に風乾させます。限界デキストリンが乾いたら、乳棒で粉末に粉砕し、保管に適した容器に移します。4°Cで乾燥させる。
10. 枝切り酵素基質として使用するには、水中の1%w/v溶液を調製します。
11. 水浴を30°Cに予熱する。
12. 加熱ブロックまたは水浴を95°Cに予熱します。
13. マレイン酸バッファー100 μL、ホスホリラーゼ限界デキストリン80 μL、および水10 μLを含む1.5 mLチューブを4本用意します。これらのチューブは、枝切り酵素アッセイを実施するために使用されます。2つのチューブに反応と他の2つのチューブコントロールのラベルを付けます。
14. 時間間隔で、10 μLの枝切り酵素サンプルを反応チューブに加え、分岐酵素サンプルの調製に使用した10 μLのバッファーをコントロールチューブに追加します。30°Cでインキュベートします。
15. 定義された時点(5分、10分、20分のインキュベーションなど)で、各反応および制御チューブから50 μLを引き出し、直ちに95°Cの加熱ブロックまたはウォーターバスに入れます。 3分間加熱します。
16. 沈殿したタンパク質を除去するために、15,000 x g で2分間遠心分離します。
    注: この時点で、必要に応じて手順を停止できます。加熱した試料は、放出されたグルコースの測定に進むまで-20°Cで凍結保存することができる(下記のステップ17)。
17. 放出されたグルコースの測定
    1. 加熱したサンプルの上清40 μLを使い捨てメタクリレートキュベットに移し、833 μLのトリエタノールアミン塩酸塩/硫酸マグネシウムバッファー、67 μLのNADP/ATP混合物、および60 μLの水を加えます。気泡が入らないように注意しながら、ピペッティングで軽く上下に混ぜます。
       注:セットアップを容易にするために、計画されたアッセイの数を完了するのに十分な数の上記の各試薬を含むマスターミックスを作成できます。
    2. マレイン酸バッファー100 μL、ホスホリラーゼ限界デキストリン80 μL、および水20 μLを組み合わせてブランク反応を調製します。よく混合し、40 μLを使い捨てメタクリレートキュベットに移します。ステップ3.17.1の説明に従って、833μLのトリエタノールアミン塩酸塩/硫酸マグネシウムなどを追加します。
    3. ブランク反応を使用して、分光光度計のゼロを340 nmに設定します。
    4. 0.5 μLのグルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼを各キュベットに加えます。ゆっくりと上下にピペッティングして穏やかに混ぜます。室温で10分間インキュベートし、340 nmの吸光度を記録します。
       注:吸収値は低く、グルコース-6-リン酸によるサンプルの汚染がほとんどないことを意味します。
    5. 各キュベットに0.5 μLのヘキソキナーゼを加えます。ゆっくりと上下にピペッティングして穏やかに混ぜます。室温で15分間インキュベートし、340 nmの吸光度を記録します。
    6. 室温でさらに5分間インキュベーションを続けます。340 nmの吸光度をもう一度記録します。吸収が15分で記録されたものから増加した場合は、さらに5分間インキュベーションを続け、吸収を再度確認します。得られた340nmでの最終吸収を記録する。
    7. 各試料について、グルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ添加後に記録した340nmにおける吸光度を、ヘキソキナーゼ添加後に得られた最終吸光度から差し引く。得られた値を、対応するサンプルが枝切り酵素でインキュベートされた時間の長さに対してプロットします。

