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要約

水生生物の生息地から炭化水素分解細菌を分離、増殖、および特性評価するプロセスを紹介します。このプロトコルは、細菌の分離、16S rRNA法による同定、およびそれらの炭化水素分解の可能性のテストの概要を示しています。この記事は、研究者が環境サンプル中の微生物の生物多様性を特徴付け、特にバイオレメディエーションの可能性がある微生物をスクリーニングするのに役立ちます。

要約

炭化水素汚染物質は劣化に抵抗性があり、環境への蓄積はすべての生命体に有毒です。細菌は多数の触媒酵素をコードし、自然に炭化水素を代謝することができます。科学者は、水生生態系の生物多様性を利用して、生分解とバイオレメディエーションの可能性がある細菌を分離します。環境からのこのような単離物は、代謝経路および酵素の豊富なセットを提供し、これらはさらに、工業規模で分解プロセスをスケールアップするために利用することができる。この記事では、水生生息地からの細菌種の分離、繁殖、および同定の一般的なプロセスの概要を説明し、簡単な手法を使用してin vitro で炭化水素を唯一の炭素源として利用する能力をスクリーニングします。本プロトコルは、16S rRNA分析を用いた様々な細菌種の単離およびその後の同定を記載する。このプロトコルは、細菌分離株の炭化水素分解の可能性を特徴付けるためのステップも提示しています。このプロトコルは、バイオテクノロジーアプリケーションのために環境生息地から細菌種を分離しようとする研究者に役立ちます。

概要

炭化水素(HC)は、燃料としても化学用途でも広く使用されています。溶媒1としては、ベンゼン、トルエン、キシレンなどの芳香族炭化水素が広く用いられている。エチレンおよびプロピレンなどのアルケンは、それぞれポリエチレンおよびポリプロピレンポリマーの合成における前駆体として役立つ。他の炭化水素の重合、スチレンはポリスチレンを形成する。人為的活動は、その生産および輸送中に炭化水素を環境に導入します。土壌や水の炭化水素汚染は、環境と人間の健康に深刻な懸念を抱いています。微生物は、生物地球化学的循環を調節し、汚染物質や生体異物を含む幅広い基質を利用して炭素やエネルギー源に変換することにより、生態系を維持する上で主要な役割を果たしています。微生物による環境汚染物質の解毒のこのプロセスは、バイオレメディエーション3、4、5、6、7として知られています。

炭化水素を分解する能力を持つ微生物は、水生および土壌の生息地で見られます8,9,10。シュードモナス、アシネトバクター、ロドコッカス、マリノバクター、オレイバクター11など、アルカンや芳香族HCを分解する可能性のある多くの細菌が確認されています。技術的に高度な培養に依存しないアプローチの開発は、新しいHC分解微生物群集の発見に役立っています12。ソースサンプルから直接分離されたゲノム材料は、次世代シーケンシング(NGS)などのハイスループット法によって増幅およびシーケンシングされ、その後分析されるため、微生物を培養する必要がなくなります。メタゲノム解析などのNGS法は高価であり、増幅プロセスに関連する欠点に悩まされている13。炭化水素分解微生物の分離を標的とする選択的濃縮培養14などの培養技術は、研究者が細菌分離株の代謝経路を調査および操作できるようにするため、依然として有用です。

ゲノムDNAの単離とそれに続くゲノム材料の配列決定により、あらゆる生物に関する貴重な情報が明らかになります。全ゲノムシーケンシングは、抗生物質耐性、潜在的な薬物標的、病原性因子、トランスポーター、生体異物代謝酵素などをコードする遺伝子の同定に役立ちます15,16,17。16SrRNAコード遺伝子の配列決定は、細菌の系統発生を特定するための堅牢な技術であることが証明されています。長年にわたる遺伝子配列と機能の保存により、未知の細菌を同定し、分離株を最も近い種と比較するための信頼できるツールになります。また、この遺伝子の長さはバイオインフォマティクス解析に最適である18。これらすべての特徴に加えて、ユニバーサルプライマーを使用した遺伝子増幅の容易さと遺伝子シーケンシング技術の改善により、微生物の同定のゴールドスタンダードとなっています。

