超音波ガイド下注射による膵臓癌細胞の同所性異種移植片の作製

要約

ヒト膵臓癌細胞の超音波ガイド下注射とその後の超音波画像によるin vivo での腫瘍増殖のモニタリングにより、低侵襲同所性膵臓癌モデルを生成するためのプロトコルを提示します。

要約

膵臓がん(PCa)は、世界で最も致命的な種類のがんの1つです。PCa悪性腫瘍の理由は、主にその固有の悪性挙動と治療的治療に対する高い耐性に依存しています。実際、多くの努力にもかかわらず、標準的な化学療法と革新的な標的療法の両方が、前臨床評価から臨床現場に移行したときに実質的に失敗しました。このシナリオでは、PCaの in vivo 特性をよりよく模倣する前臨床マウスモデルの開発が、新たに開発された薬剤を試験するために緊急に必要とされています。本プロトコルは、ヒト膵臓腫瘍細胞の超音波ガイド下注射によって得られる同所性異種移植片によって表されるPCaのマウスモデルを生成する方法を記載する。このような信頼性が高く低侵襲なプロトコルを使用して、超音波(US)イメージングで監視できる in vivo 生着と腫瘍塊の発生の証拠も提供します。ここで説明するPCaモデルの注目すべき側面は、時間の経過とともに腫瘍塊のゆっくりとした発達であり、これにより、薬理学的治療の開始点を正確に特定し、治療的介入の効果をより適切に監視できます。さらに、ここで説明する手法は、痛みや苦痛を最小限に抑え、研究における動物の福祉を直接改善するため、3Rの原則の実装例です。

概要

PCa、およびその最も一般的な形態である膵管腺癌(PDAC)は、ステージ^1,2に関係なく、1年生存率が20%未満、5年生存率が8%の癌関連死の最も一般的な原因の¹つです。この病気はほとんどの場合致命的であり、発生率が低下している他の種類の癌とは異なり、その発生率は今後数年間継続的に増加すると予測されています³。癌の発見の遅れ、急速な進行の傾向、特定の治療法の欠如などの要因は、PCa⁴の予後不良につながります。より正確な前臨床マウスモデルの開発のおかげで、癌研究の大きな進歩が得られました。これらのモデルは、がんの根底にある分子メカニズムの理解と新しい治療法の開発に適切な洞察を提供しました⁵。これらの進歩は、最近の大きな努力にもかかわらず、現在の化学療法療法に耐性を維持しているPCaにはほとんど当てはまりません¹。これらの理由から、患者の見通しを改善するための新しいアプローチの開発が必須です。

長年にわたり、今日最も広く使用されているモデルである異種移植片を含む多くのPCaマウスモデルが開発されてきました⁵。異種移植片モデルは、移植された腫瘍細胞の位置に応じて、皮下異所性および同所性として分類される。皮下異所性異所性異種移植片は、達成するのがより簡単で安価ですが、PCaの特定の特徴(すなわち、線維性組織の蓄積、低酸素症、酸性度、および血管新生を特徴とする独特の腫瘍微小環境)を見逃しています^6,7。これは、皮下異種移植片が治療のための堅牢なデータを提供できないことが多く、臨床現場に変換されたときに失敗につながる理由を説明し^{ています8}。一方、同所性異種移植片は腫瘍微小環境によりよく似ており、疾患の自然な発達をよりよく模倣することにつながります。さらに、同所性異種移植片は、皮下モデルではほとんど起こらない転移過程およびPCaの侵襲的特徴を研究するのにより適している⁹。全体として、同所性異種移植マウスモデルは、今日では前臨床薬物試験を実施するのに好まれている^9,10。同所性異種移植片は通常、細胞または非常に小さな腫瘍組織片のいずれかを膵臓に移植するための外科的処置に依存しています。実際、PCaの手術モデルに基づくいくつかの論文が過去数十年間に発表されています¹¹。しかしながら、同所性腫瘍モデルを確立するための外科的処置の質および結果は、術者の技術的スキルに強く依存する。トランスレーショナルクリニカルアプローチのための同所性PCa異種移植片を成功させるためのもう一つの重要なポイントは、予測可能な成長動態を有する局所疾患を確立する可能性である。

