JoVE Logo
著者
お問い合わせ

サインイン

このコンテンツを視聴するには、JoVE 購読が必要です。 サインイン又は無料トライアルを申し込む。

この記事について

  • 要約
  • 要約
  • 概要
  • プロトコル
  • 結果
  • ディスカッション
  • 開示事項
  • 謝辞
  • 資料
  • 参考文献
  • 転載および許可

要約

初期の開発は母性遺伝製品に依存しており、これらの製品の多くの役割は現在不明です。ここでは、CRISPR-Cas9を使用して、単一世代で母性効果表現型を特定するプロトコルについて説明しました。

要約

初期の発生は、卵形成中に成熟卵母細胞に組み込まれた母性因子のプールに依存し、接合子ゲノムが活性化されるまで発生に必要なすべての細胞機能を実行します。典型的には、これらの母性因子の遺伝的標的化は、母性効果表現型を同定するために追加の世代を必要とし、発生中の母体発現遺伝子の役割を決定する能力を妨げる。CRISPR-Cas9の双対立遺伝子編集機能の発見により、注入された胚または「クリスパント」の体細胞組織における胚表現型のスクリーニングが可能になり、発生プログラムにおいて接合体発現遺伝子が果たす役割の理解が深まりました。この記事では、クリスパントメソッドの拡張であるプロトコルについて説明します。この方法では、生殖細胞の二対立遺伝子編集により、単一世代で母性効果表現型、または「母体クリスパント」を単離することができます。単一の標的への多重化ガイドRNAは、母体クリスパントの効率的な生産を促進し、母体クリスパント一倍体の配列解析は、母体効果表現型を生成する遺伝的病変を裏付ける簡単な方法を提供します。母体クリスパントの使用は、母体発現必須遺伝子の迅速な同定をサポートし、したがって早期発生の理解を容易にする。

概要

母体寄託産物(RNA、タンパク質、その他の生体分子など)のプールは、胚の接合子ゲノムが活性化されるまでのすべての初期の細胞プロセスに必要です1。卵母細胞からのこれらの産物の時期尚早の枯渇は、典型的には胚性致死性である。発生におけるこれらの遺伝子の重要性にもかかわらず、多くの母体発現遺伝子の役割は現在不明です。CRISPR-Cas9などのゼブラフィッシュの遺伝子編集技術の進歩により、母体発現遺伝子の標的化が可能になりました2,3,4。ただし、母性効果表現型の同定には、接合子表現型と比較して余分な生成が必要であり、したがって、より多くのリソースが必要です。最近、CRISPR-Cas9の双対立遺伝子編集機能は、「クリスパント」として知られる注射された(F0)胚の体細胞組織における胚表現型のスクリーニングに使用されています5,6,7,8,9,10。クリスパント技術は、体細胞内の候補遺伝子の資源効率の高いスクリーニングを可能にし、発生における特定の側面の理解を容易にします。この論文で説明されているプロトコルは、単一の世代11で母性効果表現型、または「母体クリスパント」の同定を可能にします。このスキームは、ガイドRNAを単一の遺伝子にマルチプレックスし、生殖細胞系列における双対立遺伝子編集イベントを促進することによって達成可能です。これらの母体のクリスパント胚は、肉眼的形態学的表現型によって識別することができ、細胞境界の標識やDNAパターニングなどの一次特性評価を受けることができます11。誘導されたINDELの観察可能な表現型と基本的な分子特性を組み合わせた解析により、初期発生における標的遺伝子の役割を予測することができます。

ゼブラフィッシュでは、受精後最初の24時間(hpf)の間に、細胞の小さなグループが生殖系列12,13,14,15の前駆細胞である始原生殖細胞に発達します。F0雌が産んだクラッチでは、回収される母体のクリスパント胚の割合は、標的遺伝子に双対立遺伝子編集イベントを含む生殖細胞の数によって異なります。一般に、編集イベントが胚で早く発生するほど、生殖系列でCRISPR-Cas9変異が観察される可能性が高くなります。ほとんどの場合、母体のクリスパント胚の表現型は、発生中の卵母細胞に存在する2つの母体の対立遺伝子の機能の喪失に由来します。卵母細胞が減数分裂を終了すると、母体の対立遺伝子の1つが極体を介して胚から押し出され、もう一方の対立遺伝子が母体の前核に取り込まれます。複数の母体のクリスパント一倍体の配列決定は、表現型11に寄与する生殖細胞系列に存在する突然変異(挿入および/または欠失(INDEL))の混合物を表します。

以下のプロトコルでは、母体効果遺伝子にCRISPR-Cas9変異を作成し、母体クリスパントアプローチを使用して対応する表現型を特定するために必要な手順を説明しています(図1)。セクション1では、ガイドRNAを効果的に設計および作成する方法を説明しますが、セクション2と3には、マイクロインジェクションによって母体のクリスパンを作成するための重要なステップが含まれています。CRISPR-Cas9混合物を注入した後、注入された胚はPCRを介して体細胞編集についてスクリーニングされます(セクション4)。注入されたF0胚が発達して性的成熟に達すると、F0メスは野生型のオスに交配され、その子孫は母親効果表現型についてスクリーニングされます(セクション5)。セクション6には、CRISPR-Cas9誘発INDELを特定するためにサンガーシーケンシングと組み合わせることができる母体のクリスパント一倍体の作成に関する指示が含まれています。さらに、ディスカッションには、この方法の感度とパワーを高めるためにプロトコルに加えることができる変更が含まれています。

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

プロトコル

このプロトコルの開発につながる研究では、すべてのゼブラフィッシュの飼育と実験は、ウィスコンシン大学マディソン校の施設動物管理および使用委員会(IACUC-M005268-R2)によって承認されました。