4. グリコーゲン分岐酵素活性の測定

1. 実験日の前に、まず2.6 gのKIを10 mLの水に溶解してヨウ素/KI溶液を調製します。ドラフト内で、0.26 gのヨウ素を量り取り、KI溶液に加えます。
   注意: ヨウ素は、皮膚に接触したり吸入したりすると有害です。混合してヨウ素を溶解し、光から保護された4°Cで保存する。また、pH 6.8の125 mM PIPESバッファーを調製します( 表3を参照)。
2. 実験を開始するときは、酸性化ヨウ素試薬の作業ストックを作成します。
   1. 50 mLチューブに45.7 mLの水を入れ、150 μLのヨウ素/KI溶液を加え、続いて150 μLの1 M HClを加えます。
   2. よく混ぜて、光から保護された4°Cで保管します。溶液はこれらの条件下で少なくとも3日間安定である。
3. 実験当日、アミロースの新鮮な10 mg / mL溶液を作ります。
   1. 50 mgのアミロースを計量し、15 mLチューブに移します。
   2. 無水エタノール200μLを加え、軽く振とうします。
   3. 500 μLの2 M KOHを加え、穏やかに振とうします。
      注意: KOHは重度の皮膚火傷や目の損傷を引き起こします。適切な個人用保護具を使用してください。
   4. 軽く振とうしながら0.5mLの水を加えます。アミロースが完全に溶解しない場合は、さらに0.5 mLの水を加えます。
   5. pH を 1 M HCl で ~6.5 から 7.0 に調整します。
      注意: HClは、目、皮膚、気道の炎症を引き起こす可能性があります。.適切な個人用保護具を使用してください。
   6. 最終容量5mLに達するまで水を加える。
   7. 0.2μmのシリンジエンドフィルターを通過させて滅菌し、室温で保存します。冷やしたり凍らせたりしないでください。
4. 水浴を30°Cに予熱する。
5. それぞれ1 mLの酸性化ヨウ素試薬を含む12本の1.5 mLチューブを準備します。ベンチに置いておきます。これらは分岐酵素反応を止めるために使用されます。
6. それぞれ150 μLのアミロース、150 μLのPIPESバッファー、および45 μLの水を含む4本の1.5 mLチューブを準備します。これらのチューブは、分岐酵素アッセイを実施するために使用されます。2つのチューブに反応と他の2つのチューブコントロールのラベルを付けます。
7. 時間間隔で、5 μLの分岐酵素サンプルを反応チューブに加え、分岐酵素サンプルの調製に使用した5 μLのバッファーをコントロールチューブに追加します。30°Cでインキュベートします。
8. 定義された時点(5分、10分、15分のインキュベーションなど)で、各反応およびコントロールチューブから10 μLを引き出し、1 mLの酸性化ヨウ素試薬を含む1.5 mLチューブに追加します。さらに140μLの水を加えてよく混ぜます。使い捨てキュベットに移します。
   注意: サンプルの色は青色で、溶液には沈殿物がないようにする必要があります。形成された色は室温で少なくとも2時間安定です。
9. 1 mLの酸性化ヨウ素試薬と150 μLの水を含むサンプルを準備します。よく混ぜてキュベットに移します。このキュベットを使用して、分光光度計のゼロを660nmに設定します。
10. 660 nmにおける12個のサンプルそれぞれの吸光度を読み取ります。各時点で枝作り酵素が存在しない場合(Control)の吸光度から枝作り酵素の存在下で得られた吸光度(反応)を差し引くことにより、枝作り酵素反応の速度を決定します。詳細は代表成績をご覧ください。