これらの問題に対処するために、ここでは、免疫不全マウスの膵臓の尾部へのヒトPCa細胞の超音波(US)ガイド下注射を利用して、同所性PCa異種移植片を製造する革新的な手順について説明します。この手順により、信頼性の高い PCa マウス モデルが生成されます。腫瘍の成長は、米国のイメージングによって in vivo で追跡されます。

プロトコル

現在のプロトコルは、イタリア保健省から承認番号843/2020-PRで承認を受けました。無菌状態を確保するために、動物はフィレンツェ大学の研究動物ビバリウム(Ce.S.A.L.)のバリアルーム内で維持されました。すべての手順は、マウスがフィレンツェ大学(イタリア)のLIGeMA施設に収容されたのと同じスペースで実施されました。

1.細胞調製

1. 2%のL-グルタミンと10%のウシ胎児血清(FBS)を添加したダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)を含む100 mmのペトリ皿で、PCa細胞株のPCa細胞を培養します。
2. 正常酸素状態の細胞を5%_CO2を含む37°Cでインキュベートします。
3. トリプシンで細胞を剥離します。接種1時間前に、1 x 10⁶ 細胞を20 μLのPBSにカウントし、再懸濁します。

2.超音波ガイド下注射(US-GI)のためのマウスの準備

注:以下の手順は無菌条件下で実行しました。麻酔の開始からマウスが動物プラットフォームから取り除かれるまでの米国誘導注射の全手順は、マウスの完全な回復のために約10〜12分プラス5分かかります。

1. 介入の直前に、カルプロフェン(NSAID)を5 mg / kgの最終用量で皮下投与するか、27 G針を備えたツベルクリン注射器を使用して5 mg / kgの最終用量でトラマドールを投与します。.
   注:本プロトコルでは、20匹の無胸腺ヌードフォックス^1nu 雌マウスが使用されました。マウスは8週齢で、体重は20〜22 gでした。
2. イメージャーの電源を入れ、トランスデューサーパネルのアプリケーションメニューで マウス(小)腹部 を選択します。Bモード(輝度モード)イメージングウィンドウが表示され、システムがBモードデータを取得する準備ができていることを確認します。
   メモ: B モードは、システムのデフォルトのイメージングモードです。システムは、エコー信号の振幅に基づいて輝度レベルを割り当てることにより、エコーを2次元(2D)ビューで表示します。Bモードは、解剖学的構造を見つけるための最も効果的なモードです。
   1. 試験ブラウザに移動します。
   2. 新規スタディを選択し、スタディ名と情報( スタディ の日付など)を入力します。
   3. シリーズ名に必要なすべての情報(動物系統、ID、生年月日など)を入力します。
   4. [ 完了]をタップします。プログラムはBモードイメージングの準備ができています。
3. 麻酔導入チャンバーでマウスを麻酔し、4%イソフルランを使用し、ガス流は2 L / minのO₂です。
   注:適切な麻酔には約4分で十分です(毎分約50〜60回の呼吸)。
4. マウスに麻酔をかけたら、麻酔器の接続を変更して、イソフルランをマウスハンドリングテーブルに向けます。
5. 麻酔をかけたマウスを右側面のハンドリングテーブル(37°Cで加熱)に置き、鼻をノーズコーンに入れ、マウスが2%イソフルランを使用して麻酔され、ガス流量が0.8 L/minのO₂ であることを確認します(図1A)。
6. 麻酔下での乾燥を防ぐために、マウスの目に人工涙液を一滴塗ります。
7. 右手、右足、尾を粘着ガーゼで動物プラットフォームの電極パッドにしっかりとテープで固定します。
   注意: マウスの呼吸数と心電図(ECG)は、電極パッドを介して記録されます。