1. ガイドRNAの合成

注:接合クリスパントは、単一のガイドRNAを使用するか、複数のガイドRNAを単一のターゲットにマルチプレックスして作成されています5、6、7、8、9、10。ガイドRNAのマルチプレックス化は、接合子クリスパント表現型10を示す胚の割合を増加させる。表現型を示す胚のこの増加頻度のために、母体のクリスパントは、単一の遺伝子に4つのガイドRNAを多重化することによって作成される。CHOPCHOPを使用してガイドRNAを設計するためのより詳細なプロトコルと、ゼブラフィッシュ用のガイドRNAを合成するためのアニーリング法は、他の場所にあります16、17、18、19、20。

  1. 標的とする母体発現遺伝子を同定するには、接合子から5日までのトランスクリプトーム情報を提供するRNA配列データベースを介して、発生中のmRNA転写レベルを確認する21。一般に、母体特異的遺伝子は初期胚で高発現し、接合子ゲノムが活性化された後に分解される22。
  2. 母体発現標的遺伝子が同定されたら、Ensemblゲノムブラウザ23上で利用可能な「ドメインおよび特徴」セクションを使用して、第1の予測タンパク質ドメインを決定する。このドメインを4つのガイドRNAの標的領域として使用します。
  3. ガイドRNA選択プログラムCHOPCHOPを使用して、最初のアクティブドメイン内の4つのガイドRNAターゲットサイトを特定します。各標的部位について、以下のように遺伝子特異的オリゴヌクレオチドを設計する。遺伝子特異的オリゴヌクレオチドにおいて、N20 セクションは、標的配列からCHOPCHOPからPAM部位(NGG)を差し引いたものに対応する。これらの遺伝子特異的オリゴヌクレオチドおよび定常オリゴヌクレオチドを標準的な脱塩精製を用いて注文する( 材料表参照)。
    遺伝子特異的オリゴヌクレオチド:
    5' TAATACGACTCACTATA- N20 -GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAG 3'
  4. 各遺伝子特異的オリゴヌクレオチドのガイドRNAテンプレートを作成するには、それを一定のオリゴヌクレオチドにアニーリングし、前述のようにT4-DNAポリメラーゼでオーバーハングを充填します16。4つのガイドRNAテンプレートを組み立てた後、製造元の指示に従って、DNAクリーンアップおよび濃縮キットを使用してそれらを精製および濃縮します(材料表を参照)。
  5. in-vitro T7転写キットを使用して、プールされたガイドRNAテンプレートからsgRNA混合物を合成します(材料の表を参照)。製造元の指示に従って体外転写を実行します。T7転写キットの半反応を使用すると、反応あたりのコストを削減できます。
  6. RNA合成後、前述のようにエタノール/酢酸アンモニウムプロトコルを使用して、得られたsgRNAのプールを精製します16、20、24。RNAを単離したら、20 μLのヌクレアーゼフリー水に再懸濁します。T7転写キットの半反応を使用してsgRNAのプールを転写した場合は、精製したRNAを10〜15 μLのヌクレアーゼフリー水に再懸濁します。
  7. 分光光度計を使用して作成されたプールされたsgRNAの量を定量します。sgRNAのプールをヌクレアーゼフリーの水で1500 ng/μL±500 ng/μLに希釈します。 通常、作業希釈液の最終容量は30〜50μLの範囲です。
  8. sgRNAのプールの濃度を決定した後、1%アガロースゲル上のsgRNAの完全性を検証します。
    1. 1%アガロース/0.5 μg/mL 臭化エチジウム/TBEゲルをキャストします。ゲルが固まったら、TBEランニングバッファーに入れます。
    2. 1 μLのsgRNA混合物と1 μLのRNAゲルローディングバッファーを混合します( 材料の表を参照)。このサンプルをゲルに入れ、ゲルを100 Vで5分間実行します。
  9. 紫外線(UV)を使用してバンドを視覚化します。sgRNAのプールは単一のバンドとして現れるはずです。塗抹標本が観察された場合は、RNA分解が起こった可能性があります。
  10. sgRNAのプールを、-80°Cの冷凍庫のヌクレアーゼフリーPCRストリップチューブにシングルユース1 μLアリコートで保存します。大量のsgRNA混合物(30 μL以上)の場合は、容量の半分をヌクレアーゼフリーPCRストリップチューブに分注し、残りの半分をヌクレアーゼフリーの微量遠心チューブに大容量として保存します。解凍し、必要に応じて分注します。
  11. RNAの分解を防ぐために、マイクロ遠心チューブ内のサンプルが2回以下の凍結融解サイクルを受けないようにしてください。

2.マイクロインジェクション用の試薬と材料の準備

注:ゼブラフィッシュでは、Cas9 mRNAを注射すると接合クリスパントを作成できます。しかし、研究によると、Cas9タンパク質は注入された胚でINDELを作成するのにより効率的であることが示されています16,25。このプロトコルでは、Cas9タンパク質は注入されたCas9 mRNAと同じ活性の遅れを経験しないため、Cas9タンパク質を使用して母体のクリスパントを生成します。理論的には、これにより、発生の早い段階で二対立遺伝子突然変異の可能性が高まり、生殖細胞系列のより広範な部分が影響を受ける可能性が高くなります。マイクロインジェクションの準備方法を詳述する他のプロトコルおよびリソースは、他の場所で見つけることができます24,26。

  1. Cas9タンパク質を購入または生成します( 材料の表を参照)。Cas9タンパク質をヌクレアーゼフリーの水に再懸濁して2 mg/mL溶液を作り、1 μLをRNaseフリーのポリプロピレン製マイクロ遠心チューブに分注します。これらは使い捨てチューブとして-80°Cで保管してください。
  2. 注射の前日の午後、マイクロピペットプラーを使用してガラス毛細血管を引っ張り、注射針を作成します。マイクロインジェクションの朝まで、切れ目のない針を同封のニードルホルダーに保管してください。
  3. インジェクションプレートを作成するには、20 mLの1.5%アガロース/滅菌H2Oを注ぎ、100 mm X 15 mmのペトリ皿の半分を満たし、固まるのを待ちます。アガロース溶液を固めたら、20 mLの1.5%アガロース/滅菌H2Oをペトリ皿に加え、プラスチック型( 材料表を参照)を液体アガロースに入れて硬化させます。
  4. アガロースが固まったら、プラスチック金型を取り出し、射出プレートを逆さまにして注射の朝まで冷蔵庫に保管します。ウェルが完全性を維持している限り、単一のプレートを複数の注入に使用できます。

