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Summary

ここでは、トレフィンと鈍いゴルフクラブスパッドとを用いてマウスの中央角膜上皮擦過傷創傷を作成するためのプロトコルが記載されている。この角膜創傷治癒モデルは非常に再現性が高く、現在、疾患の文脈における妥協した角膜創傷治癒を評価するために使用されている。

Abstract

角膜は視力に不可欠であり、眼の屈折力の約3分の2を占める。視力における角膜の役割に不可欠なのは、その透明性です。しかし、その外的位置のために、角膜は角膜の透明度の喪失および最終的な失明につながる可能性のある多種多様な傷害に非常に敏感である。これらの傷害に応答した効率的な角膜創傷治癒は、角膜恒常性を維持し、角膜透明度および屈折能力の保存にとって極めて重要である。角膜創傷治癒が損なわれた場合、角膜は感染症、潰瘍形成、および瘢痕化に対して脆弱になる。角膜の透明性および視力の維持に対する角膜創傷治癒の基本的な重要性を考えると、正常な角膜創傷治癒プロセスのより良い理解は、感染および疾患に関連する角膜創傷治癒障害を理解するための前提条件である。この目標に向けて、角膜創傷のマウスモデルは、正常な生理学的条件下で作動する角膜創傷治癒機構の理解を促進する上で有用であることが証明されている。ここでは、トレフィンと鈍いゴルフクラブスパッドとを用いてマウスにおける中央角膜上皮擦過傷を作成するためのプロトコルが記載されている。このモデルでは、角膜を中心とする直径2mmの円形トレフィンを使用して、創傷領域を区切る。ゴルフクラブのスパッドは、上皮をデブライドし、角膜上皮基底膜を損傷することなく円形の創傷を作成するために注意して使用される。結果として生じる炎症反応は、効率的な創傷治癒に不可欠な細胞および分子事象の十分に特徴付けられたカスケードとして進行する。この単純な角膜創傷治癒モデルは非常に再現性が高く、よく知られており、現在、疾患の文脈における妥協した角膜創傷治癒を評価するために使用されている。

Introduction

角膜は、眼の3分の1の透明な前部である。角膜は、眼の内部構造を保護し、感染から眼を保護する構造障壁を形成することを含むいくつかの機能を果たす1。さらに重要なことに、角膜は視力にとって重要であり、眼2,3の屈折力の約3分の2を提供する。視力における角膜の役割に不可欠なのは、その透明性です。しかし、その外側の位置のために、角膜は、その障壁機能の破壊、透明性の喪失、および最終的な失明につながる可能性がある日常的に多種多様な傷害にさらされる。角膜透明度の喪失は、世界中の視覚障害の主な原因である4,5。角膜擦過傷は、緊急治療室(ER)への訪問の一般的な理由であり、ER6で提示された眼関連症例の半分を占める。米国では、毎年100万人以上の人々が眼に関連する怪我に苦しんでいると推定されています7。これらの傷害に応答した効率的な角膜創傷治癒は、角膜恒常性を維持し、その透明性および屈折能力の維持にとって極めて重要である。角膜創傷治癒が損なわれた場合、角膜は感染症、潰瘍形成、および瘢痕化に対して脆弱になる8,9。また、屈折矯正手術の人気が高まっているため、角膜10に独特の外傷性課題が課せられています。角膜の透明性および視力の維持に対する角膜創傷治癒の基本的な重要性を考えると、正常な角膜創傷治癒プロセスのより良い理解は、感染および疾患に関連する角膜創傷治癒障害を理解するための前提条件である。