ここでは、環境試料からHC分解能を有する培養可能な微生物を回収する手順について述べる。以下に説明する方法は、HC分解細菌の収集と同定の概要を示しており、(1)水サンプルからの細菌の収集、(2)純粋培養物の分離、(3)細菌分離株のHC分解能力の探索、(4)ゲノムDNAの分離、および(5)16S rRNA遺伝子シーケンシングとBLAST分析に基づく同定の5つのセクションに分かれています。この手順は、多くの異なるバイオテクノロジー用途のために細菌を単離するために適応させることができます。

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プロトコル

1. サンプルの収集、処理、分析

注:ここでは、水生生物の生息地から細菌を分離するためのプロトコルを示します。一部の分離株は病原性である可能性があるため、手袋を着用し、使用の前後に作業領域を消毒してください。

  1. 水域のさまざまな場所から500 mLの水サンプルを5つの滅菌ガラス瓶に収集します。各サンプルのpHと温度をそれぞれpHメーターと温度計で測定します。
    注:このプロトコルはサイト固有ではなく、炭化水素で汚染された水域から生物を分離するためにも簡単に適合させることができます。
  2. 100 mLのバッチで、0.22 μmの孔径のフィルターシートを通して、無菌状態でサンプルをろ過します。
    注意: ろ紙の直径は、ペトリ皿の直径を超えてはなりません。たとえば、直径85 mmを超えないろ紙は、100〜120 mmのペトリ皿に最適です。
  3. ろ紙をさまざまな栄養培地プレート(PYE 19、R2A 20、M9、LB、NB、TSB、M6321およびM2G22)の上に置いてください。異なるタイプの増殖培地は、異なる微生物の選択および濃縮を可能にする。種々の増殖培地の組成を表1に列挙する。各メディアプレートに1枚の紙を使用し、滅菌鉗子を使用して2時間後に剥がします。
  4. 無濾過水サンプル(106 希釈)を滅菌二重蒸留水で100 μLの滅菌水に100 μL添加して段階希釈します。これにより、1:10に希釈されます。このサンプルから100 μLを取り、900 μLの滅菌水を加えて1:100希釈を得ます。希釈倍率が1:1,000,000になるまで希釈を繰り返します。ピペッティングで混合します。各希釈液の最終容量は1mLになります。
  5. 100 μLの希釈水サンプルを、ステップ3で説明したすべての増殖培地プレートに個別に3回に分けて広げます。
  6. コロニーの成長に応じて、プレートを30°Cで24〜48時間インキュベートします。
    注:ほとんどの環境分離株は、30°Cの最適温度で成長します。 極端な温度の環境からサンプルを分離する場合は、収集サイトと同じ温度でプレートをインキュベートします。
  7. 次に、滅菌したつまようじまたはピペットチップを使用してコロニーを選び、象限ストリーキングを実行してコロニーを分離します。
  8. プレートを一晩インキュベートします。翌日、色、質感、形状、サイズ、マージン、標高などの形態学的特徴に基づいてコロニーをスクリーニングします。純粋な培養物を得るためにコロニーを再構築します。
  9. 各純培養液23 のグラム染色を行い、グリセロールストック調製を進める。
  10. グリセロールストックを調製するには、単一コロニーを3 mLの適切な増殖培地に接種し、30°Cでインキュベートします。 一晩培養から700μLを取り、300μLの100%グリセロール(オートクレーブ滅菌)をクライオバイアル24に加える。長期保存のためにバイアルを-80°Cで凍結します。

2.炭化水素の分解

注:以下の例は、スチレンを分解する可能性のある分離株をスクリーニングすることです。これは、以前のレポート25で採用された方法のわずかな変更です。無菌条件下での手順に従ってください。