3. CRISPR-Cas9カクテルを1細胞ゼブラフィッシュ胚にマイクロインジェクションし、母体のクリスパントを生成

注:ゼブラフィッシュ胚へのマイクロインジェクションに関するその他のリソースは、他の場所にあります24,26,27。CRISPR-Cas9混合物を1細胞胚の発育中の胚盤胞盤に注入すると、母体のクリスパントが生成される可能性が高くなります。混合物は、2細胞期まで卵黄嚢に注入することもできる。しかし、卵黄に注入された混合物は、卵胞体の流れに依存して胚盤に到達するため、卵黄に注入されたCRISPR-Cas9は、CRISPR-Cas928の切断効率を低下させる可能性があります。

  1. マイクロインジェクションの前日の午後、ゼブラフィッシュの交配ボックスに野生型の交配を設置します。オスとメスの両方の魚を同じ水槽に入れますが、交配ボックスの仕切りでそれらを分離するか、メスを産卵インサートの中に置きます。
  2. 実験の朝に、Cas9タンパク質の2 mg/mLアリコート1個とsgRNAプールのアリコート1個を取り出します。Cas9タンパク質を含むRNaseフリーポリプロピレンマイクロ遠心チューブで、sgRNAのプール、1 μLの0.5%フェノールレッド溶液、およびヌクレアーゼフリーの水を含む5 μLの注射混合物を組み立てます。RNaseフリー水中の最終濃度400 ng/μLのCas9タンパク質と200 ng/μLのプールされたsgRNAを目指すか、注入された胚のCas9タンパク質とsgRNAの比率を2:1にします。この注射混合物は、注射の朝の間氷上に保存することができる。
  3. 冷蔵庫から注射プレートを取り外し、室温(RT)まで少なくとも20分間温めます。
  4. 注射カクテルを組み立てた後、必要に応じて、交配ボックスの仕切りを取り外すか、オスをメスと同じ産卵インサートに入れるなどして、オスとメスを交尾させます。
  5. 魚が産んだ後、胚が採取される前に、新しいかみそりの刃または細い鉗子を使用して、切れていない針の先端を切り、胚の損傷を回避するのに十分小さいが、注射混合物で詰まらないように十分に広い針を作成します。針を切断した後、キャピラリーの後端に挿入されたマイクロローダーピペットチップを使用して、注射混合物を針にロードします(材料表を参照)。
  6. 針が満たされたら、針をRTで5分間インキュベートして、Cas9-sgRNA複合体を組み立てます。
  7. マイクロインジェクターの電源を入れ、針をマイクロマニピュレーターに挿入します。マイクロメータスライドに鉱油を一滴置き、針が1nLのボーラスを鉱油に排出するまで注入圧力を調整して針を校正します。
    注:鉱油に注入する場合、1 nLのボーラスは、マイクロメータスライドで測定した直径約0.125 mm(または半径0.062 mm)になります。
  8. 胚を同期させるには、プラスチックストレーナーを使用して10分後に胚を収集し、1x E3培地(5 mM NaCl、0.17 mM KCl、0.33 mM CaCl2、0.33 mM MgSO4、および1x E3の1 Lあたり20 μLの0.03 Mメチレンブルー)を使用してペトリ皿にすすぎます。10〜15個の胚を取り除き、それらを別のペトリ皿に入れて、注射されていない対照として保管します。
  9. 残りの発生中の胚を注射プレートのウェルに移します。
  10. 1 nLの溶液(合計400 pgのCas9タンパク質と200 pgのsgRNA)を1細胞胚の発育中の胚盤に注入します。針の先端が詰まった場合は、鉗子を使用して先端を後ろに折り、針を再調整して1nLのボーラスを排出します。受精後の発育の最初の40分間にすべての胚を注入するようにしてください。
  11. 注射が完了したら、注入した胚を1x E3培地を含むラベル付きペトリ皿に戻し、1日を通して発育させます。ゼブラフィッシュの病期分類シリーズ29に従って、受精していない、または正常に発達していない胚を取り除きます。

4. F0注入胚における体細胞INDELのスクリーニング

注:T7エンドヌクレアーゼIアッセイや高分解能融解分析など、INDELを特定するための他の方法は、胚に体細胞INDELが含まれているかどうかを判断する際に使用できます 30。