3. US-GI法による膵臓へのPANC1細胞の注入

1. マウスの皮膚を70%エタノールで消毒し、粘着ガーゼを使用して左脇腹の皮膚を伸ばしたままにします。
   注意: 針の挿入に対する抵抗を減らし、針の変形を防ぐために、皮膚を伸ばしたままにすることが重要です。
2. 20 mLシリンジ(針なし)を使用して、マウスの腹部と左脇腹に超音波ゲルを適用します。
3. USトランスデューサーの高さ制御ノブを使用して、トランスデューサーを下げてマウスの左脇腹に触れ、動物の体に横方向に置きます。
4. トランスデューサを動かして、Bモードイメージングを使用してトランスデューサーディスプレイに膵臓を視覚化します(図1B)。
5. 20 μLのPBSに懸濁した1 x 10⁶ PANC1細胞を含む50 μLのハミルトンシリンジを30 mm 28 Gの針で準備し、シリンジを適切なホルダーに置きます(図1C)。
   注意: 使用する前に、シリンジ針を70%エタノールで5〜10分間消毒してください。
6. ホルダーマイクロマニピュレーターを使用して、針のベベルを上にして超音波トランスデューサーと同じ平面に置き、シリンジをマウスの皮膚に下げ、トランスデューサーと45°の角度を形成します(図1D)。
   注意: このステップ以降、ディスプレイ上の米国の画像を監視して続行します。
7. マイクロマニピュレーターを使用して、皮膚に穴を開け、注射針を膵臓に挿入し、ディスプレイ上のUS画像を観察して、その軌跡を追跡します(図1E)。
   注:注射する前に、脾臓の後ろで左腎臓の近くにある基準として膵臓の尾を取ります。
8. 針を膵臓に挿入したら、シリンジプランジャーに一定の圧力を加えて、細胞を含む20 μLのボーラスを直接膵臓に注入します(図1F)。
   注:正しい注射手順は、膵臓内の小さな泡の存在と、針先からほとんど見えない低エコー性流体の流れによってチェックされます。
9. ボーラス全体を注入した後、針を5〜10秒間そのままにしておき、ゆっくりと引っ込めます。
10. USトランスデューサーを取り外し、側面からゲルをきれいにし、マウスを新しいケージに入れます。胸骨横臥を維持するのに十分な意識を取り戻すまで動物を観察します。

4.3Dマウスの膵臓腫瘍を監視するための米国のイメージング

注:腫瘍発生の評価は、細胞注射の8日後に、米国ガイド下注射に使用したのと同じ機器を使用して実施しました( 資料の表に記載されています)。したがって、システム点火(ステップ2.2)、麻酔(ステップ2.3〜2.6)、および動物プラットフォームへのマウスの配置(ステップ2.7)などのいくつかの手順は、プロトコルで前述されたものと完全に一致します。

1. US イメージングを開始する前に、 図 2A に示すようにワークステーションをセットアップします。
2. トランスデューサーを3Dモーターシステムに固定します(図2A)。
3. イメージャーをオンにして、スタディブラウザで新しいスタディを選択します。
4. マウスを麻酔導入室(4%イソフルラン)に入れる。
5. 麻酔をかけたマウスを、麻酔チューブに鼻を入れて37°Cに加熱したハンドリングテーブルに右脇腹に置き、イソフルランを2%に減らします(図2B)。
   注:同じ解剖学的参照を維持するために、マウスを米国ガイド下注射と同じ位置に配置することが重要です。
6. マウスの目に獣医軟膏を一滴塗ります。
7. マウスの腹部と左脇腹に超音波ゲルの層を適用します。
8. 55 MHzトランスデューサを横向きに配置し、膵臓がほぼ中央になるように左脇腹の皮膚に触れます(図2C)。
9. 3Dモーターを使用して、膵臓全体の画像を横方向に取得し、理想的には取得ごとに90〜100フレームを収集します(フレーム数は個人の選択によって異なる場合があります)。
   1. イメージャーのタッチパッドで 3Dモーターの位置 を選択します。
   2. カーソルを動かしてスキャン距離を示し、両端から膵臓全体の画像を取得します。
   3. [ フレームをスキャン] を選択し、3D取得を開始します。
10. 3Dイメージングが完了したら、トランスデューサーを取り外し、皮膚からゲルを取り除き、マウスを新しいケージに入れて回復させます。胸骨横臥を維持するのに十分な意識を取り戻すまで動物を観察します。