  1. 縞模様の新鮮なプレートからコロニーを選び、5 mLのトリプシン大豆ブロス(TSB)/栄養ブロス(NB)に接種します。吸光度が~2に達するまで、200 rpmで振とうしながら30°Cで一晩培養物を増殖させます。
    注:TSB / NB以外に、細菌が高い細胞密度に達する任意の増殖培地を選択できます。
  2. 翌日、細胞を2862 x g で4°Cで5分間ペレット化し、上清を廃棄します。
  3. ペレットを2 mLのオートクレーブ生理食塩水(0.9%NaCl)で2回洗浄し、2862 x g で4°Cで5分間回転させます。
    注:生理食塩水は等張性であるため、細菌細胞内の浸透圧を維持します。
  4. ペレットを2 mLの液体カーボンフリー基礎培地(LCFBM)に再懸濁します。吸光度(OD600)を測定します。
  5. 対照と実験群のために150mLの容量を持つ2つの滅菌三角フラスコを取ります。それらをAおよびBとしてラベル付けします。
  6. 未接種/対照群(フラスコA)に、40 mLのLCFBMとスチレン(5 mM)を追加します。
  7. フラスコBに、35mLのLCFBMとスチレンを加える(スチレンの最終濃度を5mMに調整する)。細胞の最終OD600 ≈ 0.1の細胞懸濁液を加え、残りの容量を最大40 mLのLCFBMで補います。フラスコを30°Cで200rpmで30日間振とうしながらインキュベートします。
    注:過剰な炭化水素は微生物にとって有毒である可能性があるため、低濃度から始めて徐々に増やします。
  8. 炭化水素の分解を評価する必要がある追加の菌株ごとに上記を繰り返します。
  9. 各フラスコのOD600 を5日ごとに測定し、成長曲線をプロットします。細菌がスチレンを利用できる場合は、インキュベーションを最大45日間増やします。OD600 の増加は、細菌がスチレンを代謝できることを示しています。

3. 細菌分離株によるカテコール分解のスクリーニング

注:スチレン、ベンゼン、キシレン、ナフタレン、フェノールなどの芳香族炭化水素の分解は、反応中間体としてカテコールを生成します。カテコールは、それぞれオルト切断経路およびメタ切断経路を介して、カテコール1,2-ジオキシゲナーゼおよびカテコール2,3-ジオキシゲナーゼ酵素の助けを借りて細菌によってさらに代謝される26。これらの酵素は、クロロベンゼン27などの他の炭化水素の分解にも関与しています。以下に述べるプロトコルは、カテコール2,3−ジオキシゲナーゼ酵素アッセイ28のために全細胞ライセートを使用する。同じ溶解法を用いて、カテコール1,2−ジオキシゲナーゼの活性をスクリーニングすることができる。しかしながら、反応混合物の組成は変化するであろう。両方の酵素は本質的に誘導性であり、増殖培地へのフェノールの添加によって誘導することができる。

  1. 滅菌ループの助けを借りて、縞模様の新鮮なプレートから1〜4 mMのフェノールを添加したミネラル塩培地(MSM)に細菌コロニーを接種します。培養液を30°Cおよび200rpmでインキュベートします。OD600 が1.4〜1.6の間に達すると(すなわち、指数関数的後期に)、4500 x g で20分間回転させることにより、4°Cで培養物を収穫します。
  2. 細胞ペレットをリン酸緩衝液(0.5 M、pH 7.5)で洗浄します。
  3. 細胞を上記のリン酸緩衝液に再懸濁し、最終OD600 ≈ 1.0に調整します。
  4. 1.5分間パルス超音波処理によって細胞を溶解し、各パルスの持続時間は15秒である。このステップの後、懸濁液は透明または濁りの少ないものでなければなりません。そうでない場合は、パルス数を増やして、サスペンションがクリアかどうかを確認します。各パルスの後、タンパク質の分解を避けるためにサンプルを氷上に保ちます。
  5. 低温(4°C)を維持しながら、9,000 x g で30分間遠心分離することにより、細胞破片と壊れていない細胞を取り除きます。
  6. 透明な上清を注意深くピペットで入れます。この画分は、酵素アッセイ用の粗抽出物を有する。
  7. 粗抽出物のタンパク質濃度をブラッドフォードまたはローリーの方法29,30のいずれかで決定します。
  8. カテコール2,3-ジオキシゲナーゼの活性を測定するために、分光光度計によって反応最終生成物(2-ヒドロキシムコンセミアルデヒド)の形成を測定する。
  9. 20 μLのカテコール(50 mM)、960 μLのリン酸緩衝液(50 mM、pH 7.5)、および20 μLの粗抽出物を加えて反応混合物を調製します。
  10. 陰性対照の場合は、粗抽出物をリン酸緩衝液に交換し、最終容量を1 mLに調整します。
  11. 反応混合物を30分間インキュベートする。設定した時間間隔で、375 nmの吸光度を測定します。吸光度の増加は、反応最終生成物である2-ヒドロキシムコン酸セミアルデヒド(2-HMS)の形成を示す。三重に分けて実験を行います。
    注意: カテコールは光に敏感で酸素に敏感です。反応混合物を暗所に保管し、カテコールの自然な分解を防ぐためにチューブをしっかりと閉じます。.