  1. 注射の翌日、ペトリ皿から欠陥のある溶解した胚を取り除き、胚の健康を維持するために1x E3培地を交換します。
  2. 皿を掃除した後、注射されていないプレートから6つの健康な注射胚と2つの対照胚を収集します。各胚をPCRストリップチューブの単一ウェルに個別に入れ、チューブの上部にラベルを付けます。
  3. 個々の胚のゲノムDNAを抽出するには、ストリップチューブのウェルから余分なE3培地を取り除き、ウェルあたり100 μLの50 mM NaOHを追加します。
  4. 胚を95°Cで20分間インキュベートします。次に、サンプルを4°Cまで冷却し、10 μLの1 M Tris HCL(pH 7.5)を加え、5〜10秒間ボルテックスします。この抽出されたDNAは、DNAを著しく分解することなく、-20°Cで少なくとも6ヶ月間保存することができる。
  5. CRISPR-Cas9標的部位を含む100-110 bp DNA断片を増幅するために、各ガイド部位に固有のスクリーニングプライマーを設計します。可能であれば、増幅されたフラグメントの中央にターゲットサイトを配置し、より大きな欠失を識別できるようにします。
  6. 4つのガイド標的部位のそれぞれについて、調製した5 μLの単一胚ゲノムDNA、PCRミックス、およびガイド特異的スクリーニングプライマーを使用して8つの25 μL PCR反応を設定し、標的部位の体細胞変異を同定します(表1)。
  7. 幅約0.625 cmのウェルを作成するコームを使用して、2.5%アガロース/0.5 μg/mLの臭化エチジウム/TBEゲルをキャストします。この幅の広いコームにより、ゲノム配列のサイズ変化を検出する際の分解能が向上します。ゲルが固まったら、TBEランニングバッファーを含む電気泳動チャンバーに入れます。
  8. 5 μLの6xローディング色素をPCR産物に加え、この混合物25 μLをゲルにロードします。注入されたサンプルと対照サンプルがゲルの同じ列で実行されていることを確認してください。すべてのサンプルをロードしたら、TBEランニングバッファー1 Lあたり5 μLの臭化エチジウムをゲルボックスの正端に追加します。
  9. DNAバンドが解消するか、DNAがレーンの端に近づくまで、ゲルを120 Vで実行します。Cas9が標的部位にINDELを作成した場合、通常、注入されたサンプルでは塗抹標本が観察されますが、対照では観察されません。
  10. 4つのガイドRNAを注入した胚の4つのガイド部位のうち少なくとも3つに塗抹標本が観察された場合は、注入された兄弟胚を成長させます。
  11. 注入されたサンプルに必要な数のガイド部位に塗抹標本が含まれていない場合は常に、機能しなかったガイドRNAを置き換える新しいガイドRNAを設計し、機能したものと新しく設計されたものを含むガイドRNAの新しいプールを作成します。上記のように、体細胞 INDEL の新しいプールを挿入してテストします。

5. 母体クリスパント胚における母性効果表現型の同定

注:注射されたF0メスが性的成熟に達すると、生殖細胞は母親のクリスパントと野生型の胚の混合物を生成する可能性があります。この混合物は受精と発生のタイミングのための内部制御を可能にしますが、F0メスからのクラッチに母体のクリスパント胚のみが含まれている場合、外部コントロールとして野生型のインクロスを設定することは依然として有益です。

  1. 実験の前日の午後、野生型の雄に対してF0注射された雌を設置し、標準的なゼブラフィッシュの交配ボックスで野生型の交配をコントロールしました。オスとメスの両方の魚を同じタンクに入れますが、交配ボックスの仕切りで分離するか、メスを産卵インサートに入れます。
  2. 実験の朝に、たとえば、交配ボックスの仕切りを取り外すか、オスをメスと同じ産卵インサートに入れるなどして、オスとメスが交尾を開始できるようにします。
  3. 産卵インサートを新鮮なシステム水を含む新しい交配タンクの底に移動し、個々のF0メスを識別するタグでタンクにラベルを付けて、10分ごとに胚を収集します。古い交配タンクを取り、茶こしを通して水を注ぎ、1人の個々の10分間クラッチから胚を収集します。
  4. 10分間クラッチ1個で胚をストレーナーに集めたら、E3培地1個を入れたペトリ皿に移します。ペトリ皿に収集時間と魚の情報でラベルを付けます。
  5. 透過光源を備えた解剖顕微鏡下で、最初の6〜8時間は毎時、次の5日間は毎日発生中の胚を観察します。
  6. 潜在的な母体のクリスパント胚を、時間的に一致した野生型対照と比較した発生の全体的な形態学的変化によって特定する29。
  7. 潜在的な母体のクリスパント胚を、1x E3培地を含むペトリ皿に移し、24 hpfの形態学的表現型と受精後5日目の生存率(水泳膀胱の膨張など)をアッセイします。

6.母体のクリスパント一倍体における対立遺伝子の配列決定

注:母体のクリスパント一倍体には、標的遺伝子座に単一の対立遺伝子が含まれているため、サンガーシーケンシングを介して標的遺伝子のINDELを同定できます。母体のクリスパント一倍体胚は、次世代シーケンシングアッセイを使用して分析することもできます。母体のクリスパント表現型を示す胚は、4つの標的部位の少なくとも1つに病変を有することが予想される(考察を参照)。

  1. 実験前の午後、野生型の雄と交配した母体のクリスパント胚を産生することが知られているF0雌の交尾ペアを設置した。交配ボックスディバイダーを使用して野生型のオスをメスから物理的に分離しておくか、メスを産卵インサートに入れます。
  2. 実験の朝に、物理的な仕切りを取り除くか、オスとメスの両方を産卵インサート内に入れて交配を開始します。産卵の最初の兆候で、男性とF0女性を分離することによって繁殖を中断します。分離されたF0メスをそれぞれ個別の交配ボックスに保管してください。
  3. 前述のように、ハンク溶液100μLごとに1人の野生型オスからの精巣を使用してUV処理された精子溶液を調製し(表2)、1人のメスから押し出された卵子を受精させるのに十分である31。
  4. 事前に選択されたF0雌から成熟卵子を手動で押し出し、UV処理された精子31を使用して体外受精(IVF)を行う。
  5. 体 外 受精後、母体のクリスパント表現型が観察されるまで一倍体胚を発達させ、それらの胚を別のペトリ皿に入れます。
  6. 母体のクリスパント一倍体胚が特定されたら、受精後少なくとも6時間発達させます。
  7. 少なくとも10個の母体のクリスパント一倍体胚からゲノムDNAを抽出するには、単一の一倍体胚をPCRストリップチューブの個々のウェルに入れ、ウェルから過剰なE3培地を除去し、50 μLの50 mM NaOHを追加します。
  8. 胚を95°Cで20分間インキュベートします。次に、サンプルを4°Cまで冷却し、5 μLの1 M Tris HCL(pH 7.5)を加え、5〜10秒間ボルテックスします。抽出したDNAは、-20°Cで最大6ヶ月間保存できます。
  9. どのガイドサイトにINDELが含まれているかを特定するには、シーケンシングプライマーを設計して、4つのCRISPR-Cas9ターゲットサイトすべてを含むDNAフラグメントを増幅します。これらのシーケンシングプライマーは、複数のガイド部位にまたがるINDELの同定を可能にします。
  10. 調製したゲノムDNAとシーケンシングプライマー5 μLを使用して、胚ごとに2つの25 μLのPCR反応を設定します。
  11. PCRが終了したら、DNAクリーンアップおよび濃縮キットを使用して2つのサンプルを精製および濃縮します( 材料の表を参照)。次に、フォワードシーケンシングプライマーとリバースシーケンシングプライマーの両方を使用して、DNAフラグメントをサンガーシーケンシングにサブミットします。
  12. 一倍体母体クリスパントフラグメントが配列決定された後、それを野生型配列にアラインメントし、配列アラインメントプログラムを使用して標的部位のINDELを同定します。