そのために、角膜創傷治癒のいくつかの動物モデルが開発されている11、12、13、14、15。角膜創傷治癒のマウスモデルは、正常な生理学的条件下で作動する角膜創傷治癒機構の理解を促進する上で有用であることが証明されている。異なるタイプの角膜創傷が角膜創傷治癒の研究に用いられており、それぞれが創傷治癒プロセスの異なる側面を調査するのに適している。角膜創傷治癒研究に使用される創傷モデルの一般的なタイプは、機械的および化学的創傷モデルである。化学的角膜創傷は、主に角膜上のアルカリ性火傷の生成を伴い、角膜潰瘍、不透明化、および新生血管形成の研究に有用である13。機械的角膜創傷は、デブリードマン(abrasion)創傷およびケラテクトミー創傷14、15、16を含む。無傷または破れた角膜上皮基底膜は、それぞれデブリードマンおよびケラテクトミー創傷を定義する。デブリードマン創傷では、上皮基底膜は無傷のままであり、一方、ケラテクトミー創傷では、基底膜は主に前間質への浸透で破られる。デブリードマン創傷は、再上皮化、上皮細胞増殖、免疫応答、および角膜創傷後の神経再生を研究するのに最も有用である。一方、ケラテクトミー創傷は、角膜瘢痕の研究に最も有用である14,15。

ここでは、トレフィンと鈍いゴルフクラブスパッドとを用いてマウスの中央角膜上皮擦過傷創傷を作成するためのプロトコルが記載されている。この単純な角膜創傷治癒モデルは、再現性が高く、よく公表されており、現在、疾患17の文脈における妥協した角膜創傷治癒を評価するために使用されている。

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Protocol

すべての動物プロトコルは、ヒューストン大学とベイラー医科大学の施設動物ケアおよび使用委員会によって承認されました。視覚および眼科研究における動物の使用に関する視覚および眼科研究のための協会(ARVO)の声明に概説されたガイドラインは、マウスの取り扱いおよび使用において従った。

1. 準備

  1. フルオレセイン溶液の調製
    1. 1mLの滅菌生理食塩水または滅菌1xリン酸緩衝生理食塩水(PBS)に10mgのフルオレセインナトリウム塩を溶解して1%フルオレセイン溶液を調製する。
      注:微生物汚染を避けるために、使用日またはその前日にフルオレセインナトリウム溶液を調製してください。使用前日に調製した場合は、フルオレセイン溶液を光から4°C離れた場所で保存してください。チューブをアルミ箔で包み、フォトブリーチングを防ぎます。
    2. 溶液を1回の実験での使用に適したアリコートに分割します。1-1.5 μLのフルオレセイン溶液を、マウス1匹当たり、時点ごとに使用する。次の式を使用して、1 回の実験に適したアリコートの量を計算します。
      figure-protocol-1
      注: たとえば、6 匹のマウスを 1 回の実験で研究し、創傷の大きさを 5 つの時点で監視した場合、その 1 回の実験に適したアリコートの量は次のようになります。
      figure-protocol-2
  2. マウスの麻酔のためのケタミン/キシラジンカクテルの調製。
    1. 10 mLのカクテルを調製するには、2.0 mLのケタミン(100 mg/mL)と1.0 mLのキシラジン(20 mg/mL)を混ぜ合わせ、7.0 mLの滅菌PBSを加える。ケタミン/キシラジンカクテルを手術の前日または当日に準備する。
      メモ:特に明記されていない限り、すべての溶液は室温で使用してください。

2.麻酔

  1. マウス(8~12週齢のC57BL/6野生型マウス)の体重を秤量し、投与する麻酔薬の適量を決定した。両手マウス拘束技術を使用して、麻酔薬18の注射のためにマウスを拘束および取り扱います。ケタミン/キシラジンカクテルを腹腔内(i.p.)にケタミン80mg/kgおよびキシラジン8mg/kgの最終濃度で投与する。
  2. マウスに角膜創傷を行う前に、完全な麻酔が達成されるまで待つ。つま先のピンチ後のペダル反射を評価することによって麻酔の深さを評価する。適切な麻酔が達成されると、マウスはつま先のピンチで動くべきではありません。
    注:マウスは麻酔中に体温をすぐに失うため、低体温症を防ぐためにマウスに暖かさの源を提供することが重要です。麻酔および回復段階の間にマウスを熱源(加熱パッド)上に置く。