4. 純粋培養のゲノムDNA単離

注:これは、ゲノムDNAを単離するための一般的なプロトコルです。グラム染色は、サンプルの収集、処理、および分析ステップ中に実行されました。グラム陽性菌とグラム陰性菌の細胞壁の厚さがばらつくため、それに応じて細胞溶解法が変更されます。分離中は手袋を着用し、ヌクレアーゼがDNAを分解しないように70%エタノールで作業台を消毒します。下記の化学物質のいくつかは、皮膚に重度の火傷を引き起こす可能性があるため、取り扱いには適切な注意を払う必要があります。

  1. グラム陰性菌からのゲノムDNAの単離31.
    1. 単一のコロニーを選び、滅菌試験管内の新鮮な増殖培地に接種します。
    2. チューブを200 rpmのインキュベーターシェーカーに入れ、細菌を30°Cで一晩増殖させます。
    3. 翌日、1.5 mLの培養液を12,400 x g で3分間一晩発酵させます。
    4. 上清を除去し、ペレットを200 μLの溶解バッファー(40 mM トリス酢酸、pH 7.8、20 mM 酢酸ナトリウム、1 mM EDTA、1% SDS)に再懸濁します。
    5. 66 μLのNaCl溶液(5 M)を加えてよく混ぜます。
    6. 得られた混合物を12,400 x g で10分間(4°C)ペレット化します。
    7. 透明な上清を新鮮な微量遠心チューブでピペットで送り、等量のクロロホルムを加えます。
    8. 乳白色の溶液が観察されるまで、溶液を複数回反転混合します。
    9. 12,400 x g で3分間スピンし、上清をきれいなバイアルに移します。
    10. 氷冷した100%エタノール1mLを加えます。DNAの白い鎖が沈殿するまで反転によって混合します。
    11. 沈殿したDNAを2,200 x g で4°Cで10分間遠心分離し、上清を廃棄します。
    12. DNAペレットを1 mLの70%エタノールで洗浄し、DNAペレットを室温で5分間乾燥させます。
    13. 乾燥後、ペレットを100 μLの1x Tris-EDTA(TE)バッファーに再懸濁し、DNAを-20°Cで保存します。
    14. 分光光度計を使用して濃度(A260/280)を測定し、アガロースゲル(1%)上でDNAを走らせてDNA24の品質を評価します。
  2. グラム陽性株からのゲノムDNAの単離32
    1. 単一のコロニーを選び、滅菌試験管内の新鮮な増殖培地に接種します。
    2. チューブを200 rpmのインキュベーターシェーカーに入れ、適切な成長温度で細菌を一晩増殖させます。
    3. 翌日、増殖した培養液1.5 mLを取り、8,600 x g で5分間遠心分離します。
    4. 上清を除去し、細胞をTEバッファーに再懸濁します。
    5. TEバッファーでOD600 = 1.0を調整し、740 μLの細胞懸濁液を清潔な微量遠心チューブに移します。
    6. 20 μLのリゾチーム(100 mg/mLストック)を加え、ピペッティングでよく混ぜます。37°Cで30分間インキュベートします(ドライバス中)。
    7. 40 μLの10%SDSを添加し、よく混合します。
    8. 8 μL のプロテイナーゼ K (10 mg/mL) を加えます。よく混合し、56°Cで1〜3時間(ドライバス中で)インキュベートします。懸濁液は粘度が上がると透明になり、効率的な細胞溶解を示すはずです。
      注:細胞が適切に溶解されていない場合は、懸濁液を一晩放置することができます。
    9. CTAB/NaCl混合物を65°C(ドライバス中)で予熱し、この混合物100 μLを細胞懸濁液に加えます。よく混ぜる。
    10. 65°Cで10分間インキュベートします(ドライバス中)。
    11. クロロホルム:イソアミルアルコール(24:1)500 μLを加え、よく混ぜます。16,900 x g で 25 °C で 10 分間回転させます。
    12. 有機相(底部の粘性相)を避けて、水相を新鮮な微量遠心チューブに移します。
    13. フェノール:クロロホルム:イソアミルアルコール(25:24:1)500μLを慎重に加え、よく混ぜます。16,900 x g で 25 °C で 10 分間回転させます。
    14. 水相を新鮮な微量遠心チューブに入れます。クロロホルム:イソアミルアルコール(24:1)500 μLを加え、よく混ぜます。
    15. 水相を移し、0.6容量のイソプロパノールを加える(-20°Cで予冷)。
    16. 沈殿したDNA鎖は糸状の形で見えなければなりません。-20°Cで2時間から一晩インキュベートします。
    17. 16,900 x g で 4 °C で 15 分間遠心分離し、DNA をペレット化します。
    18. イソプロパノールを注意深くデカントし、ペレットを1 mLの冷70%エタノール(-20°Cで予冷)で洗浄して不純物を取り除きます。
    19. 16,900 x g で 4 °C で 5 分間遠心分離します。 上清を捨てる。
    20. ペレットを室温で20分間乾燥させるか、チューブを37°Cに保ちます。 ペレットが過度に乾燥していないことを確認してください。
    21. 100 μLの1x TEバッファーに再懸濁し、DNAを-20°Cで保存します。
      注:ペレットが過剰に乾燥し、再懸濁が困難な場合は、マイクロ遠心チューブをDNAペレットとヌクレアーゼフリー水で37°Cで15〜20分間インキュベートし、ピペッティングで再度懸濁します。
    22. 1x TEバッファーで1:100に希釈した後、分光光度計を使用して濃度(A260/280)を測定し、DNAをアガロースゲル(1%)上で実行してDNA24の品質を評価します。