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

結果

このプロトコルに記載されている実験的アプローチにより、母性効果表現型を迅速かつ資源効率の高い方法で同定することができます(図1)。

母体のクリスパントの生成:
単一の母体効果遺伝子候補を標的とする4つのガイドRNAを設計する場合、ガイドRNAがDNAに結合する場所に特別な配慮が必要です。一般に、それらはすべて、最初の予...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

ディスカッション

この原稿で提示されたプロトコルは、順方向および逆方向の遺伝学的手法の両方に必要な複数世代ではなく、単一世代における母性効果表現型の同定および一次分子特性評価を可能にする。現在、多くの母体発現遺伝子の役割は不明です。この知識の欠如は、母性効果遺伝子を特定する際に表現型を視覚化するために必要な余分な生成に一部起因しています。過去には、ゼブラフィッシュの?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

開示事項

著者は、競合する金銭的利益を宣言していません。

謝辞

過去および現在のペレグリ実験動物飼育スタッフの方々に、水生施設の世話をしてくれたことに感謝します。また、ライアン・トレヴェナとダイアン・ハンソンによる原稿に対するコメントと洞察にも感謝しています。資金はNIH助成金からFPに提供されました(GM065303)

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
1 M Tris-HCl (pH 8.4)Invirogen15568025For PCR mix
1.5 mL Eppendorf TubesAny Maker
10 mM dNTPsThermo Fischer Scientific18427013Synthesis of gRNA
100 BP ladderAny MakerFor gel electrophoresis
100% RNAse free ethanolAny Maker
100% RNAse free ethanolAny Maker
100ml BeakerAny MakerFor IVF
5 M Ammonium AccetateThermo Fischer ScientificFound in the MEGAshortscript T7 Transcription KitSynthesis of gRNA
70% EthanolSynthesis of gRNA (70 mL of ethanol + 30 mL of  nuclease free water)
Borosil 1.0 mm OD x 0.5 mm IDFHC INC27-30-1for Microinjection
Bulk Pharma Sodium Bicarbonate 35 poundsBulk Reef Supply255Fish supplies
CaCl2MiliporeSigmaC7902
Cas9 Protein with NLSPNABioCP01
ChopChophttps://chopchop.cbu.uib.no/
Constant oligonucleotideIntegrated DNA Technologies (IDT)AAAAGCACCGACTCGGTGCCAC
TTTTTCAAGTTGATAACGGACTA
GCCTTATTTTAACTTGCTATTTC
TAGCTCTAAAAC
Depression Glass PlateThermo Fischer Scientific13-748BFor IVF
Dissecting ForcepsDumontSSFor IVF
Dissecting ScissorsFine Science Tools14091-09For IVF
Dissecting Steroscope( with transmitted light source)Any MakerFor IVF
DNA Clean & Concentrator -5Zymo ResearchD4014Synthesis of gRNA
DNA Gel Loading Dye (6x)Any MakerFor gel electrophoresis
EconoTaq DNA PolymeraseLucigen30032-1For PCR mix
Electropheresis Power SupplyAny MakerFor gel electrophoresis
Ensemblehttps://useast.ensembl.org/index.html
Eppendorf Femtotips Microloader Tips for Femtojet MicroinjectorThermo Fischer ScientificE5242956003for Microinjection
Ethanol (200 proof, nuclease-free)Any Maker
FemtoJet 4iEppendorf5252000021for Microinjection
Fish NetAny MakerFish supplies
Frozen Brine ShrimpBrine Shrimp DirectFish supplies
General All Purpose AgaroseAny MakerFor gel electrophoresis
Gene-Specific oligonucleotideIntegrated DNA Technologies (IDT)TAATACGACTCACTATA- N20 -GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAG
GlovesAny Maker
Ice BucketAny Maker
Instant Ocean saltAny MakerFish supplies
Invitrogen UltraPure Ethidium Bromide, 10 mg/mLThermo Fischer Scientific15-585-011
KClMiliporeSigmaP5405
KH2PO4MiliporeSigma7778-77-0
KimwipesThermo Fischer Scientific06-666
Male & Female zebrafish
MEGAshortscript T7 Transcription KitThermo Fischer ScientificAM1354Synthesis of gRNA
Methylene BlueThermo Fischer ScientificAC414240250For E3
MgCl2MiliporeSigma7791-18-6For PCR mix
MgSO2·7H2OMiliporeSigmaM2773
Microinjection plastic moldWorld Precision InstrumentsZ-Moldsfor Microinjection
MicromanipulatorAny Makerfor Microinjection
MicropipetersAny Maker
Micropipette PullerSutterP-87for Microinjection
Micropipetter tips with filters (all sizes)Any Maker
Micropippetter tips without filters ( all sizes)Any Maker
MicrowaveAny Maker
Mineral OilMiliporeSigmam5904-5mlfor Microinjection
MS-222 ( Tricaine-D)Any MakerFDA approved