3. 角膜創傷の作成

  1. 右目または左目のみに傷をつけます。マウスからマウスに移動するときに傷ついた目(すなわち、左または右)との一貫性を維持する。
    注:擦過傷は角膜神経を損傷し、視力を低下させるため、両眼を傷つけると重大な不快感や障害を引き起こす可能性があります。鎮痛薬は炎症反応を抑制する可能性があるので、それらの使用は角膜炎症を理解することを目的とした特定の実験における交絡物であり得る。角膜創傷実験における鎮痛薬の回避は、当社の施設動物ケアおよび使用委員会(IACUC)によって承認されました。
  2. 上皮角膜創傷を作成するには
    1. 解剖顕微鏡下で、直径2mmのトレフィン( 図1参照)を使用して角膜の中心を区切り、親指と人差し指でまぶたを握って目を大きく開いたままにします。トレフィンを優しく回して角膜上皮に印象を与えます。
      注:トレフィンを使用するときは、角膜の穿孔を引き起こす可能性があるため、過度の圧力をかけないように注意する必要があります。また、トレフィンを中央に配置するように注意する必要があります。瞳孔は、角膜の中心を見つけるためのランドマークとして使用することができます。
    2. 解剖顕微鏡下で、鈍いゴルフクラブのスパッド( 図1参照)を角膜の表面から約45°、トレフィンで区切られた領域内に保持する。上皮をデブライドするために、スプッドで区切られた領域内の上皮を慎重にかつ継続的にこすります。
      注:デブリードマンに過度の力を加えないでください。マウスの目は、創傷プロセス中に乾燥し、デブリードマンを困難にする可能性がある。このような場合は、滅菌PBSを眼の表面に塗布して、最適な水分補給を維持してください。

figure-protocol-3
図1:2mmトレフィンと鈍いゴルフクラブスパッド トレフィンは角膜中心の円形領域を画定するために使用され、ゴルフクラブのスパッドは画定領域内の上皮を除去するために使用される。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

4. 創傷閉鎖および再上皮化のモニタリング

  1. 創傷面に1%フルオレセイン溶液1〜1.5μLのピペットを、青色光源を有するデジタル顕微鏡を用いて角膜を画像化した。
  2. フルオレセイン溶液の最初の1分以内に画像を取得し、創傷サイズの過大評価につながる周囲の上皮への拡散を避ける。創傷角膜は、創傷後の特定の時間(すなわち、0時間、12時間、18時間、24時間、および30時間)に画像化される。
    注:すべての時点で、イメージングは麻酔下で行われます。ケタミン/キシラジンは創傷時に使用され、イソフルランはその後の時点で使用される。マウスは、創傷閉鎖モニタリングの期間中、別々のケージに個々に収容される。一緒に飼育されると、マウスは同腹仔の目をなめる傾向があり、この行動は、異なる組織における創傷治癒に影響を及ぼすことが示されている19、20。
  3. 撮影した画像を解析し、画像解析ソフトを用いて創傷領域をトレースする。各時点の創傷面積は、0時間における元の創傷面積に対する百分率として表される。