5. グリコーゲン分岐の定性的評価

1. ~40 mLの水に無水塩化カルシウム74.5 gを加えて攪拌することにより、飽和塩化カルシウム溶液を調製します。もう少し水を加えてかき混ぜ続けます。水で容量を100mLまで作り、CaCl₂ が完全に溶解するまで攪拌を続けます。
2. 15 mLチューブ中で50 μLのKI/ヨウ素ストック溶液(上記のステップ4.1を参照)と13 mLの飽和CaCl₂溶液を混合することにより、ヨウ素/CaCl₂カラー試薬のワーキングストックを調製します。よく混ぜて、光から保護された4°Cで保管します。溶液は、これらの条件下で少なくとも1週間安定です。
3. 分岐の決定
   1. 1.5 mLチューブ中で、650 μLのヨウ素/CaCl₂ カラー試薬ストックと100 μLの水を混ぜ合わせ、十分に混合します。溶液を使い捨てメタクリレートキュベットに移します。
      注:キュベット内の溶液は透明で淡黄色でなければなりません。
   2. 分光光度計に入れ、波長スキャンモードで実行して、330nmから800nmのバックグラウンドスペクトルを収集します。
   3. 1.5 mLチューブ中で、650 μLのヨウ素/CaCl₂ カラー試薬と50 μgのカキグリコーゲンを混ぜ合わせます。最終容量を水で750 μLにし、完全に混合します。溶液を使い捨てメタクリレートキュベットに移します。
      注意: キュベット内の溶液は透明で、濃いオレンジ/茶色である必要があります。
   4. 分光光度計に入れ、330nmから800nmの吸収スペクトルを収集します。
   5. 手順4.4.3から4.4.4を、50μgのアミロペクチンと30μgのアミロースで繰り返します。
      注:アミロペクチンサンプルは黄色/緑色で、アミロースサンプルは緑/青である必要があります。両方のサンプルが透明である必要があります。形成された着色錯体は、室温で少なくとも1時間、吸収スペクトルの変化がなく安定しています。
   6. 特性評価されていないグリコーゲンサンプルの分岐構造の指標を得るには、25 μgから50 μgのグリコーゲンを650 μLのヨウ素/CaCl₂ 発色試薬と組み合わせます。上記のように進め、水で容量を750 μLにし、完全に混合し、メタクリレートキュベットに移します。
      注:グリコーゲンサンプルは、存在するグリコーゲンの分岐の程度(外鎖の長さ)に応じて、黄色/オレンジ色からオレンジ色/茶色を生成するはずです。繰り返しますが、サンプルは明確でなければなりません。詳細は 代表成績 をご覧ください。
   7. 吸収スペクトルを収集します。

結果

グリコーゲン合成酵素活性の測定
図1 は、精製酵素を用いたグリコーゲン合成酵素アッセイの代表的な結果を示す。パネルAでは、わずかな遅れの後、約12分間、時間の経過とともに340nmでの吸収が直線的に減少しました。 図1A の吸収の変化率は~0.12吸光度単位/分であった。吸光度の変化速度は~0.010〜~0.20吸光度単位/分の間で最適で?...

ディスカッション

一般に、提示されたすべての方法の主な利点は、低コスト、容易さ、速度、および特殊な機器への依存の欠如です。それらすべてに共通する主な欠点は、他の利用可能な方法と比較した感度です。NADH / NADPHの生産または消費を伴う手順の感度は簡単に推定できます。NADH/NADPHの吸光係数が6.22 M-1 ^cm-1であることを考えると、単純な算術で10~20 μMの濃度変化を容易に検出できるこ?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Amylopectin (amylose free) from waxy corn	Fisher Scientific	A0456
Amylose	Biosynth Carbosynth	YA10257
ATP, disodium salt	MilliporeSigma	A3377
D-Glucose-1,6-bisphosphate, potassium salt	MilliporeSigma	G6893
D-glucose-6-phosphate, sodium salt	MilliporeSigma	G7879
Glucose-6-phosphate dehydrogenase, Grade I, from yeast	MilliporeSigma	10127655001
Glycogen, Type II from oyster	MilliporeSigma	G8751
Hexokinase	MilliporeSigma	11426362001
Methacrylate cuvettes, 1.5 mL	Fisher Scientific	14-955-128	Methacrylate is required since some procedures are conducted at 340 nm or below
β-Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate sodium salt	MilliporeSigma	N0505
β-Nicotinamide adenine dinucleotide, reduced disodium salt	MilliporeSigma	43420
Nucleoside 5'-diphosphate kinase	MilliporeSigma	N0379
Phosphoenolpyruvate, monopotassium salt	MilliporeSigma	P7127
Phosphoglucomutase from rabbit muscle	MilliporeSigma	P3397
Phosphorylase A from rabbit muscle	MilliporeSigma	P1261
Pyruvate Kinase/Lactic Dehydrogenase enzymes from rabbit muscle	MilliporeSigma	P0294
UDP-glucose, disodium salt	MilliporeSigma	U4625