Na2HPO4MiliporeSigmaS3264
NaClMiliporeSigmaS5886
NaHC03MiliporeSigmaS5761
NanodropAny Maker
NaOHMiliporeSigma567530
Nonstick, RNase-free Microfuge Tubes, 1.5 mLAmbionAM12450Synthesis of gRNA
nuclease-free waterAny Maker
Paper TowelAny Maker
Pastro PipettesAny Maker
PCR Strip TubesAny Maker
Petri Plates 100 mm diameterAny Maker
Phenol Red solutionMiliporeSigmaP0290for Microinjection
Plastic PestalsVWR47747-358For IVF
Plastic SpoonAny MakerFor IVF
Premium Grade Brine Shrimp EggsBrine Shrimp DirectFine Mesh
RNA Gel Loading Dyefound in MEGAshortscript T7 Transcription KitFor gel electrophoresis
RNAse AWAYThermo Fischer Scientific21-402-178
ScaleAny Maker
SharpieAny Maker
 SpatulaAny Maker
Sterile H2OAny MakerFor PCR mix
T4 DNA PolymeraseNEBM0203Synthesis of gRNA
TapeAny Maker
TBE (Tris-Borate-EDTA) 10xAny MakerFor gel electrophoresis
Tea StainerAmazonIMU-71133WFish supplies
Thermo Scientific Owl 12-Tooth Comb, 1.0/1.5 mm Thick, Double Sided for B2Thermo Fischer ScientificB2-12For gel electrophoresis
Thermo Scientific Owl EasyCast B2 Mini Gel Electrophoresis SystemsThermo Fischer Scientific09-528-110BFor gel electrophoresis
ThermocyclerAny Maker
ThermocyclerAny Maker
TransilluminatorAny Maker
UV lampUVPModel XX-15 (Cat NO. UVP18006201)For IVF
UV safety glassesAny MakerFor IVF
Wash BottleThermo Fischer ScientificS39015Fish supplies
Zebrafish mating boxesAqua SchwarzSpawningBox1Fish supplies
1.5ml Eppendorf TubesFisher Scientific05-402-11
10 Molar dNTPsThermo Fischer Scientific18427013
100 BP ladderThermo Fischer Scientific15628019
100% RNAse free ethanolany maker
5m Ammonium AccetateThermo Fischer Scientific
70% Ethanol70ml ethanol and 30 ml of nuclease free water
Accessories for Horizontal Gel BoxFisher Scientific0.625 mm
Agaroseany maker
CaCl2Sigma10043-52-4
CaCl2, dihydrateSigma10035-04-8E3 Medium
Capillary TubingCole-ParmerUX-03010-68for injection needles
Cas9 ProteinThermo Fischer ScientificA36496
ChopChophttps://chopchop.cbu.uib.no/
Computerany maker
Dissecting Forceptsany maker
Dissecting Microscopeany maker
Dissecting Scissorsany maker
DNA Clean & Concentrator -5Zymo ResearchD4014
DNA Gel Loading Dye (6X)Thermo Fischer ScientificR0611
EconoTaq DNA PolymeraseLucigen30032-1
Ensemblehttps://useast.ensembl.org/index.html
Eppendorf Microloader PipetteTipsFischer Scientific1028965120 microliters
Ethanol (200 proof, nuclease-free)any maker
Ethidium BromideThermo Fischer Scientific15585011
Fish Netany makerfine mesh
Frozen Brine ShrimpLiveAquariaCD-12018fish food
Gel Comb (0.625mm)any maker
Gel Electropheresis Systemany maker
Gene-Specific oligonucleotideIntegrated DNA Technologies (IDT)
Glass Capilary NeedleGrainger21TZ99https://www.grainger.com/product/21TZ99?ef_id=Cj0KCQjw8Ia
GBhCHARIsAGIRRYpqsyA3-LUXbpZVq7thnRbroBqQTbrZ_a88
VVcI964LtOC6SFLz4ZYaAhZzEAL
w_wcB:G:s&s_kwcid=AL!2966!3!
264955916096!!!g!438976
780705!&gucid=N:N:PS:Paid
:GGL:CSM-2295:4P7A1P:20501
231&gclid=Cj0KCQjw8IaGBh
CHARIsAGIRRYpqsyA3-LUXbp
ZVq7thnRbroBqQTbrZ_a88VVcI
964LtOC6SFLz4ZYaAhZzEALw
_wcB&gclsrc=aw.ds
Glass Dishesany maker
Glovesany maker
Hank's Final Working SolutionCombine 9.9 ml of Hank's Premix with 0.1 ml HS Stock #6
Hank's Premixcombine the following in order: (1) 10.0 ml HS #1, (2) 1.0 ml HS#2, (3) 1.0 ml HS#4, (4) 86 ml ddH2O, (5) 1.0 ml HS#5. Store all HS Solotions at 4C
Hanks Solution
Hank's Solutionhttps://www.jove.com/pdf-materials/51708/jove-materials-51708-production-of-haploid-zebrafish-embryos-by-in-vitro-fertilization