5. 16S rRNAシーケンシング

注:以下に概説するプロトコルは、細菌同定のための16S rRNAの増幅およびシーケンシング用です。16S rRNA配列に由来する情報は、未知の生物の同定および異なる生物間の関連性を見つけるために使用されます。

  1. 菌株を同定するには、細菌の16S rRNA配列を標的とするユニバーサルプライマー(27F(5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3')および1492R(5'-TACGGYTACCTTTTTACGACTT-3')33を用いて、純粋な細菌培養物から単離したDNAをPCRで増幅します。
  2. 18 μLのオートクレーブ/ヌクレアーゼフリー水、2.5 μLの10xバッファー、0.5 μLのフォワードプライマーとリバースプライマー(100 μMストック)、2 μLのdNTPミックス(100 μMストック)、1 μLのDNAテンプレート(2-15 ng/μL)、および1 Uの Taqポリメラーゼを使用して、氷上でPCRミックス(25 μL反応)を調製します。
  3. 16S rRNA遺伝子増幅には、94°Cで10分間の初期変性、(94°Cで40秒間の最終変性、56°Cで1分間のプライマーアニーリング、74°Cで2分間の伸長)x 30サイクル、74°Cで10分間の最終伸長。
  4. サイクルが終了したら、5 μLのサンプルと1 μLの5x DNAローディング色素を混合します。1%アガロースゲル上で実行して、増幅を検証します。PCR産物は4°Cで短期間保存するか、さらに使用するまで-20°Cで凍結します。
  5. 16S rRNA遺伝子シーケンシングでは、大容量(100 μL)に対して上記と同じ反応を設定します。
  6. PCR産物精製キットを使用してサンガーシーケンシング24,34用のアンプリコンを精製するか、サンプル全体をDNAローディング色素と混合し、アガロースゲルにロードしてゲル抽出法を実行します。
  7. シーケンシングが完了したら、結果ファイルをFASTA形式に変換し、NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)35の基本的なローカルアラインメント検索ツール(BLAST)で配列の類似性を確認します。

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結果

水生生息地からの細菌の単離とスクリーニング、およびその後の16S rRNA分析による同定の手順全体を概説した概略図を図1に示します。インドのダドリの湿地からの水サンプルは、滅菌ガラス瓶に集められ、すぐに処理のために実験室に運ばれました。サンプルを孔径0.22μmのフィルターシートに通し、ろ紙を異なるメディアプレートに接触させた。2時間後、...