5. 免疫蛍光イメージングと解析

  1. 創傷後の所望の時点で、IACUC承認法(この場合、二酸化炭素の過剰摂取に続いて子宮頸部脱臼)によってマウスを安楽死させる。
  2. 虹彩湾曲したはさみを使用して眼球をずらすために横のカンサスを優しく押すことによって眼球を収穫する。眼球の後ろのはさみを引いて視神経をしっかりつかみ、神経を切って眼球を外すことができます。
  3. 各眼球を2%パラホルムアルデヒドを含む1 mLの1x PBSで室温で1時間固定し、その後、1 mLの1x PBSでそれぞれ5分間3回洗浄します。
  4. 解剖顕微鏡下で、外科用ブレードを使用して、辺縁部までの遠位約500μmの強膜に切開を行い、その後、地球を切断する。鉗子を使用して、角膜から虹彩物質を静かに取り除き、強膜組織を慎重にトリミングして、辺縁部をそのまま残すようにします。
  5. 角膜が平坦になるように、角膜末梢から伸び、中心の手前で止まる4つの部分的な放射状の切断(それぞれ長さ約1mm)を行います。
  6. 角膜を透過処理し、1 mL の 2% ウシ血清アルブミン (BSA) および 0.01% TritonX -100 を 1x PBS で 15 分間ブロックした後、1x PBS 中の 2% BSA で室温でさらに 45 分間ブロッキングします。
  7. 角膜を、2%BSAを含む1x PBS中で調製した直接標識されたユニークな蛍光色素結合抗体のカクテル中で4°Cで一晩インキュベートする。
    注:抗体は、目的の特定の細胞および組織を標識するために標的とされる。例えば、内皮、好中球、および血小板は、それぞれ抗CD31 21、22、抗Ly−6G 23、24、および抗CD4125、26抗体で標識される。4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAPI)を抗体カクテルに添加して核を可視化する。
  8. インキュベーション後、角膜を1x PBSで3回、それぞれ15分間洗浄する。
  9. 角膜を退色防止蛍光マウント媒体の滴で顕微鏡スライド上にマウントし、カバースリップで覆い、蛍光光学顕微鏡を用いて所望の倍率(対物レンズ4倍~100倍)で画像化する。 図2Aに示すように、異なる領域にわたる角膜のフル厚み画像を撮影する。
    注: 図2A に示す顕微鏡分析のパターンは、炎症および細胞分裂における特定の局所変化を分析するために使用される。DAPI染色とLy-6G染色の両方が血管外好中球を同定するために使用されます。DAPI染色では、球状好中球は明確な馬蹄形またはドーナツ型の核を有する(図2B)。

figure-protocol-4
図2:角膜イメージング戦略と中央擦過傷後の好中球浸潤。 (A)角膜の直径を横切る9つの顕微鏡視野を示す角膜ホールマウントの概略図。灰色の領域は、元の創傷領域を表す。各領域の幅は500μmである(B)DAPI染色による好中球核の明確な馬蹄形またはドーナツ形状に注意する。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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Results

図3 は、鈍いゴルフクラブスパッドで作成された角膜創傷の透過型電子顕微鏡写真を示し、上皮基底膜が損傷後に実際に無傷であることを実証する。

figure-results-1
図3:上皮基底膜は角膜擦過後も無傷のままである。 鈍いゴルフクラブスパッ...

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Discussion

この方法論文の目的は、トレフィンおよび鈍いゴルフクラブスパッドを用いてマウスにおいて中央角膜上皮擦過傷創傷を作成するためのプロトコールを記述することであった。このマウスモデルは、角膜炎症および創傷治癒へのその寄与を研究するために使用されている。このタイプのモデルは、正常な生理学的条件下でおよび病状における角膜創傷治癒機構を研究するために使用すること?...

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Disclosures

著者らは開示するものは何もありません。

Acknowledgements

資金提供: NIH EY018239 (A.R.B., C.W.S., および R.E.R., P.R.E.), P30EY007551 (A.R.B.), および Sigma Xi Grant in Aid of Research (P.K.A.) の後援:コンテンツは著者の責任であり、国立衛生研究所(Sigma Xi)の公式見解を表すものではありません。

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Anti-CD31 antibodyBD Bioscience, Pharmingen550274
Anti-CD41 antibodyBD Bioscience, Pharmingen553847
Anti-Ly6G antibodyBD Bioscience, Pharmingen551459
Bovine serum albumin (BSA)ThermoFisher scientificB14
C57BL/6 miceJackson Laboratories664
DAPISigma AldrichD8417
DeltaVision wide-field deconvolution fluorescence microscopeGE Life Sciences
Dissecting microscopeLeica microsystems
Electronic Toploading Balances (Weighing scale)Fisher Scientific
EthanolThermoFisher scientificT038181000CS
Golf-club spudStephens instrumentsS2-1135
Iris curve scissorsFisher Scientific31212
IsofluranePatterson veterinary07-893-1389
KetaminePatterson veterinary07-890-8598
Phospate buffered saline (PBS)ThermoFisher scientificAM9624
Sodium fluorescein saltSigma Aldrich46970
Surgical blade (scapel blade)Fine Science tools10022-00
TrephineIntegra Miltex33-31
TritonX -100Fisher Scientific50-295-34
ForcepFine Science tools11923-13
XylazinePatterson veterinary07-808-1947

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