結果

上記のプロトコールに従って、マウスを最初にイソフルランチャンバー内で麻酔し、動物プラットフォーム上に配置した(図1A)。膵臓を超音波画像で視覚化した(図1B)。50 μLのハミルトンシリンジに、20 μLのPBSに懸濁した1 x 10⁶ PANC1細胞を装填し、ニードルホルダーに置きました(図1C)。シリンジとUSトランスデューサー?...

ディスカッション

US画像の使用は臨床において広く行われているが、多くの前臨床マウスモデルにおける腫瘍発生は、通常、生物発光画像を用いて説明される¹¹。後者は、腫瘍の生着および拡大を評価する間接的な方法であり、また、信頼できる腫瘍増殖動態を提供しない。本研究では、細胞注入の実施と腫瘍発生のモニタリングにUSイメージングを適用しました。私たちが説明したプロトコ?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 mm Petri dish	Sarstedt, Germany	P5856
3D-Mode package	Visualsonics Fujifilm, Italy		Includes the 3D Motor; necessary for volumetric imaging
Aquasonic 100, Sonypack 5 lt Ultrasound Transmission Gel	PARKER LABORATORIES, INC.	150	Gel for ultrasound
Athymic Mice (Nude-Foxn1nu)	ENVIGO, Italy	69	20 females, 8 weeks old, Athymic Nude-Foxn1nu, 20-22 g body weight
CO2 Incubator Function Line	Heraeus Instruments, Germany	BB16-ICN2
Display of ECG, Respiration Waveform and body temperature	Visualsonics Fujifilm, Italy	11426
DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium)	Euroclone Spa, Italy	ECM0101L
DPBS (Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline)	Euroclone Spa, Italy	ECB4004L
Eppendorf (1.5mL)	Sarstedt, Germany	72.690.001
FBS (Fetal Bovine Serum)	Euroclone Spa, Italy	ECS0170L
Hamilton Needle Pointstyle 4, lenght 30 mm, 28 Gauge	Permax S.r.l., Italy	7803-02
Hamilton Syringe 705RM 50 µL	Permax S.r.l., Italy	7637-01
Isoflo (250 mL)	Ecuphar	7081219
L-glutamine 100X	Euroclone Spa, Italy	ECB3000D
Mouse Handling table II	Visualsonics Fujifilm, Italy	50249
MX550D: 55 MHz MX Series Transducer	Visualsonics Fujifilm, Italy	51069	Ultrasound Transducers
Oxygen/isofluorane mixer	Angelo Franceschini S.r.l.	LFY-I-5A
PANC1 cell line	American Type Culture Collection (ATCC), USA	CRL-1469
Rimadyl (carprofen)	Pfizer	11319	20 mL, injection solution
Trypsin-EDTA 1X in PBS	Euroclone Spa, Italy	ECB3052D
Vet ointment for eyes, Systane nighttime	Alcon	509/28555-1
Vevo Compact Dual Anesthesia System (Tabletop Version)	Visualsonics Fujifilm, Italy	VS-12055	complete with gas chamber
Vevo Imaging Station 2	Visualsonics Fujifilm, Italy	VS-11983	Imaging WorkStation 1 plus Imaging Station Extension with injection mount
Vevo Lab	Visualsonics Fujifilm, Italy	VS-20034	Data Analysis Software
Vevo LAZR-X Photoacoustic Imaging System	Visualsonics Fujifilm, Italy	VS-20054	Includes analytic software package for B-mode
Vevo Photoacoustic Enclosure	Visualsonics Fujifilm, Italy	53157