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ディスカッション

実験室6では、地球上の細菌の約1%しか容易に培養できないことは十分に確立されています。培養可能な細菌の中でも、多くは特徴付けられていないままです。分子法の改良は、細菌群集の分析と評価に新しい次元を与えました。ただし、このような手法には制限がありますが、培養分析が冗長になるわけではありません。個々の細菌種を単離するための純粋な培養技術は、?...

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開示事項

著者は利益相反を宣言しません。

謝辞

Karthik Krishnan博士とRPラボのメンバーの有益なコメントや提案に感謝します。DSは、SNU-Doctorフェローシップとアースウォッチ・インスティテュート・インド・フェローシップの支援を受けています。RPラボは、シブナダール大学からのCSIR-EMR助成金とスタートアップ資金によってサポートされています。

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資料

NameCompanyCatalog NumberComments
AgaroseSigma-AldrichA4718Gel electrophoresis
Ammonium chloride (NH4Cl)Sigma-AldrichA9434Growth medium component
Ammonium sulphateSigma-AldrichA4418Growth medium component
Bacto-AgarMillipore1016141000Solid media preparation
Calcium chloride (CaCl2)MERCKC4901-500GGrowth medium component
CatecholSigma-Aldrich135011Hydrocarbon degradation assay
Cetyltrimethylammonium bromide, CTABSigma-AldrichH6269Genomic DNA Isolation
ChloroformHIMEDIAMB109Genomic DNA isolation
Disodium phosphate (Na2HPO4)Sigma-AldrichS5136Growth medium component
EDTASigma-AldrichE9884gDNA buffer component
Ferrous sulphate, heptahydrate (FeSO4.7H20)Sigma-Aldrich215422Growth medium component
GlucoseSigma-AldrichG7021Growth medium component
GlycerolSigma-AldrichG5516Growth medium component; Glycerol stocks
IsopropanolHIMEDIAMB063Genomic DNA isolation
LB AgarDifco244520Growth medium
Luria-Bertani (LB)Difco244620Growth medium
Magnesium sulphate (MgSO4)MERCKM2643Growth medium component
Manganese (II) sulfate monohydrate (MnSO4.H20)Sigma-Aldrich221287Growth medium component
Nutrient Broth (NB)Merck (Millipore)03856-500GGrowth medium
PeptoneMerck91249-500GGrowth medium component
PhenolSigma-AldrichP1037Genomic DNA isolation
Potassium phosphate, dibasic (K2HPO4)Sigma-AldrichP3786Growth medium component
Potassium phosphate, monobasic (KH2PO4)Sigma-AldrichP9791Growth medium component
Proteinase KThermoFisher ScientificAM2546Genomic DNA isolation
QIAquick Gel Extraction kitQIAGEN160016235DNA purification
QIAquick PCR Purification kitQIAGEN163038783DNA purification
R2A AgarMillipore1004160500Growth medium
SmartSpec Plus SpectrophotometerBIO-RAD4006221Absorbance measurement
Sodium acetateSigma-AldrichS2889Genomic DNA isolation
Sodium chloride (NaCl)Sigma-AldrichS9888Growth medium component
Sodium dodecyl sulphate (SDS)Sigma-AldrichL3771Genomic DNA isolation
StyreneSigma-AldrichS4972Styrene biodegradation
Taq DNA PolymeraseNEBM0273X16s rRNA PCR
Tris-EDTA (TE)Sigma-Aldrich93283Resuspension of genomic DNA
Tryptic Soy Broth (TSB)Merck22092-500GGrowth medium
Yeast extractSigma-AldrichY1625-1KGGrowth medium component
Zinc sulfate heptahydrate (ZnSO4.7H20)Sigma-Aldrich221376Growth medium component

参考文献

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