Hank's Stock Solution #18.0 g NaCl, 0.4 g KCl in 100 ml ddH2O
Hank's Stock Solution #20.358 g Na2HPO4 anhydrous; 0.60 g K2H2PO4 in 100 ml ddH2O
Hank's Stock Solution #40.72 g CaCl2 in 50 ml ddH2O
Hank's Stock Solution #51.23 g MgSO47H2O in 50 ml ddH20
Hank's Stock Solution #60.35g NaHCO3 in 10.0 ml ddH20; make fresh day of use
HClSigma7647-01-0
Ice Bucketany maker
Instant Ocean saltany makerfor fish water
In-Vitro Transcription Kit Mega Short ScriptThermo Fischer ScientificAM1354
Invitrogen™ UltraPure™ DNase/RNase-Free Distilled WaterFisher Scientific10-977-023
KClSigma7447-40-7E3 Medium
KH2PO4Sigma7778-77-0
KimwipesFisher Scientific06-666
Male and Female zebrafish
Mega Short Script T7 Transciption KitThermo Fischer ScientificAM1354
methylene blueFisher ScientificAC414240250E3 Medium
MgSO2-7H2OSigmaM2773
Microimicromanipulator
Microinjection plastic moldWorld Precision InstrumentsZ-Molds
Microinjector
Microneedle Slide
Micropipeter (1-10) with tipsany makerneed filtered p10 tips
Micropipetter (20-200) with tipsany maker
Micropippetter (100-1000) with tipsany maker
Microplastic slide
Microwaveany maker
MiliQ Waterany maker
mineral oilsigma-aldrichm5904-5ml
Na2HPO4Sigma
NaClSigmaS9888
NaHC02Sigma223441
Nanodrop
NaOHSigma567530
Narrow Spatulaany maker
Needle PullerSutterP-97
Paper Towelany maker
Pastro PipettesFisher Scientific13-678-20A
PCR primer flanking guide siteIntegrated DNA Technologies (IDT)
PCR primers flanking guide RNA cut siteIntegrated DNA Technologies (IDT)Standard desalted
PCR Strip TubesThermo Fischer ScientificAB0771W
Petri DishesFisher ScientificFB087571410 cm diameter 100mm x 15mm
Phenol RedFisher ScienceS25464https://www.fishersci.com/shop/products/phenol-red-indicator-solution-0-02-w-v-2/S25464
Pipette Tipsany maker10ul, 200ul and 1000ul tips
Plastic PestalsFisher Scientific12-141-364
Plastic Spoonany maker
Primer Guide SiteIntegrated DNA Technologies (IDT)
Razor BladeUlineH-595B
RNA gel Loading Dyein megashort script kit(in vitro transciption kit)
RNAse awayFisher21-402-178
RNAse free polypropylene microcentrifuge tubesThermo Fischer ScientificAM12400https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/AM12400#/AM12400
RNAse free waterFisher Scientific10-977-023
Scaleany maker
Sharpieany maker
Sodium bicarbonate (cell culture tested)SigmaS5761fish water
Sodium Bromide SolotionSigmaE1510
Software for sanger sequencing Analysis
Spectrophotometer
Sterlie H2Oany brand
T4 DNA PolymeraseNEBM0203Shttps://www.neb.com/products/m0203-t4-dna-polymerase#Product%20Information
Tapeany brand
TBE (Tris-Borate-EDTA) 10XThermo Fischer ScientificB52https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/B52#/B52
Tea StaineramazonIMU-71133Wavaible in most kitchen stores
Thermocycler
Transfer PipetteUlineS-24320
Transilluminator
Tricainefisher scientificNC0872873
Tris HCl 7.5Thermo Fischer Scientific15567027
Universal PrimerIntegrated DNA Technologies (IDT)AAAAGCACCGACTCGGTGCCAC
TTTTTCAAGTTGATAACGGACTAG
CCTTATTTTAACTTGCTATTTCTA
GCTCTAAAAC
UV lampUVP
UV safety glassesany maker
Wash Bottlefisher scientificS39015
Zebrafish mating boxesany maker
PCR Buffer RecipeAdd 171.12mL sterile H20; 0.393 mL 1M MgCl2; 2.616mL 1M MgCl2; 2.618 mL 1M Tris-HCl (pH 8.4) 13.092mL 1M KCl; 0.262 mL 1% Gelatin. Autoclave for 20 minutes then chill the solotion on ice. Next add 3.468 mL 100mg/mL BSA; 0.262 mL dATP (100mM), 0.262mL dCTP (100mM); 0.262 mL dGTP (100mM);  0.262 mL dTTP (100mL). Alliquote into sterile eppendorf tubes

参考文献

  1. Pelegri, F. Maternal factors in zebrafish development. Developmental Dynamics. 228 (3), 535-554 (2003).
  2. Campbell, P. D., Heim, A. E., Smith, M. Z., Marlow, F. L. Kinesin-1 interacts with Bucky ball to form germ cells and is required to pattern the zebrafish body axis. Development. 142 (17), Cambridge, England. 2996-3008 (2015).
  3. Eno, C., Solanki, B., Pelegri, F. aura (mid1ip1l) regulates the cytoskeleton at the zebrafish egg-to-embryo transition. Development. 143 (9), Cambridge, England. 1585-1599 (2016).
  4. He, W. -X., et al. Oocyte-specific maternal Slbp2 is required for replication-dependent histone storage and early nuclear cleavage in zebrafish oogenesis and embryogenesis. RNA. 24 (12), RNA. New York, N.Y. 1738-1748 (2018).
  5. Burger, A., et al. Maximizing mutagenesis with solubilized CRISPR-Cas9 ribonucleoprotein complexes. Development. 143 (11), Cambridge, England. 2025-2037 (2016).
  6. Jao, L. -E., Wente, S. R., Chen, W. Efficient multiplex biallelic zebrafish genome editing using a CRISPR nuclease system. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (34), 13904-13909 (2013).
  7. Shah, A. N., Davey, C. F., Whitebirch, A. C., Miller, A. C., Moens, C. B. Rapid reverse genetic screening using CRISPR in zebrafish. Nature Methods. 12 (6), 535-540 (2015).
  8. Shankaran, S. S., Dahlem, T. J., Bisgrove, B. W., Yost, H. J., Tristani-Firouzi, M. CRISPR/Cas9-directed gene editing for the generation of loss-of-function mutants in high-throughput zebrafish F0 screens. Current Protocols in Molecular Biology. 119 (1), 1-22 (2017).
  9. Trubiroha, A., et al. A Rapid CRISPR/Cas-based mutagenesis assay in zebrafish for identification of genes involved in thyroid morphogenesis and function. Scientific Reports. 8 (1), 5647(2018).
  10. Wu, R. S., Lam, I. I., Clay, H., Duong, D. N., Deo, R. C., Coughlin, S. R. A Rapid method for directed gene knockout for screening in G0 zebrafish. Developmental Cell. 46 (1), 112-125 (2018).
  11. Moravec, C. E., Voit, G. C., Otterlee, J., Pelegri, F. Identification of maternal-effect genes in zebrafish using maternal crispants. Development. 148 (19), Cambridge, England. 199536(2021).
  12. Braat, A. K., Zandbergen, T., van de Water, S., Goos, H. J., Zivkovic, D. Characterization of zebrafish primordial germ cells: morphology and early distribution of vasa RNA. Developmental Dynamics: An Official Publication of the American Association of Anatomists. 216 (2), 153-167 (1999).
  13. Eno, C., Hansen, C. L., Pelegri, F. Aggregation, segregation, and dispersal of homotypic germ plasm RNPs in the early zebrafish embryo. Developmental Dynamics. 248 (4), 306-318 (2019).
  14. Knaut, H., Steinbeisser, H., Schwarz, H., Nüsslein-Volhard, C. An evolutionary conserved region in the vasa 3'UTR targets RNA translation to the germ cells in the zebrafish. Current biology: CB. 12 (6), 454-466 (2002).
  15. Yoon, C., Kawakami, K., Hopkins, N. Zebrafish vasa homologue RNA is localized to the cleavage planes of 2- and 4-cell-stage embryos and is expressed in the primordial germ cells. Development. 124 (16), Cambridge, England. 3157-3165 (1997).
  16. Gagnon, J. A., et al. Efficient mutagenesis by Cas9 protein-mediated oligonucleotide insertion and large-scale assessment of single-guide RNAs. PLoS ONE. 9 (5), 98186(2014).
  17. Labun, K., Montague, T. G., Gagnon, J. A., Thyme, S. B., Valen, E. CHOPCHOP v2: a web tool for the next generation of CRISPR genome engineering. Nucleic Acids Research. 44, 272-276 (2016).
  18. Labun, K., Montague, T. G., Krause, M., Torres Cleuren, Y. N., Tjeldnes, H., Valen, E. CHOPCHOP v3: expanding the CRISPR web toolbox beyond genome editing. Nucleic Acids Research. 47, 171-174 (2019).
  19. Montague, T. G., Cruz, J. M., Gagnon, J. A., Church, G. M., Valen, E. CHOPCHOP: a CRISPR/Cas9 and TALEN web tool for genome editing. Nucleic Acids Research. 42, 401-407 (2014).
  20. Moravec, C. E., Pelegri, F. J. An accessible protocol for the generation of CRISPR-Cas9 knockouts using INDELs in zebrafish. Methods in Molecular Biology. 1920, Clifton, N.J. 377-392 (2019).
  21. White, R. J., et al. A high-resolution mRNA expression time course of embryonic development in zebrafish. eLife. 6, 30860(2017).
  22. Aanes, H., et al. Zebrafish mRNA sequencing deciphers novelties in transcriptome dynamics during maternal to zygotic transition. Genome Research. 21 (8), 1328-1338 (2011).
  23. Aken, B. L., et al. The Ensembl gene annotation system. Database: The Journal of Biological Databases and Curation. 2016, (2016).
  24. Sorlien, E. L., Witucki, M. A., Ogas, J. Efficient production and identification of CRISPR/Cas9-generated gene knockouts in the model system Danio rerio. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (138), e56969(2018).
  25. Kotani, H., Taimatsu, K., Ohga, R., Ota, S., Kawahara, A. efficient multiple genome modifications induced by the crRNAs, tracrRNA and Cas9 protein complex in zebrafish. PloS One. 10 (5), 0128319(2015).
  26. Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (25), e1115(2009).
  27. Xu, Q. Microinjection into zebrafish embryos. Methods in Molecular Biology. 127, Clifton, N.J. 125-132 (1999).
  28. Biology Mouse,, Zebrafish,, Chick, JoVE. Biology: Mouse, Zebrafish, and Chick. Zebrafish Microinjection Techniques. JoVE Science Education Database. , Cambridge, MA. (2021).
  29. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Developmental Dynamics: An Official Publication of the American Association of Anatomists. 203 (3), 253-310 (1995).
  30. D'Agostino, Y., et al. A rapid and cheap methodology for CRISPR/Cas9 zebrafish mutant screening. Molecular Biotechnology. 58 (1), 73-78 (2016).
  31. Baars, D. L., Takle, K. A., Heier, J., Pelegri, F. Ploidy manipulation of zebrafish embryos with Heat Shock 2 treatment. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (118), e54492(2016).
  32. Nair, S., Lindeman, R. E., Pelegri, F. In vitro oocyte culture-based manipulation of zebrafish maternal genes. Developmental Dynamics: An Official Publication of the American Association of Anatomists. 242 (1), 44-52 (2013).
  33. Kushawah, G., et al. CRISPR-Cas13d induces efficient mRNA knockdown in animal embryos. Developmental Cell. 54 (6), 805-817 (2020).
  34. Kroeger, P. T., Poureetezadi, S. J., McKee, R., Jou, J., Miceli, R., Wingert, R. A. Production of haploid zebrafish embryos by in vitro fertilization. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (89), e51708(2014).
  35. Xiao, T., Roeser, T., Staub, W., Baier, H. A GFP-based genetic screen reveals mutations that disrupt the architecture of the zebrafish retinotectal projection. Development. 132 (13), Cambridge, England. 2955-2967 (2005).
  36. Riemer, S., Bontems, F., Krishnakumar, P., Gömann, J., Dosch, R. A functional Bucky ball-GFP transgene visualizes germ plasm in living zebrafish. Gene Expression Patterns: GEP. 18 (1-2), 44-52 (2015).
  37. Moreno-Mateos, M. A., et al. CRISPRscan: designing highly efficient sgRNAs for CRISPR-Cas9 targeting in vivo. Nature Methods. 12 (10), 982-988 (2015).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

転載および許可

このJoVE論文のテキスト又は図を再利用するための許可を申請します

許可を申請

さらに記事を探す

178 CRISPR Cas9

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

個人情報保護方針

利用規約

一般データ保護規則

お問い合わせ

図書館への推薦

JoVE ニュースレター

研究

教育

著者

図書館員

JoVEについて

Copyright © 2023 MyJoVE Corporation. All rights reserved